实验六++植物抗氧化酶活性的测定

植物组织中丙二醛（MDA）含量的测定一、原理植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。

MDA从膜上产生的位置释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，从而丧失功能，还可使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。

因此，MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。

丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3，5，5—三甲基恶唑-2，4。

二酮)，其最大吸收波长在532nm。

但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，但532nm处也有吸收。

植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA—TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。

低浓度的铁离子能够显著增加TBA与蔗糖或MDA显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、MDA与TBA显色反应中需一定量的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为每克千重100—300ug·g-1，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3+的终浓度为0．5umol·L-1。

二、方法直线回归法MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下的吸光度值为零。

不同浓度的蔗糖(0—25mmol·L-1)与TBA显色反应产物在450nm的吸光度值与532nm和600nm处的吸光度值之差成正相关，配制一系列浓度的蔗糖与TBA显色反应后，测定上述三个波长的吸光度值，求其直线方程，可求算糖分在532nm处的吸光度值。

UV-120型紫外可见分光光度计的直线方程为：Y532＝-0．00198十0．088D450 (44—1)D450、D532、D600分别代表450、532和600nm波长下的吸光度值。

研究生植物生理学实验教案教师：***农学院生物技术系实验一 植物抗氧化酶活性的测定植物抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD ）、过氧化氢酶（CAT ）、过氧化物酶（POD ）等。

它们普遍存在于植物的各种组织中，可以通过催化植物体内的活性氧，防止发生氧化反应。

所以抗氧化酶活性与植物的代谢强度及逆境适应能力有密切关系，经常被用来衡量植物的抗性强弱和衰老程度。

一、超氧化物岐化酶活性测定超氧物歧化酶（SOD ）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基（•2O ）的酶，它催化下列反应：2反应产物H 2O 2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。

因此SOD 有保护生物体免受活性氧伤害的能力。

已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。

【原理】本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有可氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生•2O ，•2O 可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲。

后者在560nm 处有最大吸收，而SOD 可清除•2O 从而抑制了甲的形成。

于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。

一个酶活性单位定义为将NBT 的还原抑制到对照一半（50％）时所需的酶量，据此可以计算出酶活性大小。

【仪器与用具】高速台式离心机；分光光度计；微量进样器；荧光灯（反应试管处光照强度为4000lx ）；试管数支；黑色硬纸套。

【试剂】1．50mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）。

2．提取介质50mmol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1％聚乙烯吡咯烷酮）。

3．130mmol/L 甲硫氨酸（Met ）溶液：称取1.939 9g Met 用磷酸缓冲液定容至100ml 。

4．750μmol/L 氮蓝四唑（NBT ）溶液：称取61.33mg NBT 用磷酸缓冲液定容至100ml ，现配先用，避光保存。

植物组织SOD 活性测定一、实验目的1、了解还原法测定抗氧化酶活性的原理与方法。

2、熟悉植物叶片ROS 清除机制。

二、实验原理植物在受到光、温度、干旱、盐、碱等胁迫时会产生活性氧和自由基，而活性氧和自由基会抑制植物生长、损伤细胞结构和功能、使膜脂过氧化、破坏生物大分子的结构功能等。

植物本身也会抵抗这种逆境，其自身的酶系统和非酶系统会产生相应的物质以清除活性氧和自由基，酶系统：超氧化物歧化酶（SOD ），超氧化物酶（POD ），过氧化氢酶（CAT ），抗坏血酸过氧化物酶（APX ）；非酶系统：维生素系列（Vce ），谷胱甘肽（GSH ）。

核黄素在照光条件下会将氧气还原为超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基与NBT 作用会产生蓝色的甲䐶，而SOD 会抑制超氧阴离子自由基与NBT 的反应。

三、材料未处理的小麦叶片；0℃处理小麦叶片3-5min 。

四、试验步骤1、酶液提取：称量小麦叶片（ck 、0℃）各0.5g ，预冷研钵，加2ml 预冷提取介质（磷酸缓冲液），冰态研匀浆，介质冲洗研钵2-3次，定容10ml 。

