下载文档原格式
大肠杆菌表达系统总结随着分子生物学和蛋白组学的迅猛发展，外源基因表达的遗传操作技术日趋成熟。
表达系统是外源基因表达的核心，常用表达系统一般为模式生物，包括真核表达系统和原核表达系统，其中真核系统包括了哺乳动物细胞表达系统、植物体表达系统、昆虫杆状病毒表达载体系统以及酵母表达系统，原核表达系统则主要为大肠杆菌表达系统。
大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统，也是最早进行研究的外源基因表达系统，其遗传学背景清晰、生长快、较易实现高密度培养、成本低、产量高，相较于其它表达系统具有难以比拟的优越性，是商业生产中应用最广泛的表达系统，取得了巨大的科研价值和经济效益。
大肠杆菌表达系统目前广泛应用于表达生产多种蛋白质/多肽类药物和生物化学产品，包括：重组人胰岛素、a2b型干扰素、兰尼单抗、紫色杆菌素和牡丹皮葡萄糖苷等。
据统计，1986-2018年由美国FDA和欧洲EMA批准上市的重组蛋白类药物中有26%来自于大肠杆菌。
与此同时，目前通过大肠杆菌表达的基因工程疫苗也进入市场或处于临床实验阶段，如戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、流感A型疫苗等。
常见的大肠杆菌表达系统有BL21系列、JM109系列、 W3110系列和K802系列等，其中大肠杆菌 BL21（ DE3）菌株是目前应用于重组蛋白表达研究最广泛的菌株之一，BL21（DE3）是由大肠杆菌B系列与K-12系列的衍生菌株通过 P1 转导等遗传突变获得的。
该类菌株通常为宿主蛋白酶缺失型，以保证外源蛋白在表达过程中不被降解，维持表达的稳定性。
大肠杆菌表达系统在商业生产中具有巨大的优越性和价值，但建立高效匹配的表达系统是实现商业价值的关键，包括宿主菌、外源基因、载体的选择与匹配。
宿主菌的选择是第一步，对表达活性和表达量影响很大，理想的宿主菌株是蛋白酶缺陷型，避免蛋白酶过多引起的产物不稳定，常见的蛋白酶缺陷型菌株为BL21系列菌株。
其次是外源基因，外源基因决定了是否可获得目的产物，原核基因可在大肠杆菌中直接表达，而真核基因不能再大肠杆菌中直接表达。
大肠杆菌的原核表达实验过程结果
大肠杆菌的原核表达实验一般分为以下几个步骤：
1. 构建表达载体：将待表达的基因克隆到适当的表达载体上,如常用的pET、pGEX等载体中。
2. 转化大肠杆菌：将表达载体转化到大肠杆菌细胞中。
可以通过化学方法、电转化、冷冻复苏、热激转化等方法进行。
3. 诱导表达：在大肠杆菌细胞进行生长至适当时期后,添加适宜浓度的诱导剂,如IPTG等,诱导待表达基因蛋白的合成。
4. 细胞收获和破碎：诱导一定时间后,收获大肠杆菌细胞并进行破碎,以获得待表达蛋白。
5. 蛋白提取：对细胞破碎物进行离心、超滤等步骤,去除残余细胞构成和杂质,得到含有待表达蛋白的上清液。
6. 纯化和分析：将上清液进行分离、纯化、鉴定,以确定表达蛋白相应的分子量、酶活性等。
在以上步骤中,实验者需要进行质控和评估,确认实验步骤是否正确和表达蛋白是否达到预期,以确保实验结果的可靠性和准确性。
苹果PGIP基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达熊帅;张军科;谌悦【摘要】[目的]从富士苹果幼果果实中克隆多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因,并进行原核表达,为进一步研究PGIP的生物学功能奠定基础.[方法]根据Genbank 中已经发表的苹果PGIP基因序列设计引物,采用RT-PCR从苹果果实中扩增PGIP 基因cDNA,回收目的基因片段并连接到pMD18-T载体,鉴定后进行测序.然后将PGIP全长cDNA和去信号肽的cDNA导入到pET-32a(+)表达载体中,分别获得融合表达质粒pET-PGIP和pET-PGIP-X,将其分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用不同终浓度IPTG进行诱导表达,收集表达产物并进行SDS-PAGE电泳.对pET-PGIP-X基因工程菌表达产物的可溶性进行检测.[结果]苹果PGIP cDNA序列长为1 091 bp,编码区为993 bp,可编码330个氨基酸残基,将其命名为MdPGIP;重组表达质粒pET-PGIP和pET-PGIP.X在宿主大肠杆菌中分别表达出分子质量约49.6和46.1 ku的融合蛋白,pET-PGIP-X表达产物以包涵体的形式存在.