实验六植物抗氧化酶活性的测定

一、实验目的1. 探究玉米中的抗氧化成分及其活性。

2. 评估玉米提取物的抗氧化能力。

3. 分析玉米提取物的抗氧化机制。

二、实验材料与仪器材料：- 新鲜玉米（品种：黄玉米）- 无水乙醇- 超声波清洗器- 离心机- 721型分光光度计- 抗氧化活性测定试剂盒仪器：- 电子天平- 超声波处理仪- 恒温水浴锅- 移液器- 试管三、实验方法1. 玉米提取物的制备：- 将新鲜玉米去皮去须，洗净后切成小块。

- 使用无水乙醇对玉米进行超声波提取。

- 提取液经离心后得到玉米提取物。

2. 抗氧化活性测定：- 采用抗氧化活性测定试剂盒对玉米提取物进行活性测定。

- 依据试剂盒说明书进行操作，测定玉米提取物的抗氧化活性。

3. 抗氧化机制分析：- 通过自由基清除实验（DPPH自由基清除实验、超氧阴离子自由基清除实验等）和抗氧化酶活性测定（超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等）来分析玉米提取物的抗氧化机制。

四、实验结果1. 玉米提取物的制备：- 通过超声波提取法，成功制备了玉米提取物。

2. 抗氧化活性测定：- 玉米提取物的抗氧化活性测定结果显示，其DPPH自由基清除率可达70%以上，超氧阴离子自由基清除率可达60%以上。

3. 抗氧化机制分析：- DPPH自由基清除实验结果表明，玉米提取物对DPPH自由基具有较强的清除作用。

- 超氧阴离子自由基清除实验结果表明，玉米提取物对超氧阴离子自由基具有一定的清除作用。

- SOD、GSH-Px活性测定结果显示，玉米提取物能够提高细胞内SOD、GSH-Px活性，从而清除自由基，发挥抗氧化作用。

五、讨论1. 玉米中含有丰富的抗氧化成分，如多酚、黄酮类化合物等，这些成分具有清除自由基、抗氧化、抗炎等作用。

2. 通过超声波提取法，可以有效地提取玉米中的抗氧化成分，提高提取物的抗氧化活性。

3. 玉米提取物对DPPH自由基和超氧阴离子自由基具有较强的清除作用，表明其具有较强的抗氧化活性。

植物抗氧化酶的活性测定1植物预处理将植物根和shoots（特指陆生植物所有地上的部分。

少数在地下生长；包括茎、叶、花、果、种子等等）分别在液氮中冷冻，用预冷的研钵和液氮使样本在不含1,4－二硫苏糖醇的QB bufer中形成均质[用于SOD、CAT和GST测定]。

对于GR检测，每克组织添加50mg聚乙烯基吡咯烷酮。

粗匀浆在4℃下15000 g离心15min，将上清液置于−20℃下冷冻。

2活性测定以牛血清白蛋白为标准，采用布拉德福德Bradford法（考马斯亮蓝法）测定蛋白浓度。

考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程：该方法不适用于小分子碱性多肽的定量测定，如核糖核酸酶或溶菌酶。

去污剂的浓度超过0.2%影响测定结果。

如TritonX-100、SDS、NP-40等。

1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至200ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定；2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。

如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。

通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线；3．将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同（最好用PBS）；4．按1：4用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去；5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。

染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。

注意，显色反应不得超过30min；6．根据标准曲线计算待测样本的浓度（缺点，线性拟合效果不好）。

注：考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。

待一两周左右，皮屑细胞自然衰老即可脱落。

2.1SOD（超氧歧化酶，具有抗氧化和抗衰老的作用，其作用机理主要是清除对机体有害的超氧阴离子自由基(O2-)）活性的测定参照Roth和Gilbert的方法。

植物组织中丙二醛（MDA）含量的测定一、原理植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。

MDA从膜上产生的位置释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，从而丧失功能，还可使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。