取5ml ，两管平衡（0.01g ），对角线放置，4℃离心10min ，取上清液（粗酶液）。

2、显色反应取4支专用试管，按下表加入试剂 1（As1） 2（As2） 3（照光） 4（不照光，调零）buffer1.51.51.51.5OH O H O O H O H O H OH O H O O POD CAT SOD222222222222−−→←+−−→−→→→•−−−→−•-met 0.3 0.3 0.3 0.3 NBT 0.3 0.3 0.3 0.3 EDTA-Na 2 0.3 0.3 0.3 0.3 20uml 核黄素 0.3 0.3 0.3 0.3 粗酶液 0.1 0.1 0 0 ddH 2O0.50.50.60.6混匀后4号罩黑布，其它各管在4000lux 光下反应20min （25-30℃）根据酶活调整反应时间，反应结束后遮黑布终止反应，4号作空白调零，560nm 测吸光值。

叶绿体的提取一、试剂配置1、PBS提取液：每L水依次加入MES(195.2×0.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33×182.2=60.126g)、NaCl （0.010×58.5=0.585g）、MgCl（0.002×95=0.19g）、EDTA（292.25×0.002=0.5845g）、KH2PO4（200×0.0005=0.1g）；使用时加入ASA-Na（198.1×0.002=0.3962g）;2、悬浮液：将PBS提取液中的MES换为238.3×0.05=11.915g的HEPES（238.3×0.05=11.915g）；3、80%Percol：80ml原液+20ml水；40%Percol：40ml原液+60ml水；实际配制：PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),悬浮液100ml（3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml）;80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.（3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml）二、提取步骤1、10g鲜样加20ml提取PBS（50mM MES PH6.1，含0.33M山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）2、快速研磨，使叶片碎成绿豆粒大小，4层纱布过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体膜破碎）3、滤液2000g 3min，小心倒出上清液，将离心管放入离心机后，使离心机的加速很快上升到预定值(水平转头，加速度调到9)，约经30s后很快使其下降停止，整个离心持续大约2-3min左右完成；4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物；5、用1ml悬浮液（50mM HEPES pH 7.6，含0.33 mM山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）将沉淀悬浮，在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷，或者用手握住离心管在冰块之间搅动，使叶绿体由于震动分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。

