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第四章基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达前言基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。
基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物—即实现基因的高效表达。
基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。
第一节基因的表达系统与表达策略一、最佳的基因表达体系：⑴目的基因的表达产量高;⑵表达产物稳定;⑶生物活性高;⑷表达产物容易分离纯化。
二、宿主细胞的选择（一）适合目的基因表达的宿主细胞的要求:1、容易获得较高浓度的细胞；2、能利用易得廉价原料；3、不致病、不产生内毒素；4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；5、容易进行代谢调控；6、容易进行DNA重组技术操作；7、产物的产量、产率高，8、产物容易提取纯化。
（二）宿主细胞分为两大类：1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。
大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。
优越性：①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。
②有各类菌株和载体系列。
③目前以实现多种基因的高效表达。
表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。
④易培养，成本低。
缺点：①大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。
②因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。
③蛋白质不能糖基化。
产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。
④其内毒素很难除去。
酵母酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。
其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。
能外分泌，产物可糖基化。
已有不少真核基因成功表达。
三、根据表达蛋白用途选择基因的表达策略1.生物化学和分子生物学研究2.表达蛋白质用作抗原3.结构研究真核基因表达的特点●一条成熟的mRNA只能翻译成一条多肽，不存在象原核生物那样的多基因操纵子模式；●基因转录调节区很大，而且往往远离启动子达几百个甚至上千个碱基，它们并不直接影响RNA聚合酶与启动子区的结合，而是通过改变基因5’上游区DNA的构型来影响RNA聚合酶与启动子区的结合；●mRNA合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译工作，而且通常都有复杂的成熟和剪接过程；●基因的启动子区和原核基因差异很大，而且有增强子序列存在。
2．质粒DNA和病毒（噬菌体）DNA作为载体的主要特征是什么为外源基因提供进入受体细胞的转移能力；为外源基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力；为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力；具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点，具有合适的选择标记3．如何理解质粒的不相容性及其在DNA重组克隆过程中的运用意义质粒的不相容性：具有相同或相似复制子结构及调控模式的两种不同的质粒不能稳定存在于同一受体细胞内.4．列举表达质粒、穿梭质粒、探针质粒和cos质粒的不同用途表达质粒:在多克隆位点的上下游分别装有两套转录效率较高的启动子、合适的核糖体结合位点序列（SD）序列以及强有力的终止子结构，使得克隆在合适位点上的任何外源基因均能在受体细胞中高效表达。
穿梭质粒：质粒分子上含有两个亲缘关系不同的复制子以及相应的选择性标记，能在两种不同的受体细胞中复制并检测。
探针质粒：用来筛选克隆基因的表达调控元件。
通常含有报告基因，但缺少相应的调控序列（如启动子或终止子），只有含有启动子或终止子的调控序列被克隆进入载体后，报告基因才能别表达，表达量的大小直接反应了克隆进入的调控元件的强弱。
cos质粒：人工构建的含有λDNA的cos位点序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。
具有大的装载量，可以用于构建基因组文库。
5． II类限制性核酸内切酶的主要酶学特征是什么分子量较小的单体蛋白，双链识别和切割活性仅需Mg2+，识别位点为4-6个bp的回文序列，切割位点在识别序列中或靠近识别序列7． KLenow酶与大肠杆菌DNA聚合酶I在结构和功能上的主要区别DNA聚合酶I包括大片段(klenow片段)和小片段功能上：DNA聚合酶I比klenow酶多了5’→3’核酸外切酶活性，两者都具有5’→3’DNA聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性。
8．影响限制性核酸内切酶活性的主要因素有哪些？温度、盐度等物理因素，DNA样品纯度，DNA甲基化程度，限制性核酸内切酶的缓冲液性质，甘油和微量的金属离子会抑制限制性内切酶的活性9.如何理解粘性末端比平头末端更容易连接在退火条件下，粘性末端的连接为分子内反应，平头末端是分子间反应，平头末端的连接反应更加复杂，速度也慢。