[结论]成功克隆了苹果PGIP基因,并在大肠杆菌中获得高效表达.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(038)002【总页数】7页(P123-128,134)【关键词】苹果;多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白;基因克隆;内源多聚半乳糖醛酸酶【作者】熊帅;张军科;谌悦【作者单位】西北农林科技大学,园艺学院,农业部西北园艺植物种质资源利用重点开放实验室,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学,园艺学院,农业部西北园艺植物种质资源利用重点开放实验室,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学,园艺学院,农业部西北园艺植物种质资源利用重点开放实验室,陕西,杨凌,712100【正文语种】中文【中图分类】S661.1植物细胞壁可以有效地阻碍植物病原真菌的侵染，但植物病原真菌可分泌一系列的酶来降解植物细胞壁。
原核表达系统的工作原理原核表达系统是指利用原核生物（如大肠杆菌等）来表达外源蛋白质的工具，在生物技术和基因工程领域应用十分广泛。
原核表达系统通过重组DNA技术将目标基因插入原核细胞的表达载体中，并利用细胞自身的代谢机制，将目标蛋白质大量表达出来。
本文将详细介绍原核表达系统的工作原理。
1. 原核表达系统的基本构成原核表达系统的基本构成包括表达载体和宿主细胞两部分。
表达载体是一种重组DNA分子，通常包括以下基本组成成分：（1）起始位点（起始密码子）：在大肠杆菌中通常为AUG。
（2）表达基因：包括编码目标蛋白质的DNA序列和转录启动子、转录终止子等序列。
（3）选择标记：旨在筛选出带有目标基因的细胞，并提高表达效率。
常用的选择标记有抗生素抵抗基因和荧光标记基因等。
（4）复制起点：能够使表达载体在宿主细胞内进行自我复制，提高表达效率。
宿主细胞则是一种能够实现表达载体遗传信号转录、翻译和合成目标蛋白质的生命体。
2. 原核表达系统的工作流程原核表达系统通过以下几个步骤来实现目标蛋白质的表达：（1）制备表达载体将目标基因插入表达载体中，构建成重组DNA分子。
（2）转化宿主细胞将制备好的表达载体转化（transform）到宿主细胞内。
转化过程中，表达载体通过电击、热激或溶菌酶处理等方法，被宿主细胞吞噬并与其细胞质融合。
（3）表达基因转录和翻译转录因子识别插入表达载体的启动子序列，调节基因在宿主细胞内能够合成被表达的mRNA。
转录后的mRNA与核糖体结合，开始翻译，合成蛋白质。
（4）目标蛋白质的后处理和纯化将宿主细胞内表达的蛋白质从培养基或细胞酶中提取出来。
通常采用离心、过滤或柱层析等方法，对蛋白质进行分离和纯化。
3. 原核表达系统的优缺点原核表达系统在生物技术和基因工程领域应用广泛，主要因为其有以下的优缺点。
（1）优点①高效：能够表达大量的目标蛋白质，通常能够达到10%以上的蛋白质总产量。
②简便：操作简便，不需要昂贵的设备，很容易进行规模化操作。
原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。
②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。
③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。
在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。
2. 注意事项：①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS和partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。
二、抗原决定簇的预测1、原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。
一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。
变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。
只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。
做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。
