植物基因在大肠杆菌中的原核表达
通过大肠杆菌表达目的基因大量获得重组蛋白是一个方便快捷的方法。植物中克隆的目的基因被克隆到特异设计的质粒载体上，受噬菌体T7强启动子控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。
当需要表达蛋白时，在细菌培养基中加入IPTG来启动表达。不同载体在邻近克隆位点处具有编码不同的多肽“标签”的序列，在定位、检测或纯化目的蛋白时提供方便。
以pET-32a(+)为例，介绍将目的基因克隆进载体并进行表达获得重组蛋白的过程，从而熟悉根据自己的要求采用不同的载体进行原核表达的全过程。
1.准备工作（试剂配置和器材准备）
1)操作流程示意图
主要步骤操作
①制备pET-32a(+)载体用限制性酶消化，去磷酸化后胶纯化回收
②制备插入DNA PCR装入质粒后进行限制性消化，再回收
③插入片段克隆到pET-32a(+)载体插入片段与pET连接，转化
④转化表达宿主菌BL21 转化带有T7RNA聚合酶基因的菌株
⑤诱导表达目的蛋白 SDS-PAGE，Western 印迹、定量分析确定目的蛋白
⑥放大试验纯化目的蛋白放大试验，制备粗提物，亲和纯化，切除融合标签
2)配制生长培养基如LB，和100mM IPTG,50μg/ml 卡那霉素存储液。
3)宿主菌的保存。长期存放菌株和pET重组子应保存于甘油中。
4)感受态细胞的制备，参照其它试验手册。
2.操作步骤
[1] 制备载体
1）载体消化和胶纯化
3μg pET载体
3μl 10×限制性内切酶buffer
10-20U 两种酶（是否共用buffer; 酶体积不要超过反应体系的10%）
3μl 1mg/ml乙酰BSA（根据需要
补足水到30μl
2)37℃温浴2-4h
3)取3μl样品进行电泳检测消化反应进行的程度
4)消化完全后，加入0.05U小牛碱性磷酸酶，37℃ 30min
5)全部样品在1%琼脂糖胶上电泳，切带按照胶回收试剂盒说明回收目标片段。
6)-20℃保存备用。
[2]制备插入片段
限制性消化和胶纯化是制备插入片段的常规方法。一般先用PCR扩增带酶切位点的目标基因，克隆进T－载体，然后用与消化载体相同的内切酶进行消化和胶回收。但在PCR过程中，需要减少突变的发生，可采用高保真酶，尽量减少PCR循环次数，增加模板和引物的浓度。
[3]在pET32a载体中插入片段
连接反应
2μl 10×连接buffer
2-5μl 50ng/μl 预制的pET32a载体
1μl T4连接酶
5-7μl 预制目标基因插入片段
加水到20μl，枪头混匀，16℃反应2h－过夜
[4]转化
转化方法同T－载体转化大肠杆菌DH5α一样，既可转化BL21也可转化DH5α，若转化DH5α，需要重新抽提质粒，再转化BL21。筛选LB平板需含50μg/μl 卡那霉素。
[5]pET重组子鉴定
如果亚克隆成功，阳性菌落数远大于阴性菌落。检验转化子的方法很多，包括PCR、质粒抽提及酶切分析、测序，体外转录和翻译。
[6]DE3溶原菌的诱导表达
（1）、从新鲜的划线平板中挑取单克隆到50ml含50μg/μl 卡那霉素的液体培养基中，37℃培养至OD600为0.4-1。
（2）、培养基中加入100mMIPTG至终浓度为0.4mM（T7启动子）或1 mM（T7lac启动子），继续培养2-3小时。
（3）、将摇瓶置于冰上5min，5000g 4℃离心5min收集菌体。
（4）、重悬细胞于0.25倍体积预冷的20mMTris-HCl （pH8.0）中，离心。
（5）、除去上清，菌体保存于-70℃或继续纯化。
[7]SDS-PAGE进行目标蛋白质分析
（1）、机械破碎细胞。一般用弗氏压碎法或超声波处理。
（2）、裂解液14000g离心10min，分离可溶和不溶部分。
（3）100μl可溶上清中加入100μl 4×SDS上样buffer和水。85℃迅速加热3min使蛋白变性，然后上样进行SDS-PAGE分析，观察蛋白表达。
（4）若目标蛋白在不溶部分中，需进行包涵体纯化。750μl20mMTris-HCl,pH7.5重悬沉淀，离心10000g5min,除去上清重复洗涤。然后1.5ml 1%SDS上样buffer中重悬沉淀，重复（3）的步骤进行SDS-PAGE分析。
3.总结（注意事项）
(1)所有操作尽量在冰上操作，以避免蛋白质发生变性；
(2)根据自己的需要选择不同的表达载体，并注意不同的表达载体上的融合标签和携带的抗性基因，其中有些标签是可以去除的。
(3)构建好的载体最好进行测序验证，保证读码框正确，即没有移码。
(4)长期保存的pET重组子在高浓度甘油（19%）中会导致质粒不稳定。
(5)T7lac启动子是严谨启动子，IPTG诱导时可以优化最佳浓度（25uM-1mM之间）使目的蛋白达到最佳的活性和溶解性。
(6)37℃生长常常会使一些蛋白累积形成包涵体，而30℃生长则可能产生可溶的和有活性的蛋白。在某些情况下，低温（15－20℃）延长诱导时间（过夜）可以使溶解性蛋白的产量达到最大。
(7)进行SDS-PAGE分析时，需优化电泳上样体积。
第八章原核生物基因表达与调控 一、教学目的和要求： 掌握原核生物基因表达及调控机制 二、教学重点： １、乳糖操纵子调控机制 2、半乳糖操纵子调控机制 3、色氨酸衰减子调控机制 三、教学难点： 1、半乳糖操纵子调控机制 2、色氨酸衰减子调控机制 四、教学方法： 面授并辅以多媒体教学 五、教学内容 生物体的每个活细胞都含有相同的一整套基因。 基因表达具有高度的时空专一化：如肌红蛋白基因（肌细胞） 基因表达的调控：生物有机体对其基因表达的时空程序、表达速率等所进行的调节和控制。 本底水平表达：调控处于关闭状态，只翻译极少量的蛋白质。 第一节原核生物基因的转录和翻译原核生物的DNA： 单个裸露的DNA 不编码占5% 转录和翻译同一时间，地点进行 转录水平调控(主) ，兼有翻译水平调控 ?根据基因表达产物可划分： 组成型蛋白：基因表达不受时期、部位、环境影响——组成型表达。 /适应型蛋白：基因表达受时期、部位、环境影响——非组成型表达。?一种生物的整套遗传密码可以比作一本密码字典,该种生物的每个细胞中都有这本字典。为什么基因只有在它应该发挥作用的细胞内和应该发挥作用的时间才能呈现活化状态? ?结论：必然有一个基因调控系统在发挥作用。 ?基因调控主要在三个水平上进行: ?①. DNA水平 ?②. 转录水平 ?③. 翻译水平 ?一、转录的起始 转录是原核生物基因表达的主要调控点，主要涉及两个方面：1、RNA合成的酶系；2、RNA合成起始和终止信号，即DNA分子上的特定序列。 通过RNA聚合酶、转录因子和启动子的相互作用实现转录调控，改变细胞的表型，从而实现细胞生理状态和环境的变化。