极端耐热木聚糖酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的高效表达杨梦华;李颖;关国华;江正强【期刊名称】《微生物学报》【年(卷),期】2005(45)2【摘要】以海栖热袍菌 (Thermotoga maritima) MSB8菌株基因组DNA为模板,通过PCR扩增出木聚糖酶(XylanaseB)基因, 将此基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-28a(+)和毕赤酵母表达载体pPIC9K,并分别转化大肠杆菌 BL21和毕赤酵母GS115.该木聚糖酶在大肠杆菌细胞中表达量高, 但不能分泌; 而在毕赤酵母细胞的表达产物可分泌至胞外.酶学性质分析表明,此酶分子量约为40kD,其最适反应温度为90℃, 最适反应pH值为6.65,且在碱性条件下稳定,具有重要的工业应用前景.【总页数】5页(P236-240)【作者】杨梦华;李颖;关国华;江正强【作者单位】中国农业大学生物学院,北京,100094;中国农业大学生物学院,北京,100094;中国农业大学生物学院,北京,100094;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京,100083【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.木聚糖酶Xyn43A基因在大肠杆菌及毕赤酵母中的表达比较 [J], 周晨妍;刘振华;王丹丹;李同彪;朱新术;王燕2.极端耐热木聚糖酶基因在大肠杆菌中的高效表达 [J], 薛业敏;毛忠贵;邵蔚蓝3.耐热木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质 [J], 张慧敏;李剑芳;邬敏辰;魏喜换;杨严俊4.链霉菌Streptomyces olivaceoviridis A1 木聚糖酶基因xynA在大肠杆菌及毕赤酵母中的高效表达 [J], 张红莲;姚斌;王亚茹;袁铁峥;张王照;伍宁丰;范云六5.短小芽孢杆菌β-1,4-木聚糖酶基因在大肠杆菌中的高效表达 [J], 刘伟丰;毛爱军;祝令香;乔宇;于巍;董志扬因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
基因工程原理复习题思考题5、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。
同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。
同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。
分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。
不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。
）6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？类型：DNA连接酶和RNA连接酶异同点：相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。
不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在转录中起作用。
7、试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。
（传说中的网上答案）1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。
2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。
这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。
3、足够多的载体和插入片段是最重要的。
4、平端的连接对于离子浓度很敏感5、尽可能缩小连接反应的体积6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？1）大肠杆菌DNA聚合酶2）Klenow fragment3）T7 DNA聚合酶4）T4 DNA聚合酶5）修饰过的T7 DNA聚合酶6）逆转录酶7）Taq DNA聚合酶第四章基因克隆的载体系统1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）；具有合适的筛选标记；具有较高的外源DNA的载装能力；具有多克隆位点（MCS）；具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。
3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。
这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。
生物制药复习题（有答案）《生物技术制药》习题（课后作业）一、下列概念：⑴生物制药：⑵生物药物：包括生物技术药物，天然生化药物，微生物药物，海洋药物和生物制品。
(3)生物技术制药：采用现代生物技术,借助某些微生物、植物、动物生产医药品。
(4)生物技术药物：采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。
（5）现代生物技术：以现代生命科学为基础, 把生物体系与工程学技术有机结合在一起，按照预先的设计，定向地在不同水平上改造生物遗传性状或加工生物原料, 产生对人类有用的新产品(或达到某种目的)之综合性科学技术。
（6）基因表达：⒈转录：在RNA聚合酶的催化下以DNA为模板合成mRNA的过程。
2、翻译：以mRNA为模板,tRNA作为运载工具,将活化的氨基酸在核糖体上合成蛋白质的过程（7）质粒的分裂不稳定：基因工程菌分裂时产生一定比例不含质粒的子代菌的现象,即重组分子从受体细胞中逃逸。
（8）质粒的结构不稳定：DNA从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。
重组DNA分子某一区域发生变异，导致表观生物学功能的丧失；（9）显微注射：显微注射就是借助光学显微镜的放大作用，利用显微操作仪，直接把DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细胞或卵母细胞中，然后生产动物个体的技术。
经过显微注射DNA发育而成的动物中，有少数整合了被注射的DNA分子，成为转基因动物。
（10）悬浮细胞：（11）补料分批培养：是指分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法。
（12）连续培养行下去的一种培养方法。
（13）接触抑制：细胞在生长分裂时达到相互接触而停止分裂的现象,称为接触性抑制（14）单克隆抗体：由一个抗原决定簇刺激的、单一的B细胞和骨髓瘤细胞融合增殖后所产生的、高度均一的抗体。
（15）多克隆抗体：一种抗原具有多个抗原决定簇,每个抗原决定簇都能刺激一个B细胞产生一种抗体。
这样所获得的免疫血清是多种抗体的混和物。
