抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法79498

抗氧化酶测定实验方法抗氧化酶是一类酶系统，它能够抵御氧自由基的伤害，维持细胞内环境的稳定。

常见的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(Cat)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)等。

测定抗氧化酶活性能够评估抗氧化能力，进而为疾病的诊断和治疗提供参考。

以下是抗氧化酶测定的实验方法。

实验材料：1.磷酸盐缓冲液：Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH7-8)。

2.高速冰箱和离心机。

3. 0.1 mol/L L-酪氨酸盐酸缓冲液：将L-酪氨酸溶解于0.1 mol/L的盐酸溶液中，并加入0.5% (w/v) 卵白饼干碎片。

4.超氧化物解毒酶(SOD)标准品：如肝脏SOD标准品。

5.乙醇、乙醚、碘仿、硝酸等有机试剂。

6.2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-（二苯嘧啶)-2H-四唑(INT)。

实验步骤：1.组织预处理：取所需组织样品，酶解和离心得到提取液(组织块破碎并添加合适的缓冲液)，离心清除杂质得到上清液。

2. 蛋白质含量检测：根据Bradford法或Lowry法，测定上清液中蛋白质的含量。

3. 测定SOD活性：将上清液加入0.1 mol/L L-酪氨酸盐酸缓冲液，再加入0.5%的乙醇溶液，保护酪氨酸被SOD氧化，使其在酶作用下发生自动降解。

离心，取上清液。

在为反应液中加入INT（2.5 mmol/L），使之在SOD作用下发生氧化还原，反应生成紫色的一价酮衍生物。

在滤紙上滴加提取液，通过比色计测定OD值。

4. 测定Cat活性：将提取液加入3%的过氧化氢溶液并充分混合。

加入乙醚和碘仿的混合物，并离心。

提取水相层和乙醚层。

用硝酸溶液判断乙醚层中是否存在过氧化氢。

通过测定乙醚层吸收光谱的变化来测定Cat 活性。

5. 测定Gpx活性：加入适量的提取液到预先调配的反应体系中。

反应开始后，每2分钟测定OD值，记录10分钟之间的OD变化。

绘制OD值和反应时间的曲线，计算反应速率。

6.数据处理：根据测得的OD值和各反应时间点得到的反应速率，计算出抗氧化酶系数和活性。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）L磷酸缓冲液(PBS，：A母液：L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量）71.7g；B母液：L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

L PBS（）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) ，B母液(NaH2PO4) ，用蒸馏水定容至1000ml。

参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）甲硫氨酸溶液：取 Met用磷酸缓冲液（）定容至1000ml。

（3）30μM EDTA-Na2溶液：取用磷酸缓冲液定容至100ml。

（4）60μM核黄素溶液：取核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

（5）氮蓝四唑(NBT)溶液：取 NBT用PBS定容至100ml，避光保存。

酶液制备：取（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。

2、酶活性测定（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液，磷酸缓冲液，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。

（4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560(出现颜色即可测定)。

（5）酶活性计算：SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u）。

SOD，POD,CAT测定方法抗氧化酶活性的测定：（2.5g样）0.05mol/L磷酸缓冲溶液 (PBS)（pH=7.8）溶液的配制：65.5506g Na2HPO4·12H2O + 2.65285gNaH2PO4·2H2O, 定容到4L。

（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P134）。

取低温保存的鲜样，称2g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管，加入20ml浓度为0.05mol/L 磷酸缓冲溶液（pH=7.8）（最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟，上清液为粗酶液。

1超氧化物歧化酶（SOD）的测定：NBT(400ml)混合反应液:392mlPBS(Ph=7.8),+0.0206g NBT+ 0.776g甲硫酸铵+8ml核黄素溶液+0.4ml EDTA-Na溶液（100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素）。

（另配）100ml PBS溶液加EDTA-Na 3.7224gEDTA-Na测试时：取3ml反应液+0.05ml(根)或0.02 ml(叶)粗酶液，于光照培养箱中6-10分钟，OD650下测定吸光度。