抗氧化酶活性测定方法抗氧化酶是一类能够帮助生物体减轻或消除自由基对细胞和组织的损伤的酶。

其中三个主要的抗氧化酶分别是超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)。

测定这些抗氧化酶的活性可以帮助我们了解细胞和组织内抗氧化能力的变化，从而评估对抗氧化应激的能力。

以下是常用的测定这些抗氧化酶活性的方法。

1.NBT法：超氧化物歧化酶能够催化过氧化脱氢麦角酮（NBT）被还原成紫色水溶性产物，通过测定产物的吸光度来确定SOD的活性。

具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的NBT缓冲液。

（2）开始反应：置于适当的温度和时间下。

（3）停止反应：加入硝酸，停止NBT的还原反应。

（4）测定吸光度：使用分光光度计测量产生的相对吸光度。

2.氰化硝酸法：该方法是通过抑制SOD对自由基的清除作用，使过氧化物离子被产生，进而通过测定过氧化物离子的吸光度来间接测定SOD的活性。

具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的氰化钾和亚硝酸钠。

（2）开始反应：加入适量的氧化剂，使之和SOD反应生成过氧化物。

（3）测定吸光度：使用分光光度计测量过氧化物离子产生的相对吸光度。

1.亚硫酸盐法：过氧化物酶能够催化亚硫酸盐氧化成差二价铁离子，通过差二价铁离子与硫酸铵生成蓝色络合物来测定POD的活性。

具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的亚硫酸铵和硫酸。

（2）开始反应：加入适量的H2O2，使之和POD反应生成差二价铁离子。

（3）停止反应：加入硫酸铵，停止POD对H2O2的催化作用。

（4）测定吸光度：使用分光光度计测量产生的相对吸光度。

2.过氧化氢法：过氧化物酶能够催化过氧化氢分解成氧气和水，通过测定生成的O2的相对浓度来测定POD的活性。

具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的过氧化氢。

（2）开始反应：加入过氧化物酶，使之和过氧化氢反应。

抗氧化酶测定实验方法抗氧化酶是一类能够抵御细胞对氧自由基的毒性的酶。

抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等。

这些酶在细胞内能够将有害的氧自由基转化为无害的化合物，从而起到保护细胞免受氧自由基反应的毒性作用。

因此，测定抗氧化酶的活性能够反映细胞对氧自由基的抵御能力，对研究氧化应激、疾病发生机制等具有重要意义。

以下是一种常用的抗氧化酶测定方法的详细步骤：实验材料和试剂：1.组织样本或细胞培养物2.生理盐水（PBS）3. 超氧化物歧化酶(Abfrontier, LF-MA0011, 200U/mg, 冻干粉)4. 过氧化氢酶(Sigma, P2927, ≥2,000,000 units/mg protein, 溶于水)5. 谷胱甘肽过氧化物酶(Sigma, G5911, ≥300 units/mg protein,冻干粉)6. 过硫酸铵（Sigma, A9294）7.磷酸盐缓冲液(pH7.4，0.1M)8.丙酮9. 硫酸(Sigma, 1.84 M)10. 精氨酸(Sigma, A8094)11. 苯胂(Sigma, A8731)12. 硝基蓝色素(Sigma, N-5511)14. 高锰酸钾(Sigma, S2547)16. 硝基咪唑(NBT，Solarbio, S8190)17. EDTA二钠(Sigma, E6635)18. BSA(Sigma, A7906)19. 氯化三联氨(Sigma, A2251)20. Tris缓冲液(pH 8.0，0.1M)21. 高吉人(ABClonal, HRP-6002，5,000 IU/mg, 冻干粉)23.氯仿24.醋酸乙酯26.乙酸钠28. 脑磷脂(纯度≥98%，Shenggong, 1003J)30.SDS-试剂盒步骤：1.制备样本：将组织样本或细胞培养物均匀取样，使用PBS洗涤并平均分配到多个离心管中。

抗氧化酶活性等测定方法叶绿体得提取一、试剂配置1、PBS提取液:每L水依次加入MES(195、2×0、05=9、76g)、山梨糖醇(0、33×182、2=60、126g)、NaCl(0、010×58、5=0、585g)、MgCl(0、002×95=0、19g)、EDTA(292、25×0、002=0、5845g)、KH2PO4(200×0、0005=0、1g);使用时加入ASA-Na(198、1×0、002=0、3962g);2、悬浮液:将PBS提取液中得MES换为238、3×0、05=11、915g得HEPES(238、3×0、05=11、915g);3、80%Percol:80ml原液+20ml水;40%Percol:40ml原液+60ml 水;实际配制:PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),悬浮液100ml(3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml);80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml、(3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml)二、提取步骤1、10g鲜样加20ml提取PBS(50mM MES PH6、1,含0、33M 山梨糖醇,10mM NaCl,2mM MgCl2,2mM EDTA,0、 5 mMKH2PO4,2mM ASA-Na,ASA-Na使用前现配现加)2、快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,4层纱布过滤,去除残渣(注意过滤时不可用力挤压,以免叶绿体膜破碎)3、滤液2000g 3min,小心倒出上清液,将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预定值(水平转头,加速度调到9),约经30s后很快使其下降停止,整个离心持续大约2-3min左右完成;4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物;5、用1ml悬浮液(50mM HEPES pH 7、6,含0、33 mM山梨糖醇,10mM NaCl,2mM MgCl2,2mM EDTA,0、5 mMKH2PO4,2mM ASA-Na,ASA-Na使用前现配现加)将沉淀悬浮,在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷,或者用手握住离心管在冰块之间搅动,使叶绿体由于震动分散开来,不要用棉球吸滤,以防被膜压破。

叶绿体的提取一、试剂配置1、PBS提取液：每L水依次加入MES(195.2×0.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33×182.2=60.126g)、NaCl （0.010×58.5=0.585g）、MgCl（0.002×95=0.19g）、EDTA（292.25×0.002=0.5845g）、KH2PO4（200×0.0005=0.1g）；使用时加入ASA-Na（198.1×0.002=0.3962g）;2、悬浮液：将PBS提取液中的MES换为238.3×0.05=11.915g的HEPES（238.3×0.05=11.915g）；3、80%Percol：80ml原液+20ml水；40%Percol：40ml原液+60ml水；实际配制：PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),悬浮液100ml（3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml）;80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.（3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml）二、提取步骤1、10g鲜样加20ml提取PBS（50mM MES PH6.1，含0.33M山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）2、快速研磨，使叶片碎成绿豆粒大小，4层纱布过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体膜破碎）3、滤液2000g 3min，小心倒出上清液，将离心管放入离心机后，使离心机的加速很快上升到预定值(水平转头，加速度调到9)，约经30s后很快使其下降停止，整个离心持续大约2-3min左右完成；4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物；5、用1ml悬浮液（50mM HEPES pH 7.6，含0.33 mM山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）将沉淀悬浮，在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷，或者用手握住离心管在冰块之间搅动，使叶绿体由于震动分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。