2、选择原则：（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。
（2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。
（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。
所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。
3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。
[收稿日期]20060626 [基金项目]国家自然科学基金资助项目(30370975);浙江省重大科技项目(2005C12019-02) [第一作者简介]张 弢(5),女,黑龙江双鸭山市人,农学博士,主要从事植物分子生物学研究 [通讯作者]曹家树,博士,教授,博士生导师白菜BcM F 2基因在大肠杆菌中的高效表达 张 弢 (浙江大学蔬菜研究所,浙江杭州310029;莱阳农学院生命科学学院,山东青岛266109) 刘乐承 (浙江大学蔬菜研究所,浙江杭州310029;长江大学园艺园林学院,湖北荆州434025) 曹家树 (浙江大学蔬菜研究所,浙江杭州310029)[摘要]通过PCR 方法扩增BcMF2cDNA 完整的编码区序列,构建p ET 2BcM F2重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IP TG 诱导融合蛋白高效表达;SDS 2PA GE 电泳检测发现在70kD 处有一条蛋白质特异条带,与预期的目的产物蛋白带大小一致,同时发现,其阳性克隆在30℃和IP TG 终浓度为0.4～1.0mmol L -1时诱导6h ,均能获得较高的表达量。
[关键词]白菜(B r assica c ampestr is L.ssp.Chinensis Ma kino );多聚半乳糖醛酸酶;BcM F2;原核表达[中图分类号]Q786[文献标识码]A [文章编号]16731409(2006)03015303多聚半乳糖醛酸酶(polygalact urona se ,P G )基因参与植物发育的许多阶段,在果实、叶和花脱落以及花粉发育中起着重要作用。
目前,许多植物中的P G 基因得到了克隆,其中包括与花粉发育相关的P G 基因如玉米花粉中PG (X 57627)[1]、油菜花粉中大量表达的P G 基因(L19879)[2]、烟草花粉特异的N p g 1(X71020)[3]、苜蓿花粉中特异表达的P G 基因P 73(U20431)[4]等等。
实验九外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和降解物阻遏作用【实验目的】1.了解外源基因在原核细胞中表达的基础理论。
2.掌握乳糖操纵子的调节机制和操作方法。
【实验原理】1.外源基因在原核细胞中的表达蛋白质通常是研究的最终目标，因此蛋白质的表达在基因工程中占有非常重要的地位。
常用的表达系统有原核细胞和真核细胞。
原核细胞表达系统主要使用大肠杆菌，真核细胞表达系统主要有酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞。
这些表达系统各有优缺点，应根据实验目的和实验室条件加以选择。
本实验主要介绍以大肠杆菌为代表的原核细胞表达系统。
（1）大肠杆菌表达系统的特点：生物学特性和遗传背景清楚，易于操作；已开发较多的克隆载体可供选择；容易获得大量的外源蛋白（外源蛋白可占细菌总蛋白50％左右）。
（2）蛋白质在原核细胞中的表达特点：原核细胞有其固有的RNA聚合酶，识别原核基因的启动子。
因此，在用原核细胞表达目的基因（无论是真核基因还是原核基因）时，一般应使用原核启动子。
原核基因的mRNA含有SD序列，启动蛋白质的合成。
而在真核基因上则缺乏该序列。
因此，一些商品化原核表达载体上设计有SD序列，以方便真核基因的表达。
原核细胞没有mRNA转录后加工的能力。
因此，在原核细胞中表达真核基因时，应使用cDNA 为目的基因。
原核细胞缺乏真核细胞对蛋白质进行翻译后加工的能力。
如表达产物的功能和蛋白质的糖基化、高级结构的正确折叠有关，必须慎重使用原核表达系统。
外源基因在大肠杆菌中高效表达时，表达产物往往在胞浆聚集，形成均一密度的包涵体。
包涵体的形成有利于保护表达产物不被胞内的蛋白酶降解，而且可以通过包涵体和胞内其他蛋白质密度不同来纯化包涵体蛋白。