因此，MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。

丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3，5，5—三甲基恶唑-2，4。

二酮)，其最大吸收波长在532nm。

但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，但532nm处也有吸收。

植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA—TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。

低浓度的铁离子能够显著增加TBA与蔗糖或MDA显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、MDA与TBA显色反应中需一定量的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为每克千重100—300ug·g-1，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3+的终浓度为0．5umol·L-1。

二、方法直线回归法MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下的吸光度值为零。

不同浓度的蔗糖(0—25mmol·L-1)与TBA显色反应产物在450nm的吸光度值与532nm和600nm处的吸光度值之差成正相关，配制一系列浓度的蔗糖与TBA显色反应后，测定上述三个波长的吸光度值，求其直线方程，可求算糖分在532nm处的吸光度值。

UV-120型紫外可见分光光度计的直线方程为：Y532＝-0．00198十0．088D450 (44—1)D450、D532、D600分别代表450、532和600nm波长下的吸光度值。

研究生植物生理学实验教案教师：***农学院生物技术系实验一 植物抗氧化酶活性的测定植物抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD ）、过氧化氢酶（CAT ）、过氧化物酶（POD ）等。

它们普遍存在于植物的各种组织中，可以通过催化植物体内的活性氧，防止发生氧化反应。

所以抗氧化酶活性与植物的代谢强度及逆境适应能力有密切关系，经常被用来衡量植物的抗性强弱和衰老程度。

一、超氧化物岐化酶活性测定超氧物歧化酶（SOD ）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基（•2O ）的酶，它催化下列反应：2反应产物H 2O 2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。

因此SOD 有保护生物体免受活性氧伤害的能力。

已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。

【原理】本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有可氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生•2O ，•2O 可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲。

后者在560nm 处有最大吸收，而SOD 可清除•2O 从而抑制了甲的形成。

于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。

一个酶活性单位定义为将NBT 的还原抑制到对照一半（50％）时所需的酶量，据此可以计算出酶活性大小。

【仪器与用具】高速台式离心机；分光光度计；微量进样器；荧光灯（反应试管处光照强度为4000lx ）；试管数支；黑色硬纸套。

【试剂】1．50mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）。

2．提取介质50mmol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1％聚乙烯吡咯烷酮）。

3．130mmol/L 甲硫氨酸（Met ）溶液：称取1.939 9g Met 用磷酸缓冲液定容至100ml 。

4．750μmol/L 氮蓝四唑（NBT ）溶液：称取61.33mg NBT 用磷酸缓冲液定容至100ml ，现配先用，避光保存。

植物组织SOD 活性测定一、实验目的1、了解还原法测定抗氧化酶活性的原理与方法。

2、熟悉植物叶片ROS 清除机制。

二、实验原理植物在受到光、温度、干旱、盐、碱等胁迫时会产生活性氧和自由基，而活性氧和自由基会抑制植物生长、损伤细胞结构和功能、使膜脂过氧化、破坏生物大分子的结构功能等。

植物本身也会抵抗这种逆境，其自身的酶系统和非酶系统会产生相应的物质以清除活性氧和自由基，酶系统：超氧化物歧化酶（SOD ），超氧化物酶（POD ），过氧化氢酶（CAT ），抗坏血酸过氧化物酶（APX ）；非酶系统：维生素系列（Vce ），谷胱甘肽（GSH ）。

核黄素在照光条件下会将氧气还原为超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基与NBT 作用会产生蓝色的甲䐶，而SOD 会抑制超氧阴离子自由基与NBT 的反应。

三、材料未处理的小麦叶片；0℃处理小麦叶片3-5min 。

四、试验步骤1、酶液提取：称量小麦叶片（ck 、0℃）各0.5g ，预冷研钵，加2ml 预冷提取介质（磷酸缓冲液），冰态研匀浆，介质冲洗研钵2-3次，定容10ml 。