基因工程制药综述 班级：生技132 ： 学号：
大肠杆菌表达系统的研究进展综述 自上世纪 70 年代以来, 大肠杆菌一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统。尽管基因工程表达系统已经从大肠杆菌扩大到酵母、昆虫、植物及哺乳动物细胞,并且近年来出现了很多新型的真核表达系统, 但是大肠杆菌仍然是基因表达的重要工具。尤其是进入后基因组时代以来, 有关蛋白结构以及功能研究的开展 ,对基因表达的要求更高,这时大肠杆菌往往是表达的第一选择。文章综述了近年来有关大肠杆菌表达载体及宿主细胞的改造工作。 1 表达载体 1. 1 表达调控 构建有效的表达载体是表达目的基因的基本要求, 同时也是影响基因表达水平以及蛋白活性的重要因素。标准的大肠杆菌表达载体的主要组成: 启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始区、多克隆位点、终止子、复制起点以及抗性筛选因子等。理想的表达载体要求在转录和翻译水平上可以控制目的基因的表达 ,然而目的基因在宿主体过分表达(选用较强的启动子等)会对宿主造成压力, 引起相关的细胞应答反应, 影响蛋白的活性等。基因组、RNA 转录组、蛋白质组、代调控组等领域的研究成果给我们提供了大量关于基因表达调控的信息[ 1]。现已能从基因和细胞的整体水平来方便地选择合适的启动子或合理开发新的载体系统。譬如 Lee 等利用二维凝胶电泳法比较了重组载体和空载体被分别转入宿主细胞后蛋白组学的差异,发现两者都产生了大肠杆菌热休克蛋白并引起了 cAMPCRP 调节蛋白的应答, 其中重组子的影响更为强烈；另外, 还发现外源基因的表达使宿主核糖体合成速率、翻译延长因子和折叠酶表达水平、细胞生长率下降 , 而使细胞呼吸活力上升[ 2]。目前应用的表达载体主要问题是表达过程中出现的全或无的情况, 通常表达的培养物都是非纯种的细胞群, 其中有一些细胞可以最大限度地被诱导,而另一些细胞在诱导后基因的表达被关闭。分离具有合适强度启动子及翻译速率的载体变种可以优化表达水平,说明启动子的选择对于基因的诱导表达非常重要。 Deborahat 提出在芯片上排列具有不同强度级别启动子的载体进行互补分析, 可能有助于筛选最为适合的启动子[3]。开发非 IPTG 或阿拉伯糖诱导的载体也可以提高基因表达水平, Qing 等利用 cspA 基因的独特性开发了一系列冷休克表达载体pCold, 使目的基因在低温下(<15℃) 诱导表达,提高了产物的溶解性和稳定性[4]。 1. 2 融合表达载体 除了表达载体的调控性,为了提高蛋白产物的活性以及简化下游纯化的操作等 ,往往在表达载体上插入其它辅助的基因序列与目的基因构成融合蛋白表达。融合信号肽(PelB、Om pA 、MalE、PhoA 等)表达可以使融合蛋白通过经典的 Sec 途径分泌到周质或胞外表达, 有利于形成二硫键以及避免胞质蛋白酶的水解和 N 端甲硫氨酸的延伸。另外,最近开发的双精氨酸转运体系(Tat)可以有效分泌正确折叠的重组蛋白[5]。常见的纯化标签多根据亲和层
真核生物基因表达的调控 一、生物基因表达的调控的共性 首先，我们来看看在生物基因表达调控这一过程中体现的共性和一些基本模式。 1、作用范围。生物体内的基因分为管家基因和奢侈基因。管家基因始终表达，奢侈基因只在需要的时候表达，但二者的表达都受到调控。可见，调控是普遍存在的现象。 2、调控方式。基因表达有两种调控方式，即正调控与负调控，原核生物和真核生物都离不开这两种模式。 3、调控水平。一种基因表达的调控可以在多种层面上展开，包括DNA水平、转录水平、转录后加工水平、翻译后加工水平等。然为节省能量起见，转录的起始阶段往往作为最佳调控位点。 二、真核生物基因表达调控的特点 真核生物与原核细胞在结构上就有着诸多不同，这决定了二者在运行方面的迥异途径。真核生物比原核生物复杂，转录与翻译不同时也不同地，基因组与染色体结构复杂，因而有着更为复杂的调控机制。 1、 2、 3、 4、多层次。真核生物的基因表达可发生在染色质水平、转录起始水平、无操纵子和衰减子。 大多数原核生物以负调控为主，而真核生物启动子以正调控为主。 个体发育复杂，而受环境影响较小。真核生物多为多细胞生物，在转录后水平、翻译水平以及翻译后水平。
生长发育过程中，不仅要随细胞内外环境的变化调节基因表达，还要随发育的不同阶段表达不同基因。前者为短期调控，后者属长期调控。 从整体上看，不可逆的长期调控影响更深远。 三、真核生物基因表达调控的机制 介于真核生物表达以多层次性为最主要特点，我们可以分别从它的几个水平着眼，剖析它的调控机制。 1、染色质水平。真核生物基因组DNA以致密的染色质形式存在，发生在染色质水平的调控也称作转录前水平的调控，产生永久性DNA序列和染色质结构的变化，往往伴随细胞分化。染色质水平的调控包括染色质丢失、基因扩增、基因重排、染色体DNA的修饰，等等。a.基因丢失：丢失一段DNA或整条染色体的现象。在细胞分化过程中，可以通过丢失掉某些基因而去除这些基因的活性。某些原生动物、线虫、昆虫和甲壳类动物在个体发育中，许多体细胞常常丢失掉整条或部分的染色体，只有将来分化产生生殖细胞的那些细胞一直保留着整套的染色体。如马蛔虫2n＝2，但染色体上有多个着丝粒。第一次卵裂是横裂，产生上下2个子细胞。第二次卵裂时，一个子细胞仍进行横裂，保持完整的基因组，而另一个子细胞却进行纵向分裂，丢失部分染色体。目前，在高等真核生物（包括动物、植物）中尚未发现类似的基因丢失现象。 b.基因扩增：基因扩增是指某些基因的拷贝数专一性增大的现象，它使得细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需要，是基因活性调控的一种方式。如非洲爪蟾卵母细胞中rDNA的基因扩增是因发育需要而出现的基因扩增现象；基因组拷贝数增加，即多倍性，在植物中是非常普遍的现象。基因组拷贝数增加使可供遗传重组的物质增多，这可能构成了加速基因进化、基因组重组和最终物种形成的一种方式。 c.基因重排：将一个基因从远离启动子的地方移到距它很近的位点从而启动转录，这种方式被称为基因重排。通过基因重排调节基因活性的典型例子是免疫球蛋白结构基因的表达。在人类基因组中，所有抗体的重链和轻链都不是由固定的完整基因编码的，而是由不同基因片段经重排后形成的完整基因编码的。