但包涵体蛋白不具有该蛋白的所有生物学活性，往往需要通过变性复性的方法恢复活性，有时只能回复部分活性。
（3）蛋白质在原核细胞表达的调控启动子是转录水平调控的主要因素。
根据启动子起始mRNA合成效率的不同，可分为强、弱启动子，但是启动子的强弱是相对于不同基因而言的。
一、DNA提取1、实验原理通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。
在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。
十二烷基肌酸钠、十六烷基三甲基溴化铵(简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。
再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。
上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。
二、RNA提取1、实验原理Trizol试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂,在匀浆和裂解过程中,能在破碎细胞、降解蛋白质和其它成分,使蛋白质与核酸分离,失活RNA酶,同时能保持RNA的完整性。
在氯仿抽提、离心分离后,RNA处于水相中,将水相转管后用异丙醇沉淀RNA2、操作步骤1、取植物嫩叶,液氮研磨,每1.5ml tube分装0.1克样品;2.每管加入0.5ml Trizol液,迅速混匀,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
3、室温下静置5~10分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离4、加入O.5mI的氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒,室温静置5分钟5、10000r/min离心10分钟6、取上清液(水相)转入一新的离心管,加入等体积异丙醇,室温放置10分钟,10000r/min离心10分钟。
7、弃去上清液,加入至少1ml的70乙醇,涡旋混匀,4℃下7500r/min离心5分钟。
8、小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5—10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度。
然后将RNA溶于TE或DEPC处理过的水中,必要时可55℃—60℃水溶10分钟。
用大肠杆菌快速检测植物功能基因的研究北京五中分校李思佳指导教师韩竹戴毅新【摘要】大肠杆菌是基因工程研究中最常用的原核表达宿主系统。
大肠杆菌表达体系与植物表达体系相比具有培养条件简单，生长周期短，操作简便等优点。
将植物基因分别转化大肠杆菌表达体系和植物表达体系，并在胁迫培养基中进行功能验证，分析结果表明大肠杆菌表达体系具有与植物表达体系相似的作用。
【关键词】大肠杆菌、基因分离鉴定、基因表达、功能验证、胁迫【前言】一、问题的提出生物课上老师讲到细菌的用途和危害时，同学们自己归纳出了很多细菌的危害，如可以引发人和动物的肺炎、腹泻、败血症、霍乱和肺结核等疾病；植物的叶斑病和萎蔫等。
细菌的益处是可以制酒、酱油、醋，还可以利用细菌发电。
老师引导我们说：细菌（如大肠杆菌）还有很多用途，同学们课下可以查找一些资料，做一些实验探究。
于是，我就查找了相关资料，了解到大肠杆菌是基因工程研究中最常用的原核表达宿主系统。
国内有研究人员利用这个原核表达体系筛选出了植物的抗旱基因。
那么这个体系除此之外还有哪些作用呢？这个体系与植物表达体系相比较具有哪些特点？带着这些疑问，在老师和家长的帮助鼓励下，我翻阅了相关书籍，从大肠杆菌的胁迫培养条件及体系开始进行了研究。
二、研究背景及目前国内外研究和应用现状大肠杆菌属原核生物。
细胞呈杆状，直径约1微米，长约2微米，两端钝圆，周身具鞭毛，可运动。
革兰氏染色为阴性，不形成芽孢。
在固体培养基生长的菌落为圆形，白色或黄白色，光滑而具闪光，低平或微凸起，边缘整齐。
最适条件下培养20分钟可繁殖1代。
大肠杆菌是人和温血动物肠道内普遍存在的细菌，是粪便中的主要菌种。
一般生活在人的大肠中并不致病，但偶尔侵入到阑尾、胆囊、腹腔或泌尿系统时，可发生炎症。
在工业生产中，大肠杆菌可用以制备L-门冬酰胺酶，此酶是治疗白血病效果较好的一种药物。
在水质监测方面，根据其有无及其数量多少，可作为检测水质状况和污染程度的重要指标。