2过氧化物酶（POD）的测定：0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)（pH=7.0）溶液的配制：10.9251g Na2HPO4·12H2O + 3.042975gNaH2PO4·2H2O,定容到1000ml。

0.3%H2O2溶液的配制：吸2.5ml 30%H2O2，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。

0.2%愈创木酚溶液的配制：称0.5g愈创木酚，用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)定容到250ml。

2ml 0.3%H2O2溶液 + 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液 + 1ml 0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS)+ 0.02ml？？（原来为0.01）酶液（根加0.05ml酶液）（对照用0.05mol/L磷酸缓冲溶液代替酶液）（做三个重复），记录470nm处OD降低速度。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。

（3）30μM EDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。

（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

（5）2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840g NBT用PBS定容至100ml，避光保存。

酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。

2、酶活性测定（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和30μl酶液于试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30μl PBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。

抗氧化物活性测定方法总结引言：抗氧化物活性测定在食品、医药、化妆品以及生命科学等领域具有重要应用。

目前，常用的抗氧化物活性测定方法主要包括化学法、生物法和物理法。

本文将对这几种方法进行总结。

一、化学法1.1.DPPH自由基法该方法是目前应用最广泛的抗氧化活性测定方法之一、通过DPPH自由基与抗氧化物发生反应，使DPPH自由基得以还原为无色溶液，测定溶液的吸光度来评估抗氧化活性。

1.2.ABTS自由基法该方法通过生成具有特定吸光度的ABTS自由基，评估抗氧化物对自由基的清除能力。

与DPPH自由基法相比，ABTS自由基法具有更高的灵敏度和稳定性。

1.3.羟自由基清除法该方法利用特定的化学反应，测定样品对羟自由基的清除能力，评估其抗氧化活性。

该方法适用于抗氧化物活性测定和体外抗氧化活性评价。

1.4.过氧化物清除法该方法测定样品对过氧化物的清除能力，通过测定生成的不稳定的自由基产物的分解速率，评估抗氧化活性。

该方法适用于测定生物样品的抗氧化活性。

二、生物法2.1.脂质过氧化抑制能力测定法该方法通过测定样品对脂质过氧化的抑制能力，评估其抗氧化活性。

常用的指标包括丙二醛生成量、硫代巴比妥酸反应物（TBA）生成量等。

2.2.DNA损伤保护能力测定法该方法通过测定样品对DNA损伤的保护能力，评估其抗氧化活性。

常用的指标包括DNA链断裂率、碱基损伤率等。

2.3.超氧化物歧化酶（SOD）活性测定法该方法测定样品中SOD的活性，评估其清除超氧自由基的能力。

常用的指标包括抑制率、相对酶活等。

2.4.过氧化氢酶（CAT）活性测定法该方法测定样品中CAT的活性，评估其清除过氧化氢的能力。

常用的指标包括催化剂浓度、酶单位等。

三、物理法3.1.相对电子自旋共振法该方法通过测定样品中的自由基产物的电子自旋共振信号的强度，评估抗氧化物的活性。

常用的指标包括g值、线宽等。

3.2.高温氧化法该方法利用样品在高温条件下的氧化反应，评估其抗氧化活性。

测定方法一．SOD，CAT及POD活性的测定分别取0.4ｇ材料于预冷的研钵中，加入8 ml预冷的50 mmol-1磷酸缓冲液（pH 7.8）（先加2ml, 在冰浴下研磨成匀浆后，将匀浆转入10ml离心管，再用6ml冲洗），10000 rpm离心15 min，取上清液定容至10ml后于4℃保存。

上清液用于可溶性蛋白质含量、SOD活性及POD活性的测定。

SOD活性测定1.显色反应取5mL指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按表47–1加入各溶液。