1.酵母表达系统的特点大肠杆菌表达系统是常用的外源基因表达系统，人们已利用该系统表达了多种蛋白。大肠杆菌基因结构简单，易于进行基因操作，而且它生长迅速，周期短，营养需求简单，适于工业化生产。但同时该系统还存在很多缺陷。它是原核表达系统，缺少真核生物的翻译后加工过程，产生的外源基因产物往往无活性，它表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复性，过程复杂，它产生的杂蛋白较多，不易纯化，所以产物中有可能会含有原核细胞中的有毒蛋白或有抗原性的蛋白。昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统都是真核细胞表达系统，它们可以进行多种蛋白的转录后加工，很适合于真核基因的表达。但是，它们遗传背景复杂，操作困难，易污染，生产成本高，所以并不利于实际应用[2,3] 2.核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化[4]。所以近年来，酵母表达系统已广泛应用于工业生产，为社会创造了极大的经济效益 3.酵母一般可分成三大类：(1) 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又称面包酵母；(2) 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；(3) 非常规酵母(Nonconventional yeast)，是指除酿酒酵母和粟酒裂殖酵母外的酵母统称 4.酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）又名面包酵母，它是单细胞真核微生物，一直以来酿酒酵母被称为真核生物中的―大肠杆菌‖。它是最早应用于酵母基因克隆和表达的宿主菌。自1981年Hitzemom等用酿酒酵母表达人干扰素获得成功后，人们还用酿酒酵母表达了多种原核和真核蛋白，目前科学家对酿酒酵母表达系统的研究已非常深入。 5.2.1.2 用于基因表达的宿主菌——酿酒酵母在遗传学方面，人们对酿酒酵母进行了广泛的研究，酿酒酵母基因组序列（约1.2×107bp）早在1996年就完成，它有16条染色体，约6000个ORF，仅4%的酵母基因有内含子。由于人们对酿酒酵母的遗传背景十分清楚，因此酿酒酵母是很理想的真核表达宿主菌。
一、真核基因组的复杂性 与原核生物比较，真核生物的基因组更为复杂，可列举如下。 1. 真核基因组比原核基因组大得多，大肠杆菌基因组约4×106bp，哺乳类基因组在 109bp数量级，比细菌大千倍；大肠杆菌约有4000个基因，人则约有10万个基因。 2. 真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹在核膜内，核外还有遗传 成分(如线粒体DNA等)，这就增加了基因表达调控的层次和复杂性。 3. 原核生物的基因组基本上是单倍体，而真核基因组是二倍体。 4. 如前所述，细菌多数基因按功能相关成串排列，组成操纵元的基因表达调控的单元， 共同开启或关闭，转录出多顺反子(polycistron)的mRNA；真核生物则是一个结构基因转录生成一条mRNA，即mRNA是单顺反子(monocistron)，基本上没有操纵元的结构，而真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亚基构成的，这就涉及到多个基因协调表达的问题，真核生物基因协调表达要比原核生物复杂得多。 5. 原核基因组的大部分序列都为基因编码，而核酸杂交等实验表明：哺乳类基因组中 仅约10%的序列为蛋白质、rRNA、tRNA等编码，其余约90%的序列功能至今还不清楚。 6. 原核生物的基因为蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核生物为蛋白质编码 的基因绝大多数是不连续的，即有外显子(exon)和内含子(intron)，转录后需经剪接(splicing)去除内含子，才能翻译获得完整的蛋白质，这就增加了基因表达调控的环节。 7. 原核基因组中除rRNA、tRNA基因有多个拷贝外，重复序列不多。哺乳动物基因组 中则存在大量重复序列(repetitive sequences)。用复性动力学等实验表明有三类重复序列：1）高度重复序列(highly repetitive sequences)，这类序列一般较短，长10－300bp，在哺乳类基因组中重复106次左右，占基因组DNA序列总量的10－60%，人的基因组中这类序列约占20%，功能还不明了。2）中度重复序列(moderately repetitive sequences)，这类序列多数长100－500bp，重复101－105次，占基因组10-40%。例如哺乳类中含量最多的一种称为Alu的序列，长约300bp，在哺乳类不同种属间相似，在基因组中重复3×105次，在人的基因组中约占7%，功能也还不很清楚。在人的基因组中18S/28SrRNA基因重复280次，5SrRNA基因重复2000次，tRNA基因重复1300次，5种组蛋白的基因串连成簇重复30-40次，这些基因都可归入中度重复序列范围。3）单拷贝序列(single copy sequences)。这类序列基本上不重复，占哺乳类基因组的50-80%，在人基因组中约占65%。绝大多数真核生物为蛋白质编码的基因在单倍体基因组中都不重复，是单拷贝的基因。 从上述可见真核基因组比原核基因组复杂得多，至今人类对真核基因组的认识还很有限，使现在国际上制订的人基因组研究计划(human gene project)完成，绘出人全部基因的染色体定位图，测出人基因组109bp全部DNA序列后，要搞清楚人全部基因的功能及其相互关系，特别是要明了基因表达调控的全部规律，还需要经历很长期艰巨的研究过程。 二、真核基因表达调控的特点 尽管我们现在对真核基因表达调控知道还不多，但与原核生物比较它具有一些明显的特点。