《基因工程》习题集第一章基因工程概述1.什么是基因工程，基因工程的基本流程？2.基因工程诞生的条件与标志分别是什么？3.简述基因工程的发展简史。
4.基因工程有哪些主要应用？5.通过本章的学习，请举两个基因工程应用的具体例子并加以简单说明。
第二章基因工程的载体和工具酶1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件？2. 质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？3. 噬菌体载体有哪些？携带能力分别有多大？4. 什么是人工微小染色体？有哪些类型？5. 什么是穿梭载体？6. 表达载体应该具备什么条件？7. 限制性内切核酸酶的特点与使用注意事项有哪些？8. DNA聚合酶和Klenow大片段各有什么作用？9. DNA连接酶在什么情况下使用？如何将不同DNA分子末端进行连接？10. 碱性磷酸酶有什么作用？11. 末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用？12. 在基因工程研究和应用中，为什么必须使用载体来克隆外源DNA片段？13. 分析影响限制性内切核酸酶酶切的因素有哪些？14. 举例说明大肠杆菌DNA聚合酶Ι在基因工程中的应用。
15. 请描述用载体pUC18来克隆DNA片段的过程。
在这个克隆实验中，你怎样选择含有克隆片段的重组子？第三章基因工程的常规技术1. 琼脂糖凝胶电泳的原理是什么2. 琼脂糖凝胶电泳的影响因素有哪些？3. 探针有哪些类型？探针标记有哪些方法？4. 探针的间接标记有什么优点？什么是ABC荧光（显色酶）标记法？5. Southern杂交的基本原理、流程与主要目的分别是什么？6. Northern杂交的基本原理、流程与主要目的分别是什么？7. Western杂交的基本原理、流程与主要目的分别是什么？8. 菌落（嗜菌斑）原位杂交的基本原理、流程与主要目的分别是什么？9. 简述PCR技术的基本原理。
10. PCR反应体系的主要成分与主要程序是怎样的？11. 提高PCR反应特异性的因素有哪些？12. 什么是逆转录PCR？13. 什么是反向PCR?14. 什么是多重PCR？15. 什么是荧光定量PCR？16. 什么是基因芯片技术？17. DNA芯片有哪些主要的应用？18. 什么是蛋白质芯片？19. 什么是基因组文库？其构建方法是怎样的？20. 什么是cDNA文库？它的构建流程是什么？21. 构建cDNA文库需要用到哪些工具酶？22. 合成cDNA第二条链有哪些方法？23. 简述酵母双杂交系统的基本原理。
大肠杆菌和酵母类生物的基因组编辑近年来，基因组编辑技术迅速发展，被广泛应用于生物医学、农业、环境保护等领域。
其中大肠杆菌和酵母类生物的基因组编辑技术受到越来越多的关注，成为研究热点。
一、大肠杆菌基因组编辑技术大肠杆菌是一种常见的细菌，具有广泛的应用价值。
通过基因编辑技术，可以在大肠杆菌中增加、删除、替换特定的基因，进而改变其代谢通路、获得所需产物或者制备新药物等。
基因编辑技术的主要手段包括CRISPR/Cas9系统、TALEN系统、ZFN系统等，其中CRISPR/Cas9系统最为常用。
该系统借助RNA导向蛋白Cas9剪切DNA的特性，靶向编辑目标基因，实现精准的基因组编辑。
大肠杆菌基因组编辑技术的主要应用包括：1. 代谢工程。
利用基因组编辑技术调控代谢通路，可改变细菌的代谢产物，例如利用大肠杆菌菌株结合基因组编辑技术，生产出可溶性人类胰岛素。
此外，还可以通过基因组编辑技术提升大肠杆菌对废弃物或渣滓的生物降解能力，促进废物资源化利用。
2. 蛋白生产。
利用基因组编辑技术可以改变大肠杆菌的蛋白表达水平，从而提升蛋白的合成产量。
此外，还可以利用大肠杆菌高效、稳定的蛋白质表达系统，将外源基因导入大肠杆菌进行蛋白质工程研究。
3. 基因疗法。
基因组编辑技术可用于纠正生物体中的基因突变，治疗遗传性疾病。
例如，可以利用基因组编辑技术修复大肠杆菌中的缺陷基因，防止癌症等疾病的发生。
二、酵母类生物基因组编辑技术酵母类生物是常见的真核细胞，具有广泛的实用价值。
利用基因编辑技术控制酵母类生物基因表达，可生产出新型酵母菌株，进而制备生物材料、生产化学品，还可以促进生物剂量的研究等。
酵母类生物基因组编辑技术的主要应用包括：1. 生物材料生产。
酵母菌株具有广泛的生物材料生产应用。
通过基因组编辑技术可设计合成新的代谢途径，提高生物合成产物的效率。
例如，利用酵母细胞制备出使用情况更为广泛的高强度酒精及生物丁醇生产方式，实现较高内生LOGy。
基因工程复习题题型：名词解释（10个）30分；填空（每空1分） 20分；选择题（每题1分）10分；简答题（4个）20分；论述题（2个）20分。
第一章绪论1.名词解释：基因工程：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。
遗传工程广义：指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作，以改良品质或创造新品种。
包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程和基因工程等不同的技术层次。
狭义：基因工程。
克隆：无性(繁殖)系或纯系。
指由同个祖先经过无性繁殖方式得到的一群由遗传上同一的DNA分子、细胞或个体组成的特殊生命群体。
2．什么是基因克隆及基本要点?3.举例说明基因工程发展过程中的三个重大事件。
A) 限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）；B) 载体的使用；C) 1970年，逆转录酶及抗性标记的发现。
4.基因工程研究的主要内容是什么？基础研究：基因工程克隆载体的研究基因工程受体系统的研究目的基因的研究基因工程工具酶的研究基因工程新技术的研究应用研究：基因工程药物研究转基因动植物的研究在食品、化学、能源和环境保护等方面的应用研究第二章基因克隆的工具酶1.名词解释：限制性核酸内切酶：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
回文结构：双链DNA中的一段倒置重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成发夹结构。
同尾酶：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。
同裂酶：不同来源的限制酶可切割同一靶序列和具有相同的识别序列黏性末端：DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称为粘性末端。
平末端：DNA片段的末端是平齐的。
