基因在大肠杆菌和酵母的高效表达

2．质粒DNA和病毒（噬菌体）DNA作为载体的主要特征是什么为外源基因提供进入受体细胞的转移能力；为外源基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力；为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力；具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点，具有合适的选择标记3．如何理解质粒的不相容性及其在DNA重组克隆过程中的运用意义质粒的不相容性：具有相同或相似复制子结构及调控模式的两种不同的质粒不能稳定存在于同一受体细胞内.4．列举表达质粒、穿梭质粒、探针质粒和cos质粒的不同用途表达质粒:在多克隆位点的上下游分别装有两套转录效率较高的启动子、合适的核糖体结合位点序列（SD）序列以及强有力的终止子结构，使得克隆在合适位点上的任何外源基因均能在受体细胞中高效表达。

穿梭质粒：质粒分子上含有两个亲缘关系不同的复制子以及相应的选择性标记，能在两种不同的受体细胞中复制并检测。

探针质粒：用来筛选克隆基因的表达调控元件。

通常含有报告基因，但缺少相应的调控序列（如启动子或终止子），只有含有启动子或终止子的调控序列被克隆进入载体后，报告基因才能别表达，表达量的大小直接反应了克隆进入的调控元件的强弱。

cos质粒：人工构建的含有λDNA的cos位点序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。

具有大的装载量，可以用于构建基因组文库。

5． II类限制性核酸内切酶的主要酶学特征是什么分子量较小的单体蛋白，双链识别和切割活性仅需Mg2+，识别位点为4-6个bp的回文序列，切割位点在识别序列中或靠近识别序列7． KLenow酶与大肠杆菌DNA聚合酶I在结构和功能上的主要区别DNA聚合酶I包括大片段(klenow片段)和小片段功能上：DNA聚合酶I比klenow酶多了5’→3’核酸外切酶活性，两者都具有5’→3’DNA聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性。

8．影响限制性核酸内切酶活性的主要因素有哪些？温度、盐度等物理因素，DNA样品纯度，DNA甲基化程度，限制性核酸内切酶的缓冲液性质，甘油和微量的金属离子会抑制限制性内切酶的活性9.如何理解粘性末端比平头末端更容易连接在退火条件下，粘性末端的连接为分子内反应，平头末端是分子间反应，平头末端的连接反应更加复杂，速度也慢。

大肠杆菌表达系统总结随着分子生物学和蛋白组学的迅猛发展，外源基因表达的遗传操作技术日趋成熟。

表达系统是外源基因表达的核心，常用表达系统一般为模式生物，包括真核表达系统和原核表达系统，其中真核系统包括了哺乳动物细胞表达系统、植物体表达系统、昆虫杆状病毒表达载体系统以及酵母表达系统，原核表达系统则主要为大肠杆菌表达系统。

大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统，也是最早进行研究的外源基因表达系统，其遗传学背景清晰、生长快、较易实现高密度培养、成本低、产量高，相较于其它表达系统具有难以比拟的优越性，是商业生产中应用最广泛的表达系统，取得了巨大的科研价值和经济效益。

大肠杆菌表达系统目前广泛应用于表达生产多种蛋白质/多肽类药物和生物化学产品，包括：重组人胰岛素、a2b型干扰素、兰尼单抗、紫色杆菌素和牡丹皮葡萄糖苷等。

据统计，1986-2018年由美国FDA和欧洲EMA批准上市的重组蛋白类药物中有26%来自于大肠杆菌。

与此同时，目前通过大肠杆菌表达的基因工程疫苗也进入市场或处于临床实验阶段，如戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、流感A型疫苗等。

常见的大肠杆菌表达系统有BL21系列、JM109系列、 W3110系列和K802系列等，其中大肠杆菌 BL21（ DE3）菌株是目前应用于重组蛋白表达研究最广泛的菌株之一，BL21（DE3）是由大肠杆菌B系列与K-12系列的衍生菌株通过 P1 转导等遗传突变获得的。