大肠原核表达大肠原核表达是一种常用的蛋白质表达系统，广泛应用于生物医学研究和生物工程领域。
大肠杆菌是最常用的宿主细胞，其原核表达系统具有高效、简便、经济的特点，因此被广泛应用于蛋白质的大规模表达和纯化。
大肠原核表达系统的基本原理是将目标基因插入到原核表达载体中，并将该载体转化到宿主细胞中。
在宿主细胞内，目标基因会受到宿主细胞的转录和翻译机制的调控，从而实现目标蛋白质的表达。
大肠原核表达系统的优势之一是宿主细胞的生长速度快，表达量高，适合大规模表达目标蛋白质。
此外，大肠原核表达系统还可以通过调节宿主细胞的生长条件和表达条件来实现蛋白质的高效表达。
大肠原核表达系统的关键步骤包括：选择合适的表达载体、构建重组载体、转化宿主细胞、筛选阳性克隆、培养大肠杆菌、诱导蛋白质表达、纯化目标蛋白质等。
其中，选择合适的表达载体是非常重要的一步。
常用的表达载体包括质粒和噬菌体。
质粒是一种环状DNA分子，可以在细胞内自主复制和表达目标基因。
噬菌体则是一种寄生菌体，可以在宿主细胞内复制和表达目标基因。
根据需要选择合适的表达载体，可以实现不同类型蛋白质的高效表达。
另外，构建重组载体也是大肠原核表达系统中的重要步骤。
在构建重组载体时，需要将目标基因插入到载体的适当位置，并确保其与载体的连接正确。
常用的方法包括限制性内切酶切割、连接酶法和PCR扩增法等。
通过这些方法，可以将目标基因插入到载体中，并确保其正确复制和表达。
转化宿主细胞是大肠原核表达系统中的关键步骤之一。
转化是指将重组载体转入到宿主细胞中，并使其在细胞内复制和表达。
常用的转化方法包括热激转化法、电穿孔法和化学转化法等。
通过这些方法，可以将重组载体转入到大肠杆菌中，并使其在细胞内复制和表达。
筛选阳性克隆是大肠原核表达系统中的另一个重要步骤。
由于转化后的宿主细胞中可能存在非重组或空载体，因此需要进行筛选来寻找阳性克隆。
常用的筛选方法包括抗生素筛选法、荧光筛选法和酶活性筛选法等。
原核表达步骤总结原核表达步骤原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋⽩，然后进⾏蛋⽩纯化。
本实验⽅案的前提是，⽬的基因已克隆到载体，并已转进⼊JM109菌株中。
1．鉴定⽬的蛋⽩是否在⼤肠杆菌JM109或BL21中⼤量表达（1）制样1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加⼊0.7ul Amp（100mg/mL），37o C200r/min摇床培养，过夜活化。
2. 以1：50⽐例（200ul），将活化的过夜培养物加⼊10mL LB液体培养基中，加⼊10uLAmp（100mg/ml），37o C200r/min 摇床扩⼤培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使⼤肠杆菌处于最适合表达外源蛋⽩的⽣长状态。
(⼀般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第⼀次实验时需要确定这个最佳时间)3. 从10ml扩⼤培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空⽩对照（CK），其余7ml菌液加⼊7ul IPTG（储存浓度为0.5mol/l），使IPTG 终浓度达到0.5mmol/l。
以200r/min的转速，37o C摇床培养3h。
4. 以5000r/min离⼼2min收集菌体，倾倒上清，每个离⼼管收集3ml培养物。
5. 加⼊1ml dH2O，将管底沉淀⽤振荡器打散以充分洗涤，8000r/min 离⼼2min，倾倒上清。
6. 重复步骤5。
将离⼼管中的⽔倒⼲净。
（⼆）菌落SDS-PAGE1. 在收集的菌体中加⼊200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量，⼀般200ul⽐较合适)。
⽤漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。
2. 将样品于100℃恒温加热器上开盖加热10min（Marker也要加热）。
样品凉后，12000r/min离⼼3min，取每管的上清点样。
大肠原核表达【实用版】目录1.大肠杆菌原核表达系统简介2.大肠杆菌原核表达的优势3.大肠杆菌原核表达的过程4.大肠杆菌原核表达的应用领域5.大肠杆菌原核表达的展望正文一、大肠杆菌原核表达系统简介大肠杆菌原核表达系统是一种利用大肠杆菌进行蛋白质表达的技术手段。