混匀后，给1支对照管照上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光，与其他各管同时置于4000lx日光灯下反应20-30 min(要求各管照光情况一致，反应温度控制在25～35℃之间，使酶活性高低适当调整反应时间)。

当样品数量较大时，可在临用前根据用量将表47–1中各试剂(酶液和核黄素除外)按比例混合后一次加入2.65mL，然后依次加入核黄素和酶液，使终浓度不变。

3.SOD活性测定至反应结束后，用黑布罩盖上试管，终止反应。

以遮光的对照管作为空白，分别在560nm 下测定各管的OD值，计算SOD活性。

3.<结果计算>已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。

SOD总活性[u/g(FW)]=式中：SOD总活性以酶单位每克鲜重表示。

比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。

ACK ——照光对照管的吸光度。

AE ——样品管的吸光度。

VT ——样品液总体积，mL。

V1 ——测定时样品用量，mL。

W——样品鲜重，g。

蛋白质含量单位为mg/g。

愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性1.取两支试管，洗涤后甩干水分。

试剂管号（对照）测定管0.05mol/L PH 5.5的磷酸缓冲液 2.9ml 2.9 ml2%双氧水溶液0 ml 1.0 ml0.05mol/L愈创木酚溶液 1.0 ml 1.0 ml蒸馏水 3.0 ml 2.0 ml总体积7.0 ml 7.0 ml将上述各管立即放入预先调好37 ℃的水浴锅中保温5min以上（酶促反应），向对照管中加入0.1 ml 酶液，混匀，在λ470 nm处调零，再向测定管中加入0.1 ml酶液，并且立即计时，混匀后进行比色测定，3分钟时立即读取吸光度。

抗氧化酶活性测定方法抗氧化酶是一类对抗氧化反应具有重要作用的酶。

其主要功能是清除体内的自由基，抑制过氧化物形成和脂质氧化反应，从而保护细胞免受氧化应激的伤害。

测定抗氧化酶活性有助于评估生物体内的氧化应激水平，为疾病的诊断和治疗提供重要的指导。

本文将介绍几种常见的抗氧化酶活性测定方法。

1.超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法：SOD能够催化超氧阴离子（O2-）的还原反应，将其转化为较为稳定的氧气和过氧化氢。

常见的SOD活性测定方法有：-标准醛缩法：根据SOD催化的还原反应，利用NBT（硝基蓝盐）和醛缩剂的变色反应来测定SOD活性。

-自动化测定法：利用包含其中一种还原物质和pH染料的较为稳定的底物，通过测定底物的氧化程度来确定SOD活性。

-XTT法和WST-1法：由于SOD具有还原型的性质，可以通过测定细胞培养基中的还原型琼脂糖（XTT）或水溶性四硝基噻唑盐（WST-1）的还原动力学来测定其活性。

2.过氧化氢酶（CAT）活性测定方法：CAT主要参与还原过氧化氢（H2O2），将其转化为氧和水。

常见的CAT活性测定方法有：-色素法：利用黄曲霉素作为还原剂，观察黄曲霉素的消费量来测定CAT活性。

-光度法：通过测定样品中H2O2浓度的下降程度来间接测定CAT活性。

-氧化还原电极法：通过测定样品中H2O2浓度的下降速度来测定CAT活性。

3.过氧化物酶（POD）活性测定方法：POD主要参与氧气与还原型供体之间的氧化还原反应，转化为过氧化物（ROO-）。

常见的POD活性测定方法有：-色谱法：利用酚类底物的氧化反应，测定产生的醌类产物的含量来测定POD活性。

-酶标法：POD催化氧化反应会形成有色产物，通过测定产物的吸光度来测定POD活性。

4.谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性测定方法：GPx主要参与还原过氧化物，将其转化为相对稳定的醇和水。