该类菌株通常为宿主蛋白酶缺失型，以保证外源蛋白在表达过程中不被降解，维持表达的稳定性。

大肠杆菌表达系统在商业生产中具有巨大的优越性和价值，但建立高效匹配的表达系统是实现商业价值的关键，包括宿主菌、外源基因、载体的选择与匹配。

宿主菌的选择是第一步，对表达活性和表达量影响很大，理想的宿主菌株是蛋白酶缺陷型，避免蛋白酶过多引起的产物不稳定，常见的蛋白酶缺陷型菌株为BL21系列菌株。

其次是外源基因，外源基因决定了是否可获得目的产物，原核基因可在大肠杆菌中直接表达，而真核基因不能再大肠杆菌中直接表达。

实验九外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和降解物阻遏作用【实验目的】1.了解外源基因在原核细胞中表达的基础理论。

2.掌握乳糖操纵子的调节机制和操作方法。

【实验原理】1.外源基因在原核细胞中的表达蛋白质通常是研究的最终目标，因此蛋白质的表达在基因工程中占有非常重要的地位。

常用的表达系统有原核细胞和真核细胞。

原核细胞表达系统主要使用大肠杆菌，真核细胞表达系统主要有酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞。

这些表达系统各有优缺点，应根据实验目的和实验室条件加以选择。

本实验主要介绍以大肠杆菌为代表的原核细胞表达系统。

（1）大肠杆菌表达系统的特点：生物学特性和遗传背景清楚，易于操作；已开发较多的克隆载体可供选择；容易获得大量的外源蛋白（外源蛋白可占细菌总蛋白50％左右）。

（2）蛋白质在原核细胞中的表达特点：原核细胞有其固有的RNA聚合酶，识别原核基因的启动子。

因此，在用原核细胞表达目的基因（无论是真核基因还是原核基因）时，一般应使用原核启动子。

原核基因的mRNA含有SD序列，启动蛋白质的合成。

而在真核基因上则缺乏该序列。

因此，一些商品化原核表达载体上设计有SD序列，以方便真核基因的表达。

原核细胞没有mRNA转录后加工的能力。

因此，在原核细胞中表达真核基因时，应使用cDNA 为目的基因。

原核细胞缺乏真核细胞对蛋白质进行翻译后加工的能力。

如表达产物的功能和蛋白质的糖基化、高级结构的正确折叠有关，必须慎重使用原核表达系统。

外源基因在大肠杆菌中高效表达时，表达产物往往在胞浆聚集，形成均一密度的包涵体。

包涵体的形成有利于保护表达产物不被胞内的蛋白酶降解，而且可以通过包涵体和胞内其他蛋白质密度不同来纯化包涵体蛋白。

但包涵体蛋白不具有该蛋白的所有生物学活性，往往需要通过变性复性的方法恢复活性，有时只能回复部分活性。

（3）蛋白质在原核细胞表达的调控启动子是转录水平调控的主要因素。

根据启动子起始mRNA合成效率的不同，可分为强、弱启动子，但是启动子的强弱是相对于不同基因而言的。

大肠杆菌酵母双杂交系统在基因互作研究中的应用生命科学研究中，基因互作是一个重要的研究领域，对了解基因的功能，及其在生物学中的重要性具有关键性意义。

近年来，越来越多的研究者运用酵母双杂交系统来研究基因互作。

其中，大肠杆菌酵母双杂交系统在基因互作研究中的应用越来越广泛。

1. 大肠杆菌酵母双杂交系统简介酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system）最早是由Fields与Song在1989年提出的，它是一种通过互补形成基因蛋白质互作物的方法。