在这个系统中，外源基因被插入到大肠杆菌的表达载体中，通过诱导剂的作用，使大肠杆菌表达出目标蛋白质。
这种表达方式具有高效、快速、简单等优点，因此在生物技术领域得到了广泛的应用。
二、大肠杆菌原核表达的优势1.高表达水平：大肠杆菌具有较高的表达水平，能够快速产生大量目标蛋白质。
2.表达速度快：大肠杆菌原核表达系统具有较快的表达速度，通常在几小时内即可完成表达。
3.简单易操作：大肠杆菌原核表达系统操作简单，不需要复杂的实验设备和技术，适合实验室和工业生产。
4.低成本：大肠杆菌原核表达系统成本较低，有利于降低生产成本和研究投入。
三、大肠杆菌原核表达的过程大肠杆菌原核表达的过程主要包括以下几个步骤：1.构建表达载体：将目标基因插入表达载体中，形成重组表达载体。
2.转化大肠杆菌：将重组表达载体转化到大肠杆菌中，使大肠杆菌具有表达目标蛋白质的能力。
3.诱导表达：通过添加诱导剂，诱导大肠杆菌表达目标蛋白质。
4.收集和纯化蛋白质：从大肠杆菌中收集和纯化表达的蛋白质。
四、大肠杆菌原核表达的应用领域大肠杆菌原核表达系统在多个领域都有广泛应用，包括生物制药、生物材料、生物能源等。
例如，利用大肠杆菌原核表达系统生产重组蛋白、酶、抗体等生物制品，以及生产生物降解材料、生物燃料等。
五、大肠杆菌原核表达的展望随着科学技术的发展，大肠杆菌原核表达系统在生物技术领域将发挥更大的作用。
未来，该技术将在提高表达水平、缩短表达时间、降低生产成本等方面取得更多突破，以满足不断增长的生物产业需求。
原核表达操作步骤及注意事项时间：2010-03-03 14:05:01 来源：作者：点击：1046次将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中，0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
浅谈原核表达的技巧摘要：原核表达是表达外源基因常用的方法，具有操作简单、快捷，需时较短，表达产量高，适合工业化等优点。
本文作者根据自己的实践经验，总结了原核表达的一些技巧。
关键词：原核表达表达载体限制性内切酶将植物、动物、微生物等的目的基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下优点：易于生长和控制；易于培养，实验耗费少；可选择多种大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒。
原核表达是近年来表达外源蛋白常用的方法，本文根据自己的实践经验，着重谈谈对原核表达中的技巧问题。
一、原核表达一般程序表达前准备-获得目的基因-构建含目的片段的表达载体（测序验证）-转化表达宿主菌-诱导靶蛋白的表达-表达蛋白的分析。
二、原核表达中各操作步骤的关键因素及技巧1.表达前的准备要素：原核表达注重表达前对目的片段、表达载体及表达菌株的分析、选择。
正所谓“磨刀不误砍柴功”，经过细致、周全的分析、准备、设计可带来较为顺当的实验，可免去许多不必要的麻烦。
（1）对表达载体的分析载体的选择：同样的载体，同样的系统，很可能表达这个蛋白表达量起高，但另外一个就是做不出来，所以表达载体的选择非常重要，没有万能的载体。
选择载体通常我们关心质粒上的几个功能组件及所带来的问题：是否为诱导表达型载体，启动子的强弱、多克隆位点、限制性内切酶的位置、终止密码子的有无及位置，融合Tag的有无，筛选报告基因的位置等。
所选载体一定要保持原来的遗传背景（有些载体经过多次交换已变异）。
选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑，如果为了方便纯化，可选择融合表达；如果为了获得天然蛋白，可选择非融合表达。
融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。
翻译的起始位点：要表达目的蛋白，在该基因的5’端必须有一起始位点，现在大部分的表达载体都提供起始位点，起始密码子与核糖体结合位点的距离都已被优化，一般情况下不需要自己再加，实际操作时要留意载体图谱上是否注明有起始密码子和终止密码子，如无，还得根据自己的实际情况加上。
植物基因在大肠杆菌中的原核表达
通过大肠杆菌表达目的基因大量获得重组蛋白是一个方便快捷的方法。
植物中克隆的目的基因被克隆到特异设计的质粒载体上，受噬菌体T7强启动子控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。
当需要表达蛋白时，在细菌培养基中加入IPTG来启动表达。
不同载体在邻近克隆位点处具有编码不同的多肽“标签”的序列，在定位、检测或纯化目的蛋白时提供方便。