常见的GPx活性测定方法有：-碳酸盐法：根据GPx还原底物中的碳酸盐，观察样品溶液pH值的变化来测定GPx活性。

抗氧化酶活性测定方法抗氧化酶是一类能够帮助生物体减轻或消除自由基对细胞和组织的损伤的酶。

其中三个主要的抗氧化酶分别是超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)。

测定这些抗氧化酶的活性可以帮助我们了解细胞和组织内抗氧化能力的变化，从而评估对抗氧化应激的能力。

以下是常用的测定这些抗氧化酶活性的方法。

1.NBT法：超氧化物歧化酶能够催化过氧化脱氢麦角酮（NBT）被还原成紫色水溶性产物，通过测定产物的吸光度来确定SOD的活性。

具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的NBT缓冲液。

（2）开始反应：置于适当的温度和时间下。

（3）停止反应：加入硝酸，停止NBT的还原反应。

（4）测定吸光度：使用分光光度计测量产生的相对吸光度。

2.氰化硝酸法：该方法是通过抑制SOD对自由基的清除作用，使过氧化物离子被产生，进而通过测定过氧化物离子的吸光度来间接测定SOD的活性。

具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的氰化钾和亚硝酸钠。

（2）开始反应：加入适量的氧化剂，使之和SOD反应生成过氧化物。

（3）测定吸光度：使用分光光度计测量过氧化物离子产生的相对吸光度。

1.亚硫酸盐法：过氧化物酶能够催化亚硫酸盐氧化成差二价铁离子，通过差二价铁离子与硫酸铵生成蓝色络合物来测定POD的活性。

具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的亚硫酸铵和硫酸。

（2）开始反应：加入适量的H2O2，使之和POD反应生成差二价铁离子。

（3）停止反应：加入硫酸铵，停止POD对H2O2的催化作用。

（4）测定吸光度：使用分光光度计测量产生的相对吸光度。

2.过氧化氢法：过氧化物酶能够催化过氧化氢分解成氧气和水，通过测定生成的O2的相对浓度来测定POD的活性。

具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的过氧化氢。

（2）开始反应：加入过氧化物酶，使之和过氧化氢反应。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

加入10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮）参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。

网上说定容到100ML我也不懂。

拜托（3）100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；（4）100μM核黄素溶液：取0.0075g核黄素用蒸馏水定容至100ml，避光保存，随用随配，并稀释10倍（5）750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml 避光保存；酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加2ml 磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为10ml。

取5ml于10000r/min下离心10min，上清液即为SOD粗提液。

提取酶液时如何保存;如果没有测完的需要放在4℃的冰箱里。

2、酶活性测定2．显色反应取试管（要求透明度好）5支，3支为样品测定管，1支为对照管，另外1支作为空白，按表39-1加入各溶液。

混匀后将空白管置暗处，其它各管于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）。

抗氧化酶测定实验方法抗氧化酶是一类能够抵御细胞对氧自由基的毒性的酶。

抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等。

这些酶在细胞内能够将有害的氧自由基转化为无害的化合物，从而起到保护细胞免受氧自由基反应的毒性作用。

因此，测定抗氧化酶的活性能够反映细胞对氧自由基的抵御能力，对研究氧化应激、疾病发生机制等具有重要意义。

以下是一种常用的抗氧化酶测定方法的详细步骤：实验材料和试剂：1.组织样本或细胞培养物2.生理盐水（PBS）3. 超氧化物歧化酶(Abfrontier, LF-MA0011, 200U/mg, 冻干粉)4. 过氧化氢酶(Sigma, P2927, ≥2,000,000 units/mg protein, 溶于水)5. 谷胱甘肽过氧化物酶(Sigma, G5911, ≥300 units/mg protein,冻干粉)6. 过硫酸铵（Sigma, A9294）7.磷酸盐缓冲液(pH7.4，0.1M)8.丙酮9. 硫酸(Sigma, 1.84 M)10. 精氨酸(Sigma, A8094)11. 苯胂(Sigma, A8731)12. 硝基蓝色素(Sigma, N-5511)14. 高锰酸钾(Sigma, S2547)16. 硝基咪唑(NBT，Solarbio, S8190)17. EDTA二钠(Sigma, E6635)18. BSA(Sigma, A7906)19. 氯化三联氨(Sigma, A2251)20. Tris缓冲液(pH 8.0，0.1M)21. 高吉人(ABClonal, HRP-6002，5,000 IU/mg, 冻干粉)23.氯仿24.醋酸乙酯26.乙酸钠28. 脑磷脂(纯度≥98%，Shenggong, 1003J)30.SDS-试剂盒步骤：1.制备样本：将组织样本或细胞培养物均匀取样，使用PBS洗涤并平均分配到多个离心管中。