大肠杆菌酵母双杂交系统（E. coli yeast two-hybrid system）是在酵母双杂交系统的基础上发展而来的。

它是通过将酵母双杂交系统中的酵母菌GAL4基因融合到大肠杆菌中的一种表达载体，并在其上构建相应的表达基因来实现的。

通过这种方法，大肠杆菌系能够鉴定出与目标蛋白质相互作用的蛋白质，并通过一些方法进行确认和鉴定。

2. 大肠杆菌酵母双杂交系统的优点（1）鉴定简单：大肠杆菌酵母双杂交系统只需要一些特定的基因表达载体，而不需要其他繁琐的操作，使其鉴定基因互作关系的过程变得更加简单。

（2）兼容成熟技术：大肠杆菌酵母双杂交系统是在酵母双杂交系统技术的基础上发展起来的，因此，其技术兼容性是酵母双杂交系统的一个很好的特点。

大肠杆菌酵母双杂交系统可以通过一定的改变来应对不同的研究需求。

（3）识别特异性高：大肠杆菌酵母双杂交系统的识别特异性非常高，能够鉴定出相互作用蛋白的特异性差异。

3. 大肠杆菌酵母双杂交系统的应用大肠杆菌酵母双杂交系统的主要应用是用于了解蛋白质之间的定向互作关系。

例如，研究一个特定的基因是如何参与一个生物功能的，就需要找到与之相关的其他基因，以了解它们之间是否发生了相互作用。

在研究基因调控的过程中也能使用它进行分析。

此外，大肠杆菌酵母双杂交系统还能运用于感染病毒的分析。

例如：通过大肠杆菌酵母双杂交系统的研究，有学者发现存在于整个病毒基因组中、并参与了其复制的两个产生蛋白质。

极端耐热木聚糖酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的高效表达杨梦华;李颖;关国华;江正强【期刊名称】《微生物学报》【年(卷),期】2005(45)2【摘要】以海栖热袍菌 (Thermotoga maritima) MSB8菌株基因组DNA为模板,通过PCR扩增出木聚糖酶(XylanaseB)基因, 将此基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-28a(+)和毕赤酵母表达载体pPIC9K,并分别转化大肠杆菌 BL21和毕赤酵母GS115.该木聚糖酶在大肠杆菌细胞中表达量高, 但不能分泌; 而在毕赤酵母细胞的表达产物可分泌至胞外.酶学性质分析表明,此酶分子量约为40kD,其最适反应温度为90℃, 最适反应pH值为6.65,且在碱性条件下稳定,具有重要的工业应用前景.【总页数】5页(P236-240)【作者】杨梦华;李颖;关国华;江正强【作者单位】中国农业大学生物学院,北京,100094;中国农业大学生物学院,北京,100094;中国农业大学生物学院,北京,100094;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京,100083【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.木聚糖酶Xyn43A基因在大肠杆菌及毕赤酵母中的表达比较 [J], 周晨妍;刘振华;王丹丹;李同彪;朱新术;王燕2.极端耐热木聚糖酶基因在大肠杆菌中的高效表达 [J], 薛业敏;毛忠贵;邵蔚蓝3.耐热木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质 [J], 张慧敏;李剑芳;邬敏辰;魏喜换;杨严俊4.链霉菌Streptomyces olivaceoviridis A1 木聚糖酶基因xynA在大肠杆菌及毕赤酵母中的高效表达 [J], 张红莲;姚斌;王亚茹;袁铁峥;张王照;伍宁丰;范云六5.短小芽孢杆菌β-1,4-木聚糖酶基因在大肠杆菌中的高效表达 [J], 刘伟丰;毛爱军;祝令香;乔宇;于巍;董志扬因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

基因工程原理复习题思考题5、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。

同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。

同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。

分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。

不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。

）6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？类型：DNA连接酶和RNA连接酶异同点：相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。

不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在转录中起作用。

7、试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。

（传说中的网上答案）1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。

2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。

这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。

3、足够多的载体和插入片段是最重要的。

4、平端的连接对于离子浓度很敏感5、尽可能缩小连接反应的体积6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？1）大肠杆菌DNA聚合酶2）Klenow fragment3）T7 DNA聚合酶4）T4 DNA聚合酶5）修饰过的T7 DNA聚合酶6）逆转录酶7）Taq DNA聚合酶第四章基因克隆的载体系统1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）；具有合适的筛选标记；具有较高的外源DNA的载装能力；具有多克隆位点（MCS）；具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。