8.大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化 大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点, 是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要 的。本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细 操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。 8.1大肠杆菌表达系统的选择与构建 8.1.1表达载体的选择 根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如λPL，cspA 等和另外一类就是广泛使用的IPTG诱导的启动子，如lac，trc，tac，T5/lac operator，T5/lac operator等。根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。融合表达是在目标蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化，或者实现目标蛋白的表达定位。常用的用于亲和纯化融合标签包括 Poly-Arg， Poly-His, Strep-Tag Ⅱ，S-tag，MBP等。其中His-Tag 和GST-Tag 是目前使用最多的。His Tag 大多数是连续的六个His 融合于目标蛋白的N端或C端，通过His 与金属离子：Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+ 的螯合作用而实现亲和纯化，其中Ni2+是目前使用最广泛的。His 标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的N端和C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。目前常使用的表达载体主要是由Novagen 提供的pET 系列和Qiagen 公司提供的pQE 系列。 除了His 标签外，还原性谷胱甘肽S-转移酶是另一种实验室常用的融合标签。它可以通过还原性谷胱甘肽琼脂糖亲和层析而快速纯化。此外，与His 相比，GST 很多时候能够促进目标蛋白的正确折叠，提高目标蛋白表达的可溶性，因此，对于那些用his 标签表达易形成包涵体的蛋白，可以尝试用GST融合表达来改进。当然，GST 具有较大的分子量（26kDa），可能对目的蛋白的活性有影响，因此很多时候切除GST是必须的。目前，GST融合表达系统主要是由GE Healthcare （原Amersham）提供。 8.1.2宿主菌的选择 重组质粒的构建一般选择遗传稳定，转化效率高，质粒产量高的菌株作为受体菌，常用的有E.coli DH5α，E.coli JM 109，E.coli DH 10B ，E.coli NovaBlμe等rec A–和end A–型细胞。作为表达宿主菌必须具备几个基本特点：遗传稳定，生长速度快，表达蛋白稳定。具体操作过程中，根据所使用的表达载体的特点，目的基因密码子的组成等选择特定的表达宿主菌。以下是实验室常用的几种表达宿主： BL2： lon和ompT 蛋白酶缺陷型，避免了宿主对外源蛋白的降解。是经典的使用最广泛的表达受体。适用于Tac，Trc，Lac，λPL，cspA等作为启动子的载体。 BL21（DE3）： DE3噬菌体溶源于BL21 形成的带有染色体T7 RNA 聚合酶基因大肠杆菌。IPTG 诱导的lac ΜV5 启动子控制T7 RNA 聚合酶基因表达T7 RNA 聚合酶，进而控制T7 表达系统表达目的蛋白。 BL21（DE3）衍生系列：在经典的T7表达系统BL21（DE3）的基础上，Novagen 公司开发了一些特殊的表达宿主细胞。比如：Origami （DE3），Origami B（DE3）和Rosetta-gami （DE3）菌株带有 trxB和
第十章作业 1. 简述真核生物基因表达调控的7个层次。 ①染色体和染色质水平上的结构变化与基因活化 ②转录水平上的调控，包括基因的开与关，转录效率的高与低 ③RNA加工水平的调控，包括对出事转录产物的特异性剪接、修饰、编辑等。 ④转录后加工产物在从细胞核向细胞质转运过程中所受到的调控 ⑤在翻译水平上的控制，即对哪一种mRNA结合核糖体进行翻译的选择以及蛋白质成量的控制 ⑥对蛋白质合成后选择性地被激活的控制，蛋白质和酶分子水平上的剪接等的控制 ⑦对mRNA选择性降解的调控 2. 真核基因表达调控与原核生物相比有何异同？ 相同点：①与原核基因的调控一样，真核基因表达调控也有转录水平调控和转录后水平的调控，并且也以转录水平调控为最重要； ②在真核结构基因的上游和下游(甚至内部)也存在着许多特异的调控成分，并依靠特异蛋白因子与这些调控成分的结合与否调控基因的转录。 不同点：①原核细胞的染色质是裸露的DNA，而真核细胞染色质则是由DNA与组蛋白紧密结合形成的核小体。 ②在原核基因转录的调控中，既有激活物参与的正调控，也有阻遏物参与的负调控，二者同等重要。 ③原核基因的转录和翻译通常是相互偶联的，即在转录尚未完成之前翻译便已开始。 ④真核生物大都为多细胞生物，在个体发育过程中发生细胞分化后，不同细胞的功能不同，基因表达的情况也就不一样，某些基因仅特异地在某种细胞中表达，称为细胞特异性或组织特异性表达，因而具有调控这种特异性表达的机制。 