测定方法一．SOD，CAT及POD活性的测定分别取0.4ｇ材料于预冷的研钵中，加入8 ml预冷的50 mmol-1磷酸缓冲液（pH 7.8）（先加2ml, 在冰浴下研磨成匀浆后，将匀浆转入10ml离心管，再用6ml冲洗），10000 rpm离心15 min，取上清液定容至10ml后于4℃保存。

上清液用于可溶性蛋白质含量、SOD活性及POD活性的测定。

SOD活性测定1.显色反应取5mL指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按表47–1加入各溶液。

混匀后，给1支对照管照上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光，与其他各管同时置于4000lx日光灯下反应20-30 min(要求各管照光情况一致，反应温度控制在25～35℃之间，使酶活性高低适当调整反应时间)。

当样品数量较大时，可在临用前根据用量将表47–1中各试剂(酶液和核黄素除外)按比例混合后一次加入2.65mL，然后依次加入核黄素和酶液，使终浓度不变。

3.SOD活性测定至反应结束后，用黑布罩盖上试管，终止反应。

以遮光的对照管作为空白，分别在560nm 下测定各管的OD值，计算SOD活性。

3.<结果计算>已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。

SOD总活性[u/g(FW)]=式中：SOD总活性以酶单位每克鲜重表示。

比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。

ACK ——照光对照管的吸光度。

AE ——样品管的吸光度。

VT ——样品液总体积，mL。

V1 ——测定时样品用量，mL。

W——样品鲜重，g。

蛋白质含量单位为mg/g。

愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性1.取两支试管，洗涤后甩干水分。

试剂管号（对照）测定管0.05mol/L PH 5.5的磷酸缓冲液 2.9ml 2.9 ml2%双氧水溶液0 ml 1.0 ml0.05mol/L愈创木酚溶液 1.0 ml 1.0 ml蒸馏水 3.0 ml 2.0 ml总体积7.0 ml 7.0 ml将上述各管立即放入预先调好37 ℃的水浴锅中保温5min以上（酶促反应），向对照管中加入0.1 ml酶液，混匀，在λ470 nm处调零，再向测定管中加入0.1 ml酶液，并且立即计时，混匀后进行比色测定，3分钟时立即读取吸光度。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法抗氧化酶是生物体内重要的防御系统，它们通过清除自由基来保护细胞免受氧化损伤。

其中，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）是三种主要的抗氧化酶。

测定这些酶的活性对于评估生物体的抗氧化能力具有重要意义。

本文将介绍几种常用的抗氧化酶活性测定方法。

1. 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法SOD是一种能够催化超氧阴离子自由基（O2）歧化为氧气（O2）和过氧化氢（H2O2）的酶。

常用的SOD活性测定方法包括：氮蓝四唑（NBT）法：利用NBT在超氧阴离子自由基存在下被还原成蓝色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算SOD活性。

羟胺法：利用羟胺与超氧阴离子自由基反应硝酸盐，通过测定硝酸盐的量来计算SOD活性。

2. 过氧化物酶（POD）活性测定方法POD是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。

常用的POD活性测定方法包括：愈创木酚法：利用愈创木酚在过氧化物酶存在下被氧化红色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。