3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。

这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。

木聚糖酶的研究进展陈洪洋;蔡俊;林建国;王常高;杜馨【摘要】木聚糖是仅次于纤维素的第二丰富的可再生资源,通过筛选出产木聚糖酶的菌株,利用基因工程技术,将木聚糖酶基因进行异源表达,提高木聚糖酶产量.该文综述了菌株产生的木聚糖酶酶学性质,并对酶学性质进行改善使木聚糖酶更符合应用的条件,同时研究木聚糖酶分离纯化的步骤,来提高木聚糖酶的酶活.文章重点介绍了木聚糖酶的产生菌和木聚糖酶在基因工程技术等方面研究进展,并对木聚糖酶的分离纯化方法做了简要地介绍.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2016(035)011【总页数】6页(P1-6)【关键词】木聚糖酶;基因工程;酶学性质;分离纯化【作者】陈洪洋;蔡俊;林建国;王常高;杜馨【作者单位】湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北武汉430068;湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北武汉430068;湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北武汉430068;湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北武汉430068;湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北武汉430068【正文语种】中文【中图分类】Q814.9木聚糖是植物半纤维素的主要组成部分，广泛存在于玉米芯、甘蔗渣、麦麸、秸秆等农作物废弃物中，由于木聚糖酶能够将木聚糖分解成不同长度的低聚木糖和木糖，该产物具有重要的经济价值，通过木聚糖酶将这些可利用资源充分利用，发挥其潜在的应用价值，木聚糖酶的研究也受到充分的重视。

现在木聚糖酶已广泛应用于造纸、食品、饲料和能源等领域，带来了很大的经济效益。

目前木聚糖酶的生产主要来源于微生物发酵，对发酵得到的木聚糖酶的酶学性质进行研究，以便了解该酶的应用范围，使木聚糖酶在工业应用中发挥其巨大的潜能，增加更多的经济效益，为各领域的发展做出更大的贡献。

蛋白质的高效表达和纯化技术蛋白质是细胞中最为基本的分子，不仅构成细胞的基本结构，也参与到细胞的代谢、信号转导等生命活动中。

因此，蛋白质的高效表达和纯化技术是生命科学研究的重要基础。

蛋白质的表达技术主要包括原核和真核表达系统。

原核表达系统包括大肠杆菌和酵母表达系统，这两种表达系统都具有高效的蛋白质表达能力，并且易于操作和大规模生产。

在酵母表达系统中，通常会将目的蛋白质基因插入到酵母表达载体中，然后通过转化酵母细胞实现表达。

大肠杆菌表达系统则是将目的蛋白质基因插入到大肠杆菌表达载体中，然后通过转化大肠杆菌细胞进行表达。

相比于酵母表达系统，大肠杆菌表达系统具有更高的表达速率，但表达的蛋白质常常是未折叠的形态，需要进一步的纯化和折叠过程。

真核表达系统则利用真核细胞本身的细胞器完成蛋白质的表达和折叠，这类表达系统可以用于表达大多数复杂的蛋白质。

例如，哺乳动物细胞表达系统（如CHO细胞和HEK293细胞）是利用哺乳动物细胞自身的蛋白合成机制进行表达的，这种表达系统通常会得到高质量的蛋白质，但生产成本相对较高。

对于高效的蛋白质表达来说，关键是基因的优化和载体的选择。

在基因的优化方面，通常会进行基因的序列优化、信号肽的选取、启动子的选择等操作，以提高蛋白质的表达量和纯度。

而载体的选择则需要根据具体的表达需求进行选择，例如对于大肠杆菌表达系统来说，常用的载体有pET系列载体和pBAD系列载体；对于酵母表达系统来说，常用的载体有pYES2和pGAPZ系列载体；对于哺乳动物细胞表达系统来说，常用的载体有pCDNA3.1和pEF系列载体。