取5ml ，两管平衡（0.01g ），对角线放置，4℃离心10min ，取上清液（粗酶液）。

2、显色反应取4支专用试管，按下表加入试剂 1（As1） 2（As2） 3（照光） 4（不照光，调零）buffer1.51.51.51.5OH O H O O H O H O H OH O H O O POD CAT SOD222222222222−−→←+−−→−→→→•−−−→−•-met 0.3 0.3 0.3 0.3 NBT 0.3 0.3 0.3 0.3 EDTA-Na 2 0.3 0.3 0.3 0.3 20uml 核黄素 0.3 0.3 0.3 0.3 粗酶液 0.1 0.1 0 0 ddH 2O0.50.50.60.6混匀后4号罩黑布，其它各管在4000lux 光下反应20min （25-30℃）根据酶活调整反应时间，反应结束后遮黑布终止反应，4号作空白调零，560nm 测吸光值。

抗氧化酶测定实验方法抗氧化酶是一类能够抵御细胞对氧自由基的毒性的酶。

抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等。

这些酶在细胞内能够将有害的氧自由基转化为无害的化合物，从而起到保护细胞免受氧自由基反应的毒性作用。

因此，测定抗氧化酶的活性能够反映细胞对氧自由基的抵御能力，对研究氧化应激、疾病发生机制等具有重要意义。

以下是一种常用的抗氧化酶测定方法的详细步骤：实验材料和试剂：1.组织样本或细胞培养物2.生理盐水（PBS）3. 超氧化物歧化酶(Abfrontier, LF-MA0011, 200U/mg, 冻干粉)4. 过氧化氢酶(Sigma, P2927, ≥2,000,000 units/mg protein, 溶于水)5. 谷胱甘肽过氧化物酶(Sigma, G5911, ≥300 units/mg protein,冻干粉)6. 过硫酸铵（Sigma, A9294）7.磷酸盐缓冲液(pH7.4，0.1M)8.丙酮9. 硫酸(Sigma, 1.84 M)10. 精氨酸(Sigma, A8094)11. 苯胂(Sigma, A8731)12. 硝基蓝色素(Sigma, N-5511)14. 高锰酸钾(Sigma, S2547)16. 硝基咪唑(NBT，Solarbio, S8190)17. EDTA二钠(Sigma, E6635)18. BSA(Sigma, A7906)19. 氯化三联氨(Sigma, A2251)20. Tris缓冲液(pH 8.0，0.1M)21. 高吉人(ABClonal, HRP-6002，5,000 IU/mg, 冻干粉)23.氯仿24.醋酸乙酯26.乙酸钠28. 脑磷脂(纯度≥98%，Shenggong, 1003J)30.SDS-试剂盒步骤：1.制备样本：将组织样本或细胞培养物均匀取样，使用PBS洗涤并平均分配到多个离心管中。

抗氧化酶活性等测定方法叶绿体得提取一、试剂配置1、PBS提取液:每L水依次加入MES(195、2×0、05=9、76g)、山梨糖醇(0、33×182、2=60、126g)、NaCl(0、010×58、5=0、585g)、MgCl(0、002×95=0、19g)、EDTA(292、25×0、002=0、5845g)、KH2PO4(200×0、0005=0、1g);使用时加入ASA-Na(198、1×0、002=0、3962g);2、悬浮液:将PBS提取液中得MES换为238、3×0、05=11、915g得HEPES(238、3×0、05=11、915g);3、80%Percol:80ml原液+20ml水;40%Percol:40ml原液+60ml 水;实际配制:PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),悬浮液100ml(3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml);80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml、(3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml)二、提取步骤1、10g鲜样加20ml提取PBS(50mM MES PH6、1,含0、33M 山梨糖醇,10mM NaCl,2mM MgCl2,2mM EDTA,0、 5 mMKH2PO4,2mM ASA-Na,ASA-Na使用前现配现加)2、快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,4层纱布过滤,去除残渣(注意过滤时不可用力挤压,以免叶绿体膜破碎)3、滤液2000g 3min,小心倒出上清液,将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预定值(水平转头,加速度调到9),约经30s后很快使其下降停止,整个离心持续大约2-3min左右完成;4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物;5、用1ml悬浮液(50mM HEPES pH 7、6,含0、33 mM山梨糖醇,10mM NaCl,2mM MgCl2,2mM EDTA,0、5 mMKH2PO4,2mM ASA-Na,ASA-Na使用前现配现加)将沉淀悬浮,在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷,或者用手握住离心管在冰块之间搅动,使叶绿体由于震动分散开来,不要用棉球吸滤,以防被膜压破。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四瞠光化还原法）1、试剂得配制（1）0、05mol/L 磷酸缓冲液（PBS,pH7、8）:A 母液:0、2mol/L 磷酸氢二钠溶液：取 Na2HPO4- 12H2O（分子量 358、14）71.7g;B母液:0、2mol/L磷酸二氢钠溶液:取NaH^POQHO分子量156、01）31.2g。