3. DNA 甲基化对基因表达的调控机制。 甲基化抑制基因转录的机制：DNA甲基化会导致某些区域DNA构象改变，包括甲基化后染色质对于核酸酶或限制性内切酶的敏感度下降，更容易与组蛋白H1相结合，DNaseⅠ超敏感位点丢失，使染色质高度螺旋化, 凝缩成团, 直接影响了转录因子与启动区DNA的结合效率的结合活性，不能启始基因转录。DNA的甲基化不利于模板与RNA聚合酶的结合，降低了转录活性。 4. 转录因子结合DNA的结构基序（结构域）有哪几类？ ①螺旋-转折-螺旋 ②锌指结构 ③碱性-亮氨酸拉链 ④碱性-螺旋-环-螺旋 5. 真核基因转调控中有几种方式能够置换核小体？ ①占先模式：可以解释转录时染色质结构的变化。该模型认为基因能否转录取决于特定位置上组蛋白和转录因子之间的不可逆竞争性结合。 ②动态模式该模型认为转录因子与组蛋白处于动态竞争之中，基因转录前染色质必须经历结构上的改变，即转换核小体中的全部或部分成分并重新组装，这个耗能的基因活化过程称为染色质重构 6. 简述真核生物转录水平调控过程。 真核生物在转录水平的调控主要是通过反式作用因子、顺式作用元件和RNA聚合酶的相互作用来完成的，主要是反式作用因子结合顺式作用元件后影响转录起始复合物的形成过程：①转录起始复合物的形成：真核生物RNA聚合酶识别的是由通用转录因子与DNA形成的
原核表达详细步骤 PartⅠ选择表达的目的基因 一、基因序列 1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序: ①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。 ②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。 ③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。 2. 注意事项： ①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS 和partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，partial CDS的读码是相应的AA ②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。 二、抗原决定簇的预测 1、原理： 蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。 2、选择原则： （1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。 （2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。 （3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。 3、选定抗原决定簇的步骤： （1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。在线网站预测（https://www.doczj.com/doc/1915489044.html,/molbio/hla_bind/index.shtml and http://www.imtech.res.in/raghava/propred/algorithm.html）（2）选定：接近N、C端；选取在此区间内，（Antigenic Index）Jameson-wolf 抗原决定簇选正分高处；（Hydrophilicity plot）Kyte-Doolittle预测亲水性强的区域。同时符合以上3点的区域较好（命名为多肽片断A）。 注：如果设计的多肽是跨膜蛋白，请尽量回避选择蛋白的跨膜区，即头端信号肽所在的区域 （3）NCBI（BlastP）比对：将多肽片断A放入blastp进行同源性比对。如果制备某一动物种属的抗体，该区必须与该动物的氨基酸序列没有较高的同源性。注：这一步往往容易漏掉，所以学会应用生物信息学，可以减少走弯路！！！（4）抗原合成： ①原核表达：
原核生物和真核生物基因表达调控特点的比较1.相同点:转录起始是基因表达调控的关键环节2.不同点:A.原核基因的表达调控主要包括转录和翻译水平 真核基因的表达调 控主要包括染色质活化、转录、转录后加工、翻译、翻译后加工多个层次B.原核基因表达调控主要为负调控,真核主要为正调控C.原核转录不需要转录因子,RNA聚合酶直接结合启 动子,由sita因子决定基因表的的特异性 真核基因转录起始需要基础特异两类转录因子 依赖DNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质相互作用 调控转录激活D.原核基因表达调控主要采用操纵子模型 转录出多顺反子RNA 实现协调调节 真核基因转录产物为单顺反子RNA 功能相关蛋白的协调表达机制更为复杂。真核生物基因表达调控的环节主要在转录水平 其次是翻译水平。原核生物基因以操纵子的形式存在。转录水平调控涉及到启动子、sita因子 与RNA聚合酶结合 、阻遏蛋白 负调控 、正调控蛋白、倒位蛋白、RNA聚合酶抑制物、衰减子等。翻译水平的调控涉及SD序列、mRNA的稳定性 不稳定(5’端和3’端的发夹结构可保护不被酶水解mRNA的5’端与核糖体结合 可明显提高稳定性)、翻译产物及小分子RNA的调控作用。真核生物基因表达的调控环节较多 在DNA水平上可以通过染色体 丢失、基因扩增、基因重排、DNA甲基化、染色体结构改变影响基因表达。在转录水平主要通过反式作用因子调控转录因子与TATA盒的结合、RNA聚合酶与转录因子-DNA复合物的结合及转录起始复合物的形成。在转录后水平主要通过RNA修饰、剪接及mRNA运输的控制来影响基因表达。在翻译水平有影响起始翻译的阻遏蛋白、5’AUG、5’端非编码区长度、mRNA 的稳定性调节及小分子RNA。真核基因调控中最重要的环节是基因转录 真核生物基因表达需要转录因子、启动子、沉默子和增强子。葡萄糖存在 乳糖不存在 此时无诱导剂