在蛋白质的纯化方面，常用的方法有离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤等。

离子交换层析是利用离子交换树脂对带有带电的蛋白质进行分离，在这个过程中，可以通过改变洗脱缓冲液的pH或离子浓度来调节分离效果。

亲和层析则是通过利用蛋白质与其特异性配体之间的亲和性实现分离，例如亲和层析树脂中的金属离子会与带有多个组氨酸残基的蛋白质结合形成配位键，从而实现分离。

基因工程刘夫锋2019.11.27基因工程5 2 3 4 1 6789重组DNA 技术与基因工程的基本概念重组DNA技术与基因工程的基本原理重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因表达产物的分离纯化7.1酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征7 外源基因在酵母菌中的表达酵母菌的分类学特征酵母菌（Yeast ）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。

如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。

7.1 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征7 外源基因在酵母菌中的表达酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作相对简单能将外源基因表达产物分泌至培养基中具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA 认定为安全的基因工程受体系统，食品工业有数百年历史酵母菌是最简单的真核模式生物7.2 酵母菌的宿主系统7 外源基因在酵母菌中的表达7.2.2提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌7.2.3 抑制超糖基化作用的突变宿主菌7.2.4 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌7.2.1 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌7.2.1 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酵母属如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis ）毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris ）裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）汉逊酵母属如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha ）裂殖酵母属如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）如解脂耶氏酵母（耶氏酵母属Yarrowia lipolytica ）如腺嘌呤阿氏酵母（阿氏酵母属Arxula adeninivorans ）其中芽殖型酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽。

《基因工程》课程教学大纲课程名称：基因工程课程类别：专业主干课适用专业：生物技术考核方式：考试总学时、学分：32 学时 2 学分其中实验学时：0 学时一、课程教学目的通过对本门课程的学习，使学生掌握基因工程技术的基本原理、常用技术和工作思路，了解基因工程技术的应用及发展趋势，为进一步学习有关专业课及参加相关领域的生产和科研工作奠定基础。

二、课程教学要求本门课是以遗传学、生物化学、微生物学、细胞生物学、分子生物学等学科为基础的学科，要求学生有扎实的上述课程基础。

本课程的主要内容包括: 基因工程载体、基因工程的酶学基础、目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定、大肠杆菌基因工程、酵母菌基因工程、高等动物基因工程、高等植物基因工程等。

要求学生掌握基因工程的基本原理和常用方法与技术，了解该领域的研究动态与发展方向。

课程的基本内容随着本学科的发展而调整并限定其广度和深度，在保证达到一定培养规格的前提下，考虑学生的接受能力和学习负担，同时注意本课程和其它相关课程的相互联系与衔接，防止疏漏和不必要的重复。

三、先修课程生物化学、微生物学、遗传学、细胞生物学、分子生物学。

四、课程教学重、难点教学重点：基因工程载体、基因工程的酶学基础、目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定。

教学难点：目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定。

五、课程教学方法与教学手段以教师讲授为主，要求教师认真备课，熟悉本课程的基本内容以及该学科的最新发展趋势，以合适的形式进行教学，提倡采用多媒体作为辅助教学手段；学生可以通过阅读相关的英文资料了解本学科的研究状况与发展方向，也可以阅读一些感兴趣的参考资料，训练其针对所感兴趣的问题进行深入探讨的能力。

六、课程教学内容第一章概述（1学时）1．教学内容（1）基因工程的概念；（2）基因工程的发展和历史；（3）基因工程的研究意义。

2．重、难点提示（1）重点：基因工程的概念；（2）难点：基因工程的基因原理及在生物工程中的地位。

基因工程药物的生产原理及其应用第一篇：基因工程药物的生产原理及其应用基因工程药物的生产原理及其应用摘要：近年来，基因工程药物在目的基因制备、载体的构建、基因转移技术、宿主表达系统和生物反应发生器等方面取得了令人瞩目的成就。

