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第四章基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达前言基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。
基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物—即实现基因的高效表达。
基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。
第一节基因的表达系统与表达策略一、最佳的基因表达体系：⑴目的基因的表达产量高;⑵表达产物稳定;⑶生物活性高;⑷表达产物容易分离纯化。
二、宿主细胞的选择（一）适合目的基因表达的宿主细胞的要求:1、容易获得较高浓度的细胞；2、能利用易得廉价原料；3、不致病、不产生内毒素；4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；5、容易进行代谢调控；6、容易进行DNA重组技术操作；7、产物的产量、产率高，8、产物容易提取纯化。
（二）宿主细胞分为两大类：1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。
大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。
优越性：①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。
②有各类菌株和载体系列。
③目前以实现多种基因的高效表达。
表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。
④易培养，成本低。
缺点：①大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。
②因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。
③蛋白质不能糖基化。
产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。
④其内毒素很难除去。
酵母酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。
其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。
能外分泌，产物可糖基化。
已有不少真核基因成功表达。
三、根据表达蛋白用途选择基因的表达策略1.生物化学和分子生物学研究2.表达蛋白质用作抗原3.结构研究真核基因表达的特点●一条成熟的mRNA只能翻译成一条多肽，不存在象原核生物那样的多基因操纵子模式；●基因转录调节区很大，而且往往远离启动子达几百个甚至上千个碱基，它们并不直接影响RNA聚合酶与启动子区的结合，而是通过改变基因5’上游区DNA的构型来影响RNA聚合酶与启动子区的结合；●mRNA合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译工作，而且通常都有复杂的成熟和剪接过程；●基因的启动子区和原核基因差异很大，而且有增强子序列存在。
2．质粒DNA和病毒（噬菌体）DNA作为载体的主要特征是什么为外源基因提供进入受体细胞的转移能力；为外源基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力；为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力；具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点，具有合适的选择标记3．如何理解质粒的不相容性及其在DNA重组克隆过程中的运用意义质粒的不相容性：具有相同或相似复制子结构及调控模式的两种不同的质粒不能稳定存在于同一受体细胞内.4．列举表达质粒、穿梭质粒、探针质粒和cos质粒的不同用途表达质粒:在多克隆位点的上下游分别装有两套转录效率较高的启动子、合适的核糖体结合位点序列（SD）序列以及强有力的终止子结构，使得克隆在合适位点上的任何外源基因均能在受体细胞中高效表达。
穿梭质粒：质粒分子上含有两个亲缘关系不同的复制子以及相应的选择性标记，能在两种不同的受体细胞中复制并检测。
探针质粒：用来筛选克隆基因的表达调控元件。
通常含有报告基因，但缺少相应的调控序列（如启动子或终止子），只有含有启动子或终止子的调控序列被克隆进入载体后，报告基因才能别表达，表达量的大小直接反应了克隆进入的调控元件的强弱。
cos质粒：人工构建的含有λDNA的cos位点序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。
具有大的装载量，可以用于构建基因组文库。
5． II类限制性核酸内切酶的主要酶学特征是什么分子量较小的单体蛋白，双链识别和切割活性仅需Mg2+，识别位点为4-6个bp的回文序列，切割位点在识别序列中或靠近识别序列7． KLenow酶与大肠杆菌DNA聚合酶I在结构和功能上的主要区别DNA聚合酶I包括大片段(klenow片段)和小片段功能上：DNA聚合酶I比klenow酶多了5’→3’核酸外切酶活性，两者都具有5’→3’DNA聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性。
8．影响限制性核酸内切酶活性的主要因素有哪些？温度、盐度等物理因素，DNA样品纯度，DNA甲基化程度，限制性核酸内切酶的缓冲液性质，甘油和微量的金属离子会抑制限制性内切酶的活性9.如何理解粘性末端比平头末端更容易连接在退火条件下，粘性末端的连接为分子内反应，平头末端是分子间反应，平头末端的连接反应更加复杂，速度也慢。
极端耐热木聚糖酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中的高效表达杨梦华;李颖;关国华;江正强【期刊名称】《微生物学报》【年(卷),期】2005(45)2【摘要】以海栖热袍菌 (Thermotoga maritima) MSB8菌株基因组DNA为模板,通过PCR扩增出木聚糖酶(XylanaseB)基因, 将此基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-28a(+)和毕赤酵母表达载体pPIC9K,并分别转化大肠杆菌 BL21和毕赤酵母GS115.该木聚糖酶在大肠杆菌细胞中表达量高, 但不能分泌; 而在毕赤酵母细胞的表达产物可分泌至胞外.酶学性质分析表明,此酶分子量约为40kD,其最适反应温度为90℃, 最适反应pH值为6.65,且在碱性条件下稳定,具有重要的工业应用前景.【总页数】5页(P236-240)【作者】杨梦华;李颖;关国华;江正强【作者单位】中国农业大学生物学院,北京,100094;中国农业大学生物学院,北京,100094;中国农业大学生物学院,北京,100094;中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京,100083【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.木聚糖酶Xyn43A基因在大肠杆菌及毕赤酵母中的表达比较 [J], 周晨妍;刘振华;王丹丹;李同彪;朱新术;王燕2.极端耐热木聚糖酶基因在大肠杆菌中的高效表达 [J], 薛业敏;毛忠贵;邵蔚蓝3.耐热木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质 [J], 张慧敏;李剑芳;邬敏辰;魏喜换;杨严俊4.链霉菌Streptomyces olivaceoviridis A1 木聚糖酶基因xynA在大肠杆菌及毕赤酵母中的高效表达 [J], 张红莲;姚斌;王亚茹;袁铁峥;张王照;伍宁丰;范云六5.短小芽孢杆菌β-1,4-木聚糖酶基因在大肠杆菌中的高效表达 [J], 刘伟丰;毛爱军;祝令香;乔宇;于巍;董志扬因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
基因工程原理复习题思考题5、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。
同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。
同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。
分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。
不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。
）6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？类型：DNA连接酶和RNA连接酶异同点：相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。
不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在转录中起作用。
7、试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。
（传说中的网上答案）1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。
2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。
这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。
3、足够多的载体和插入片段是最重要的。
4、平端的连接对于离子浓度很敏感5、尽可能缩小连接反应的体积6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？1）大肠杆菌DNA聚合酶2）Klenow fragment3）T7 DNA聚合酶4）T4 DNA聚合酶5）修饰过的T7 DNA聚合酶6）逆转录酶7）Taq DNA聚合酶第四章基因克隆的载体系统1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）；具有合适的筛选标记；具有较高的外源DNA的载装能力；具有多克隆位点（MCS）；具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。
3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。
这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。