分别用蒸馅水左容到1000ml。

0、05mol/L PBS（pH7、8）得配制:分别取 A 母液（Na2HPO4） 228,75ml,B 母液（NaH2PO4）21、 25ml,用蒸餾水左容至lOOOmL 1\ 1佟PVP（宗W毗.；「.丨参考文献:李合生主编:植物生理生化实验原理与技术、髙等教育出版社,2000:267〜268。

（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液:取1、39典Met用磷酸缓冲液（pH7、8）定容至lOOmL网h 说定容到100ML我也不懂。

拜托（3）100 11 mol/L EDTA-Na：冷m（）3721g EDTA—Nw . 000ml；（4）100H M核黄素溶液:取0、0075g核黄素用:定容至100ml,避光保存，门汀汁.丨稀释10倍（5）750 i* mol/L気伽喙NBT）溶液霹取O.O6133g NBT川缓冲液定容至UJOml避光保存；酶液制备:収定沈叶Mi物叶川视禹耍从丿；门脉）（）巡J厲冷彳抑：.2ml磷內冲液在冰浴卜研磨成浆，加缓冲液使终体枳为10ml.取5ml于10000r/min I、•离心lOmin. hin 液即为SOD粗提液。

提取酶液时如何保存;如果没有测完得需要放在4匸得冰卷叽2、酶活性测定2.显色反应取试管（要求透明度好）5支,3支为样品测左管,1支为对照管，另外1支作为空白，按表39-1加入各溶液。

混匀后将空白管置暗处，其它各管于40001X H光灯下反应20min（要求各管受光情况一致, 反应室得温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）。

叶绿体的提取一、试剂配置1、PBS提取液：每L水依次加入MES(195.2×0.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33×182.2=60.126g)、NaCl （0.010×58.5=0.585g）、MgCl（0.002×95=0.19g）、EDTA（292.25×0.002=0.5845g）、KH2PO4（200×0.0005=0.1g）；使用时加入ASA-Na（198.1×0.002=0.3962g）;2、悬浮液：将PBS提取液中的MES换为238.3×0.05=11.915g的HEPES（238.3×0.05=11.915g）；3、80%Percol：80ml原液+20ml水；40%Percol：40ml原液+60ml水；实际配制：PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),悬浮液100ml（3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml）;80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.（3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml）二、提取步骤1、10g鲜样加20ml提取PBS（50mM MES PH6.1，含0.33M山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）2、快速研磨，使叶片碎成绿豆粒大小，4层纱布过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体膜破碎）3、滤液2000g 3min，小心倒出上清液，将离心管放入离心机后，使离心机的加速很快上升到预定值(水平转头，加速度调到9)，约经30s后很快使其下降停止，整个离心持续大约2-3min左右完成；4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物；5、用1ml悬浮液（50mM HEPES pH 7.6，含0.33 mM山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）将沉淀悬浮，在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷，或者用手握住离心管在冰块之间搅动，使叶绿体由于震动分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。