邻苯三酚法：利用邻苯三酚在过氧化物酶存在下被氧化紫色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。

3. 过氧化氢酶（CAT）活性测定方法CAT是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。

常用的CAT活性测定方法包括：紫外分光光度法：利用过氧化氢在紫外光下具有吸收的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算CAT活性。

酶偶联法：利用过氧化氢在过氧化物酶存在下被氧化水的特性，通过测定水的量来计算CAT活性。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定的实验步骤与注意事项实验步骤1. 样品准备提取酶：根据实验目的，选择合适的组织或细胞提取酶。

常用的提取缓冲液包括磷酸盐缓冲液、TrisHCl缓冲液等。

离心：将提取液离心，分离上清液和沉淀物。

上清液中含有目标酶，沉淀物则含有杂质。

蛋白质定量：使用 Bradford 法或 Lowry 法等蛋白质定量方法测定上清液中的蛋白质浓度。

抗氧化酶活性等测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法超氧化物歧化酶是一种重要的抗氧化酶，能够将超氧自由基（O2.-）转化为过氧化氢（H2O2），进而被谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）或过氧化物酶（CAT）降解。

测定SOD活性的方法有多种，其中最常用的方法包括：1.基于阻断亚硝酸胆红素还原的方法：该方法通过加氨基钠阻断细胞色素c还原作用，使亚硝酸胆红素还原成胆红素，从而测定SOD活性。

2.基于X射线辐照条件下还原亚硝酸胆红素的方法：这种方法利用X射线辐照生成O2.-，进而被SOD转化为H2O2、H2O2与亚硝酸胆红素反应生成亚硝酸盐，其紫红色可被光度计测定。

3.基于化学发光的方法：这种方法通过硝酸亚铁与亚硝酸盐反应生成亚铁络合物，发出化学发光信号。

该方法简单、灵敏度高，并可以自动化操作。

二、过氧化物酶（CAT）活性测定方法过氧化物酶是参与H2O2代谢的重要抗氧化酶。

常用的测定CAT活性的方法有：1.重铬酸钾（K2Cr2O7）比色法：该方法利用过氧化氢氧化重铬酸钾，从橙色转变为无色，通过比色计测定过量K2Cr2O7的消耗量计算CAT活性。

2.亚甲蓝法：这种方法利用过氧化氢氧化亚甲蓝生成显色产物，通过光度计测定产物的吸光度来评估CAT活性。

3.氨蓝法：这种方法是通过氨蓝还原过氧化氢产生的游离基离子，再与其他物质（如溴酚蓝）反应生成显色产物，通过比色计测定产物的吸光度来测定CAT活性。

三、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性测定方法谷胱甘肽过氧化物酶是参与氧化还原反应的重要酶。

目前常用的测定GSH-Px活性的方法有几种，包括：1.基于还原硒酸铁的方法：该方法利用GSH-Px催化还原硒酸铁成为亚硒酸铁，反应产物与硫代巴比妥酸钠反应生成巴比特酸，通过光度计测定巴比特酸的吸光度来评估GSH-Px活性。

2.比色法：这种方法通过巴比妥酸与反应产物反应生成巴比妥酸-丙二醛复合物，通过光度计测定复合物的吸光度来评估GSH-Px活性。

抗氧化物活性测定方法总结引言：一、化学法1.DPPH自由基清除法该方法利用DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苦基）自由基的特性，通过测定样品对DPPH自由基的清除能力来评估其抗氧化活性。

该方法简便、快速，适用于各种样品的抗氧化活性测定。

但该方法无法反映样品在生理条件下的真实抗氧化活性。

2.ABTS自由基清除法该方法利用ABTS（2,2'-联氨基双(3-乙酸苯并咪唑-6-磺酸)）自由基的特性，通过测定样品对ABTS自由基的清除能力来评估其抗氧化活性。