本文简单介绍基因工程药物的生产原理及其重要应用。

关键词：基因工程药物生产原理应用随着基因研究的深入，人类已经可以生产出许多基因工程产品。

基因工程药物引入医药产业,由此引起了医药工业的重大变革,使得医药产业成为最活跃、发展最快的产业之一，同时大大提高了21世纪人类的整体健康状况。

基因工程药物又称生物技术药物是指利用基因工程技术研制和生产的药物，是根据人们的愿望设计的基因,在体外剪切组合,并和载体DNA 连接,然后将载体导入靶细胞(微生物、哺乳动物细胞或人体组织靶细胞),使目的基因在靶细胞中得到表达,最后将表达的目的蛋白质纯化及做成制剂,从而成为蛋白类药或疫苗。

主要种类有：胰岛素、单克隆抗体、荷尔蒙、干扰素、白细胞介素、组织型纤溶酶原激活因子、红细胞生成素、集落刺激因子。

生产原理基因工程制药技术分获取目标基因的上游技术和大量培养上游技术阶段。

上游技术实质就是基因工程技术。

下游技术则包括菌体培养，细胞破碎，大量培养以及分离纯化几个步骤。

1.1 基因工程制药的上游技术基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。

所谓基因工程是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。

它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达。

基因工程研究采用的技术方法很多，以下介绍常见基本两种：聚合酶链反应技和Sanger双脱氢链终止法。

《基因工程》习题集第一章基因工程概述1.什么是基因工程，基因工程的基本流程？2.基因工程诞生的条件与标志分别是什么？3.简述基因工程的发展简史。

4.基因工程有哪些主要应用？5.通过本章的学习，请举两个基因工程应用的具体例子并加以简单说明。

第二章基因工程的载体和工具酶1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件？2. 质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？3. 噬菌体载体有哪些？携带能力分别有多大？4. 什么是人工微小染色体？有哪些类型？5. 什么是穿梭载体？6. 表达载体应该具备什么条件？7. 限制性内切核酸酶的特点与使用注意事项有哪些？8. DNA聚合酶和Klenow大片段各有什么作用？9. DNA连接酶在什么情况下使用？如何将不同DNA分子末端进行连接？10. 碱性磷酸酶有什么作用？11. 末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用？12. 在基因工程研究和应用中，为什么必须使用载体来克隆外源DNA片段？13. 分析影响限制性内切核酸酶酶切的因素有哪些？14. 举例说明大肠杆菌DNA聚合酶Ι在基因工程中的应用。

15. 请描述用载体pUC18来克隆DNA片段的过程。

在这个克隆实验中，你怎样选择含有克隆片段的重组子？第三章基因工程的常规技术1. 琼脂糖凝胶电泳的原理是什么2. 琼脂糖凝胶电泳的影响因素有哪些？3. 探针有哪些类型？探针标记有哪些方法？4. 探针的间接标记有什么优点？什么是ABC荧光（显色酶）标记法？5. Southern杂交的基本原理、流程与主要目的分别是什么？6. Northern杂交的基本原理、流程与主要目的分别是什么？7. Western杂交的基本原理、流程与主要目的分别是什么？8. 菌落（嗜菌斑）原位杂交的基本原理、流程与主要目的分别是什么？9. 简述PCR技术的基本原理。

10. PCR反应体系的主要成分与主要程序是怎样的？11. 提高PCR反应特异性的因素有哪些？12. 什么是逆转录PCR？13. 什么是反向PCR?14. 什么是多重PCR？15. 什么是荧光定量PCR？16. 什么是基因芯片技术？17. DNA芯片有哪些主要的应用？18. 什么是蛋白质芯片？19. 什么是基因组文库？其构建方法是怎样的？20. 什么是cDNA文库？它的构建流程是什么？21. 构建cDNA文库需要用到哪些工具酶？22. 合成cDNA第二条链有哪些方法？23. 简述酵母双杂交系统的基本原理。