叶绿体的提取一、试剂配置1、PBS提取液：每L水依次加入MES(195.2×0.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33×182.2=60.126g)、NaCl （0.010×58.5=0.585g）、MgCl（0.002×95=0.19g）、EDTA（292.25×0.002=0.5845g）、KH2PO4（200×0.0005=0.1g）；使用时加入ASA-Na（198.1×0.002=0.3962g）;2、悬浮液：将PBS提取液中的MES换为238.3×0.05=11.915g的HEPES（238.3×0.05=11.915g）；3、80%Percol：80ml原液+20ml水；40%Percol：40ml原液+60ml水；实际配制：PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),悬浮液100ml（3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml）;80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.（3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml）二、提取步骤1、10g鲜样加20ml提取PBS（50mM MES PH6.1，含0.33M山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）2、快速研磨，使叶片碎成绿豆粒大小，4层纱布过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体膜破碎）3、滤液2000g 3min，小心倒出上清液，将离心管放入离心机后，使离心机的加速很快上升到预定值(水平转头，加速度调到9)，约经30s后很快使其下降停止，整个离心持续大约2-3min左右完成；4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物；5、用1ml悬浮液（50mM HEPES pH 7.6，含0.33 mM山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）将沉淀悬浮，在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷，或者用手握住离心管在冰块之间搅动，使叶绿体由于震动分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。

抗氧化酶活性等测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法超氧化物歧化酶是一种重要的抗氧化酶，能够将超氧自由基（O2.-）转化为过氧化氢（H2O2），进而被谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）或过氧化物酶（CAT）降解。

测定SOD活性的方法有多种，其中最常用的方法包括：1.基于阻断亚硝酸胆红素还原的方法：该方法通过加氨基钠阻断细胞色素c还原作用，使亚硝酸胆红素还原成胆红素，从而测定SOD活性。

2.基于X射线辐照条件下还原亚硝酸胆红素的方法：这种方法利用X射线辐照生成O2.-，进而被SOD转化为H2O2、H2O2与亚硝酸胆红素反应生成亚硝酸盐，其紫红色可被光度计测定。

3.基于化学发光的方法：这种方法通过硝酸亚铁与亚硝酸盐反应生成亚铁络合物，发出化学发光信号。

该方法简单、灵敏度高，并可以自动化操作。

二、过氧化物酶（CAT）活性测定方法过氧化物酶是参与H2O2代谢的重要抗氧化酶。

常用的测定CAT活性的方法有：1.重铬酸钾（K2Cr2O7）比色法：该方法利用过氧化氢氧化重铬酸钾，从橙色转变为无色，通过比色计测定过量K2Cr2O7的消耗量计算CAT活性。

2.亚甲蓝法：这种方法利用过氧化氢氧化亚甲蓝生成显色产物，通过光度计测定产物的吸光度来评估CAT活性。

3.氨蓝法：这种方法是通过氨蓝还原过氧化氢产生的游离基离子，再与其他物质（如溴酚蓝）反应生成显色产物，通过比色计测定产物的吸光度来测定CAT活性。

三、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性测定方法谷胱甘肽过氧化物酶是参与氧化还原反应的重要酶。

目前常用的测定GSH-Px活性的方法有几种，包括：1.基于还原硒酸铁的方法：该方法利用GSH-Px催化还原硒酸铁成为亚硒酸铁，反应产物与硫代巴比妥酸钠反应生成巴比特酸，通过光度计测定巴比特酸的吸光度来评估GSH-Px活性。

2.比色法：这种方法通过巴比妥酸与反应产物反应生成巴比妥酸-丙二醛复合物，通过光度计测定复合物的吸光度来评估GSH-Px活性。