1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET 系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pLysS菌株 该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS ，Camr 4：JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株 基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15] 5：TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lac Ⅹ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU ，galK ，rps，(Strr) endA1，nupG 6：HB101菌株 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验 基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1 7：M110或SCS110 大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm，从而受到甲基化的影
真核生物基因表达的调控远比原核生物复杂，可以发生在DNA水平、转录水平、转录后的修饰、翻译水平和翻译后的修饰等多种不同层次。但是，最经济、最主要的调控环节仍然是在转录水平上。 DNA水平的调控 DNA水平上的调控主要指通过染色体DNA的断裂，删除，扩增，重排，修饰（如甲基化与去甲基化，乙酰化与去乙酰化等）和染色质结构变化等改变基因的数量、结构顺序和活性而控制基因的表达。 转录水平的调控 转录水平的调控包括染色质的活化和基因的活化。通过染色质改型，组蛋白乙酰化，染色质变得疏松化及DNA去甲基化以便被酶和调节蛋白作用，基因的表达受顺式作用元件包括启动子及应答元件，转座元件，增强子，抑制子的调控，同时受反式作用因子包括基本转录因子，上游转录因子和转录调节因子等的调控。 转录后调控 转录后调控包括hnRNA的选择性加工运输和RNA编辑 在真核生物中，蛋白质基因的转录产物统称为hn RNA，必须经过加工才能成为成熟的mRNA分子。加工过程包括三个方面：加帽、加尾和去掉内含子。同一初级转录产物在不同细胞中可以用不同方式剪接加工，形成不同的成熟mRNA分子，使翻译成的蛋白质都可能不同。转录后的RNA在编码区发生碱基插入，缺失或转换的现象。
翻译水平的调控 阻遏蛋白与mRNA结合，可以阻止蛋白质的翻译并使成熟的mRNA变为失活状态贮存起来。一些调控作用的micRNAh和siRNA 还可以与mRNA作用降解mRNA，阻止其翻译 此外，还可以控制mRNA的稳定性和有选择的进行翻译。 翻译后调控 直接来自核糖体的线状多肽链是没有功能的，必须经过加工才具有活性。在蛋白质翻译后的加工过程中，还有一系列的调控机制。 1．蛋白质折叠 线性多肽链必须折叠成一定的空间结构，才具有生物学功能。在细胞中，蛋白质的折叠必须有分子伴侣的作用下才能完成折叠。 2．蛋白酶切割 末端切割 有些膜蛋白、分泌蛋白，在氨基端具有一段疏水性强的氨基酸序列，称为信号肽，用于前体蛋白质在细胞中的定位。信号肽必须切除多肽链才具有功能。 多聚蛋白质的切割 有些新合成的多肽链含有几个蛋白质分子的序列，切割以后产生具有不同功能的蛋白质分子。
目的基因在大肠杆菌中的诱导表达 一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测。 [主要试剂] 1、LB培养基。 2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O 中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 [操作步骤] 1、通过PCR方法获得目的基因：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点，本实验中为BamHⅠ和HiindⅢ），PCR循环获得所需基因片段。 PCR反应体系为： 模板（含R基因的重组质粒）1μl 上游引物PR11μl 下游引物1μl dNTP（2.5mmol/L）5μl 10×PCR buffer（含Mg2+）10μl Taq酶1μl ddH2O补至100μl PCR反应条件为：94℃变性3min；94℃变性3min、52℃复性40sec、72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸8min。 2、构建重组表达载体 （1）载体酶切：将表达质粒pRSETA用限制性内切酶（同引物的酶切位点）
进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用凝胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 （2）R基因PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接入载体。连接反应体系为： pRSETA1μl R基因片段3μl T4 DNA连接酶（5U/μl）1μl 5×buffer2μl ddH2O补至10μl 3、获得含重组表达质粒的表达菌种 （1）将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 （2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 （3）以此重组质粒DNA转化表达宿主菌BL21（DE3）的感受态细胞。 4、诱导表达 1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。 2、按1∶100比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含100mlLB培养基的300ml 培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌0.5-0.8（最好0.6，大约需3hr）。 3、取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1mM 作为实验组，两组继续于37℃、200rpm震荡培养3hr。 4、分别取菌体1ml,，离心12000g×30s收获沉淀，用100μl 1%SDS重悬，混匀，70℃10min。 5、离心12000g×1min，取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。 6 5500rpm 15min 收集细胞