以pET-32a(+)为例，介绍将目的基因克隆进载体并进行表达获得重组蛋白的过程，从而熟悉根据自己的要求采用不同的载体进行原核表达的全过程。
1.准备工作（试剂配置和器材准备）
1)操作流程示意图
主要步骤操作
①制备pET-32a(+)载体用限制性酶消化，去磷酸化后胶纯化回收
②制备插入DNA PCR装入质粒后进行限制性消化，再回收
③插入片段克隆到pET-32a(+)载体插入片段与pET连接，转化
④转化表达宿主菌BL21 转化带有T7RNA聚合酶基因的菌株
⑤诱导表达目的蛋白 SDS-PAGE，Western 印迹、定量分析确定目的蛋白
⑥放大试验纯化目的蛋白放大试验，制备粗提物，亲和纯化，切除融合标签
2)配制生长培养基如LB，和100mM IPTG,50μg/ml 卡那霉素存储液。
3)宿主菌的保存。
长期存放菌株和pET重组子应保存于甘油中。
4)感受态细胞的制备，参照其它试验手册。
2.操作步骤
[1] 制备载体
1）载体消化和胶纯化
3μg pET载体
3μl 10×限制性内切酶buffer
10-20U 两种酶（是否共用buffer; 酶体积不要超过反应体系的10%）
3μl 1mg/ml乙酰BSA（根据需要
补足水到30μl
2)37℃温浴2-4h
3)取3μl样品进行电泳检测消化反应进行的程度
4)消化完全后，加入0.05U小牛碱性磷酸酶，37℃ 30min
5)全部样品在1%琼脂糖胶上电泳，切带按照胶回收试剂盒说明回收目标片段。
6)-20℃保存备用。
[2]制备插入片段
限制性消化和胶纯化是制备插入片段的常规方法。
一般先用PCR扩增带酶切位点的目标基因，克隆进T－载体，然后用与消化载体相同的内切酶进行消化和胶回收。
但在PCR过程中，需要减少突变的发生，可采用高保真酶，尽量减少PCR循环次数，增加模板和引物的浓度。
[3]在pET32a载体中插入片段
连接反应
2μl 10×连接buffer
2-5μl 50ng/μl 预制的pET32a载体
1μl T4连接酶
5-7μl 预制目标基因插入片段
加水到20μl，枪头混匀，16℃反应2h－过夜
[4]转化
转化方法同T－载体转化大肠杆菌DH5α一样，既可转化BL21也可转化DH5α，若转化DH5α，需要重新抽提质粒，再转化BL21。
筛选LB平板需含50μg/μl 卡那霉素。
[5]pET重组子鉴定
如果亚克隆成功，阳性菌落数远大于阴性菌落。
检验转化子的方法很多，包括PCR、质粒抽提及酶切分析、测序，体外转录和翻译。
[6]DE3溶原菌的诱导表达
（1）、从新鲜的划线平板中挑取单克隆到50ml含50μg/μl 卡那霉素的液体培养基中，37℃培养至OD600为0.4-1。
（2）、培养基中加入100mMIPTG至终浓度为0.4mM（T7启动子）或1 mM（T7lac启动子），继续培养2-3小时。
（3）、将摇瓶置于冰上5min，5000g 4℃离心5min收集菌体。
（4）、重悬细胞于0.25倍体积预冷的20mMTris-HCl （pH8.0）中，离心。
（5）、除去上清，菌体保存于-70℃或继续纯化。
[7]SDS-PAGE进行目标蛋白质分析
（1）、机械破碎细胞。
一般用弗氏压碎法或超声波处理。
（2）、裂解液14000g离心10min，分离可溶和不溶部分。
（3）100μl可溶上清中加入100μl 4×SDS上样buffer和水。
85℃迅速加热3min使蛋白变性，然后上样进行SDS-PAGE分析，观察蛋白表达。
（4）若目标蛋白在不溶部分中，需进行包涵体纯化。
750μl20mMTris-HCl,pH7.5重悬沉淀，离心10000g5min,除去上清重复洗涤。
然后1.5ml 1%SDS上样buffer中重悬沉淀，重复（3）的步骤进行SDS-PAGE分析。
3.总结（注意事项）
(1)所有操作尽量在冰上操作，以避免蛋白质发生变性；
(2)根据自己的需要选择不同的表达载体，并注意不同的表达载体上的融合标签和携带的抗性基因，其中有些标签是可以去除的。
(3)构建好的载体最好进行测序验证，保证读码框正确，即没有移码。
(4)长期保存的pET重组子在高浓度甘油（19%）中会导致质粒不稳定。
(5)T7lac启动子是严谨启动子，IPTG诱导时可以优化最佳浓度（25uM-1mM之间）使目的蛋白达到最佳的活性和溶解性。
(6)37℃生长常常会使一些蛋白累积形成包涵体，而30℃生长则可能产生可溶的和有活性的蛋白。
在某些情况下，低温（15－20℃）延长诱导时间（过夜）可以使溶解性蛋白的产量达到最大。
(7)进行SDS-PAGE分析时，需优化电泳上样体积。