该方法操作简单、结果稳定，适用于各种样品的抗氧化活性测定。

但该方法在高浓度下可能存在偏差。

二、生物学法1.超氧化物歧化酶（SOD）活性测定法该方法通过测定样品对超氧自由基的抑制能力来评估其SOD活性。

该方法可以反映样品在生理条件下的真实抗氧化活性，适用于抗氧化物活性的研究。

但该方法操作复杂、耗时较长，且受到其他物质的干扰。

2.过氧化氢酶（CAT）活性测定法该方法通过测定样品对过氧化氢的分解能力来评估其CAT活性。

该方法操作简单、结果准确，适用于各种样品的抗氧化活性测定。

但该方法无法反映样品在生理条件下的真实抗氧化活性。

三、电化学法1.循环伏安法该方法通过测定样品在电极上的氧化还原行为，来评估其抗氧化活性。

该方法操作简单、结果准确，适用于各种样品的抗氧化活性测定。

但该方法需要特殊的电化学设备，且对于非水溶性样品不适用。

2.差示脉冲伏安法该方法通过测定样品在电极上的差示脉冲伏安曲线，来评估其抗氧化活性。

该方法操作简单、结果准确，适用于各种样品的抗氧化活性测定。

但该方法需要特殊的电化学设备。

结论：目前，抗氧化物活性测定方法多种多样，各有优缺点。

选择合适的测定方法应根据具体实验目的、样品性质、设备条件等综合考虑。

为了准确评估样品的抗氧化活性，可采用多种方法进行综合分析。

未来，随着科技的不断发展，抗氧化物活性测定方法将会更加精确、快速、简便，为抗氧化物活性的研究提供更多便利和准确的手段。

SOD,POD,CAT测定方法抗氧化酶活性的测定:(2.5g样0.05mol/L磷酸缓冲溶液 (PBS(pH=7.8溶液的配制:65.5506g Na2HPO4·12H2O + 2.65285g NaH2PO4·2H2O, 定容到4L。

(参考陈建勋,王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P134。

取低温保存的鲜样,称2g左右的叶片(或根放在50ml的离心管,加入20ml浓度为0.05mol/L 磷酸缓冲溶液(pH=7.8(最好是较冷的磷酸缓冲溶液,防止研磨时温度过高使酶失活,研磨(用磨碎机磨,8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟,上清液为粗酶液。

1超氧化物歧化酶(SOD的测定:NBT(400ml混合反应液:392mlPBS(Ph=7.8,+0.0206g NBT+ 0.776g甲硫酸铵+8ml核黄素溶液+0.4ml EDTA-Na溶液(100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素。

(另配100ml PBS溶液加EDTA-Na 3.7224gEDTA-Na测试时:取3ml反应液+0.05ml(根或0.02 ml(叶粗酶液,于光照培养箱中6-10分钟,OD650下测定吸光度。

2过氧化物酶(POD的测定:0.05mol/L磷酸缓冲溶液(PBS(pH=7.0溶液的配制:10.9251g Na2HPO4·12H2O + 3.042975g NaH2PO4·2H2O,定容到1000ml。

0.3%H2O2溶液的配制:吸2.5ml 30%H2O2,用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS定容到250ml。

0.2%愈创木酚溶液的配制:称0.5g愈创木酚,用0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS定容到250ml。

2ml 0.3%H2O2溶液 + 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液 + 1ml 0.05mol/L pH=7.0磷酸缓冲溶液(PBS + 0.02ml??(原来为0.01酶液(根加0.05ml酶液(对照用0.05mol/L磷酸缓冲溶液代替酶液(做三个重复,记录470nm处OD降低速度。

酶液提取:称取鲜叶样品。

0.5g于预冷的研钵中，加lml0.05mol/1 pH7.0磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。

将提取液于10000转/分冷冻离心20分钟，上清液用于测定SOD, POD, CAT活力测定及丙二醛含量测定。

SOD：测定SOD活性的试剂配制及用量:①磷酸缓冲液(PH7.8) 0.05moI/L 3.1m1，空白为3.2m1;②EDTA-Na21mg/m1 0.2mL;③L一甲硫氨酸20mg/mL 0.2m1;④核黄素0.1 mg/ml，吸取上清液0.2m1;⑤NBT lmg/ml 0.2m1;⑥提取酶液0.1ml，空白不加酶液。