原核基因表达调控综 述
细菌能随环境的变化，迅速改变某些基因表达的状态，这就是很好的基因表达调控的实验型。人们就是从研究这种现象开始，打开认识基因表达调控分子机理的窗口的。 一、操纵元的提出 大肠杆菌可以利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖等作为碳源而生长繁殖。当培养基中有葡萄糖和乳糖时，细菌优先使用葡萄糖，当葡萄糖耗尽，细菌停止生长，经过短时间的 适应，就能利用乳糖，细菌继续 呈指数式繁殖增长(见下图)。 大肠杆菌利用乳糖至少需要两个 酶：促使乳糖进入细菌的乳糖透 过酶(lactose permease)催化乳 糖分解第一步的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)(见下图)。 在环境中没有乳糖或其他β-半乳糖苷时，大肠杆菌合成β- 半乳糖苷酶量极少，加入乳糖2－3分钟后，细菌大量合 成β-半乳糖苷酶，其量可提高千倍以上，在以乳糖作为唯 一碳源时，菌体内的β-半乳糖苷酶量可占到细菌总蛋白量 的3%。在上述二阶段生长细菌利用乳糖再次繁殖前，也
能测出细菌中β-半乳糖苷酶活性显著增高的过程。这种典型的诱导现象，是研究基因表达调控的极好模型。 针对大肠杆菌利用乳糖的适应现象，法国的Jacob和Monod等人做了一系列遗传学和生化学研究实验，于1961年提出乳糖操纵元(lac operon)学说，如下图所示。下图中z、a 是大肠杆菌编码利用乳糖所需酶类的基因，P是转录z、a所需要的启动子，调控基因i编码合成调控蛋白R，R能与O结合而阻碍从P开始的基因转录，所以O就是调节基因开放的操纵序列，乳糖能改变R结构使其不能与P结合，因而乳糖浓度增高时基因就开放，转录合成所编码的酶类，这样大肠杆菌就能适应外界乳糖供应的变化而改变利用乳糖的状况，这个模型是人们在科学实验的基础上第一次开始认识基因表达调控的分子机理。 二、操纵元(operon)的基本组成 乳糖操纵元模型被以后的许多研究实验所证实，对其有了更深入的认识，并且发现其他原核生物基因调控也有类似的操纵元组织（见下图），操纵元是原核基因表达调控的一种重要的组织形式，大肠杆菌的基因多数以操纵元的形式组成基因表达调控的单元。下面就以半乳糖操纵元为例子说明操纵元的最基本的组成元件(elements)。 （一）结构基因群 操纵元中被调控的编码蛋白质的基因可称为结构基因(structural gene, SG)。一个操纵元中含有2个以上的结构基因，多的可达十几个。每个结构基因是一个连续的开放读框(open reading frame)，5’端有翻译起始码(DNA存储链上是ATG，转录成mRNA就是
pKD3 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4290 pKD3 pKD3载体基本信息 载体名称: pKD3 质粒类型: 细菌表达；基因敲除系统 高拷贝/低拷贝: --‐--‐ 启动子: R6K 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 2804 b p 5' 测序引物及序列: R6K--‐3 3' 测序引物及序列: rrnB--‐T1--‐term--‐F 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: Ampicillin 和 Chloramphenicol 筛选标记: --‐--‐ 备注: --‐--‐ 稳定性: --‐--‐ 组成型: --‐--‐ 病毒/非病毒: --‐--‐ pKD3载体质粒图谱和多克隆位点信息
pKD3载体序列 ORIGIN 1 AGATTGCAGC ATTACACGTC TTGAGCGATT GTGTAGGCTG GAGCTGCTTC GAAGTTCCTA 61 TACTTTCTAG AGAATAGGAA CTTCGGAATA GGAACTTCAT TTAAATGGCG CGCCTTACGC 121 CCCGCCCTGC CACTCATCGC AGTACTGTTG TATTCATTAA GCATCTGCCG ACATGGAAGC
181 CATCACAAAC GGCATGATGA ACCTGAATCG CCAGCGGCAT CAGCACCTTG TCGCCTTGCG 241 TATAATATTT GCCCATGGTG AAAACGGGGG CGAAGAAGTT GTCCATATTG GCCACGTTTA 301 AATCAAAACT GGTGAAACTC ACCCAGGGAT TGGCTGAGAC GAAAAACATA TTCTCAATAA 361 ACCCTTTAGG GAAATAGGCC AGGTTTTCAC CGTAACACGC CACATCTTGC GAATATATGT 421 GTAGAAACTG CCGGAAATCG TCGTGGTATT CACTCCAGAG CGATGAAAAC GTTTCAGTTT 481 GCTCATGGAA AACGGTGTAA CAAGGGTGAA CACTATCCCA TATCACCAGC TCACCGTCTT 541 TCATTGCCAT ACGTAATTCC GGATGAGCAT TCATCAGGCG GGCAAGAATG TGAATAAAGG 601 CCGGATAAAA CTTGTGCTTA TTTTTCTTTA CGGTCTTTAA AAAGGCCGTA ATATCCAGCT 661 GAACGGTCTG GTTATAGGTA CATTGAGCAA CTGACTGAAA TGCCTCAAAA TGTTCTTTAC 721 GATGCCATTG GGATATATCA ACGGTGGTAT ATCCAGTGAT TTTTTTCTCC ATTTTAGCTT 781 CCTTAGCTCC TGAAAATCTC GACAACTCAA AAAATACGCC CGGTAGTGAT CTTATTTCAT 841 TATGGTGAAA GTTGGAACCT CTTACGTGCC GATCAACGTC TCATTTTCGC CAAAAGTTGG 901 CCCAGGGCTT CCCGGTATCA ACAGGGACAC CAGGATTTAT TTATTCTGCG AAGTGATCTT 961 CCGTCACAGG TAGGCGCGCC GAAGTTCCTA TACTTTCTAG AGAATAGGAA CTTCGGAATA 1021 GGAACTAAGG AGGATATTCA TATGGACCAT GGCTAATTCC CATGTCAGCC GTTAAGTGTT 1081 CCTGTGTCAC TGAAAATTGC TTTGAGAGGC TCTAAGGGCT TCTCAGTGCG TTACATCCCT 1141 GGCTTGTTGT CCACAACCGT TAAACCTTAA AAGCTTTAAA AGCCTTATAT ATTCTTTTTT 1201 TTCTTATAAA ACTTAAAACC TTAGAGGCTA TTTAAGTTGC TGATTTATAT TAATTTTATT 1261 GTTCAAACAT GAGAGCTTAG TACGTGAAAC ATGAGAGCTT AGTACGTTAG CCATGAGAGC 1321 TTAGTACGTT AGCCATGAGG GTTTAGTTCG TTAAACATGA GAGCTTAGTA CGTTAAACAT 1381 GAGAGCTTAG TACGTGAAAC ATGAGAGCTT AGTACGTACT ATCAACAGGT TGAACTGCGG 1441 ATCTTGCGGC CGCAAAAATT AAAAATGAAG TTTTAAATCA ATCTAAAGTA TATATGAGTA 1501 AACTTGGTCT GACAGTTACC AATGCTTAAT CAGTGAGGCA CCTATCTCAG CGATCTGTCT 1561 ATTTCGTTCA TCCATAGTTG CCTGACTCCC CGTCGTGTAG ATAACTACGA TACGGGAGGG 1621 CTTACCATCT GGCCCCAGTG CTGCAATGAT ACCGCGAGAC CCACGCTCAC CGGCTCCAGA 1681 TTTATCAGCA ATAAACCAGC CAGCCGGAAG GGCCGAGCGC AGAAGTGGTC CTGCAACTTT 1741 ATCCGCCTCC ATCCAGTCTA TTAATTGTTG CCGGGAAGCT AGAGTAAGTA GTTCGCCAGT 1801 TAATAGTTTG CGCAACGTTG TTGCCATTGC TACAGGCATC GTGGTGTCAC GCTCGTCGTT 1861 TGGTATGGCT TCATTCAGCT CCGGTTCCCA ACGATCAAGG CGAGTTACAT GATCCCCCAT 1921 GTTGTGCAAA AAAGCGGTTA GCTCCTTCGG TCCTCCGATC GTTGTCAGAA GTAAGTTGGC 1981 CGCAGTGTTA TCACTCATGG TTATGGCAGC ACTGCATAAT TCTCTTACTG TCATGCCATC 2041 CGTAAGATGC TTTTCTGTGA CTGGTGAGTA CTCAACCAAG TCATTCTGAG AATAGTGTAT 2101 GCGGCGACCG AGTTGCTCTT GCCCGGCGTC AATACGGGAT AATACCGCGC CACATAGCAG 2161 AACTTTAAAA GTGCTCATCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGAAAACTCT CAAGGATCTT 2221 ACCGCTGTTG AGATCCAGTT CGATGTAACC CACTCGTGCA CCCAACTGAT CTTCAGCATC 2281 TTTTACTTTC ACCAGCGTTT CTGGGTGAGC AAAAACAGGA AGGCAAAATG CCGCAAAAAA 2341 GGGAATAAGG GCGACACGGA AATGTTGAAT ACTCATACTC TTCCTTTTTC AATATTATTG 2401 AAGCATTTAT CAGGGTTATT GTCTCATGAG CGGATACATA TTTGAATGTA TTTAGAAAAA 2461 TAAACAAATA GGGGTTCCGC GCACATTTCC CCGAAAAGTG CCACCTGCAT CGATGGCCCC 2521 CCGATGGTAG TGTGGGGTCT CCCCATGCGA GAGTAGGGAA CTGCCAGGCA TCAAATAAAA 2581 CGAAAGGCTC AGTCGAAAGA CTGGGCCTTT CGTTTTATCT GTTGTTTGTC GGTGAACGCT 2641 CTCCTGAGTA GGACAAATCC GCCGGGAGCG GATTTGAACG TTGCGAAGCA ACGGCCCGGA 2701 GGGTGGCGGG CAGGACGCCC GCCATAAACT GCCAGGCATC AAATTAAGCA GAAGGCCATC 2761 CTGACGGATG GCCTTTTTGC GTGGCCAGTG CCAAGCTTGC ATGC