反应总体积为4m1,第1组、4000Lx光照30min，遮黑布终止反应。

第2组、黑暗处理30 min。

置560nm处测定光密度。

SOD活性单位以抑制NBT光化还原50%作为一个酶活性单位(u)，按以下公式计算SOD活性:式中，Ack为照光管的吸光度值;AE为遮光管的吸光度值:V为样品液总体积((ml);Vt为测定时样品用量(ml); W为样品鲜重。

POD：在试管中依次加入4m1 0.3%愈创木酚(0.02mo1/1 pH6磷酸缓冲液配置)、50ul酶液、50 ul0.3%H202，摇匀，立即计时，1分钟后在470nm波长下比色，每1分钟记录一次吸光度值，连续记录5分钟。

以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(U)，按下式计算过氧化物酶活性:式中:d A470为反应时间内吸光度的变化:Vt为提取液总体积(ml); W为样品鲜重(g); Vs为测定时取用酶液体积(ml); t为反应时间(min) 。

CAT取酶提取液50 u 1，加入3m1 0.05 mol/1 pH7.0磷酸缓冲液，再加入0.3%H2O2200 u1，迅速摇匀，立即计时，1分钟后在UV-754分光光度计的240nm波长下比色，每1分钟记录一次吸光度值，连续记录5分钟。

抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法抗氧化酶SOD（超氧化物歧化酶）、POD（过氧化物酶）和CAT（过氧化氢酶）是植物体内重要的抗氧化酶，在植物的抗逆境应对中起着重要的作用。

因此，对这些抗氧化酶的活性进行测定和分析是研究植物生理生化过程的重要方面之一测定抗氧化酶活性的方法一般分为两类：直接法和间接法。

直接法是通过测定一些特定底物的降解速率来反映酶的活性；间接法是通过测定酶催化底物形成的产物的生成速率来间接反映酶的活性。

下面将分别介绍抗氧化酶SOD、POD和CAT活性的测定方法。

1.SOD活性测定方法：SOD活性测定方法主要分为NBT法和EPX法两种。

（1）NBT法：这是一种直接法，其基本原理是SOD将还原型的NBT 还原成穆尔蓝染色形成具有最大吸收峰值的NBT离子。

实验步骤如下：a.首先准备SOD底物溶液，其组成为：50mM磷酸缓冲液（pH7.8）+13mML-甲硫氨酸+75μM硝基蓝硝酸盐（NBT）。

b.将样品加入上述的SOD底物溶液中，混匀。

c.加入适量的酶抑制剂，使停止酶的活性，并将其放在冰上。

d.使上述反应在37℃下进行10分钟。

e.加入已经冷却的硝酸亚铁和磷酸以停止反应，并将其放在冰上10分钟。

f. 测定变色液的吸收光谱在560 nm波长处的吸光度。

（2）EPX法：这也是一种直接法，其基本原理是SOD将乙酸型形成的4-无水乙烯甲基-3-硝基噻吩染色。

实验步骤如下：a. 首先在试管中加入1 ml乙酸型测定液。

b.分别加入适量的SOD样品。

c.在30分钟内使试管中乙酸型完全消除。

d. 测定出试管中产生的4-乙烯基-3-硝基-5-硝基噻吩的吸收光谱在260 nm波长处的吸光度。

2.POD活性测定方法：POD活性测定方法可分为直接法和间接法。

（1）直接法：这种方法基于过氧化反应的特点，利用dianisidine 与过氧化氢在催化剂POD作用下形成有色产物的现象来测定POD的活性。

实验步骤如下：a.在试管中加入0.1M磷酸盐缓冲液（pH6.0）。