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鲍曼不动杆菌耐药性及碳青霉烯酶的研究【摘要】目的了解鲍曼不动杆菌耐药谱及碳青霉烯酶的研究。
方法用VITEK60型全自动药敏分析系统鉴定药敏系统及纸片扩散法进行药敏实验；PCR 扩增和测序分析检测碳青霉烯酶VIM、IMP、OXA-23和OXA-24。
结果217株鲍曼不动杆菌中头孢哌酮/舒巴坦耐药率最低，其次是亚胺培南，再者是头孢他啶和哌拉西林/他唑巴坦；头孢哌酮/舒巴坦和头孢他啶的中介率分别是27.6%和19.8%；20株亚胺培南耐药菌中，PCR 扩增VIM、IMP和OXA-24均阴性；OXA-23基因扩增显示19株（95%）阳性，PCR产物并经序列分析证实为OXA-23。
结论碳青霉烯类抗生素的长期广泛应用使鲍曼不动杆菌的耐药率不断升高；产OXA-23型β-内酰胺酶是本院鲍曼不动杆菌对亚胺培南耐药的重要原因。
【Abstract】ObjectiveTo investigate the resistant characteristic and carbapenemases in acinetobacter Baumannii（Ab）.Methods Identification and analyses all specimens were identified by VITEK- 60, drug resistances were detected by VITEK- 60 , the drug resistance to SCF were detected by Kirby -Bauer test. PCR and DNA sequencing were performed to determine VIM，IMP，OXA-23 and OXA-24 β-lactamase. Results 217 strains, the resistance rate to sulperazone in 217 strains is the lowest, then to the Imipem’s ;The mid-drug-resistance rate of the sulperazone is 27.6%, and the ceftazidime’s is 19.8%. Of the 20 imipenem resistance strains, VIM、IMP and OXA-24 β-lactamase genotype were all negative, PCR and sequencing found 19 strains（95%）produced OXA-23.Conclusion The resistance rates is increasing to advance as longer-term or broad to use carbopenem; OXA-23 production is the important resistance mechanism in Imipenem.【Key words】Acinetobacter baumannii；Carbapenemases鲍曼不动杆菌是引起院内感染的重要病原菌,它对多种抗菌药物耐药, 临床上治疗比较困难。
鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性及基因分析目的：通过研究本院21株鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药基因和耐药情况，为临床用药提供依据。
方法：用珠海迪尔DL-96微生物鉴定系统进行细菌鉴定及K-B法进行药敏试验，并用碳青霉烯酶4种基因的特异性引物对其进行聚合酶链反应(PCR)扩增和基因型分析，通过网上GemBank进行比对，以确定编码酶基因的类型。
结果：21株鲍曼不动杆菌对左旋氧氟沙星、丁胺卡那霉素、多粘菌素B的耐药率分别为50%、25%、10%。
其他抗生素的耐药率均在80%以上。
携带D类碳青霉烯酶OXA-23基因有17株(81%)，携带OXA-51基因有15株(60%)，OXA-24、OXA-58基因引物PCR扩增为阴性，OXA-23基因阳性株进行测序后通过在网上GemBank比对与OXA-23标准株99%同源，OXA-51基因阳性株与OXA-51标准株98%同源。
结论：鲍曼不动杆菌对多粘菌素的耐药率最低，其次是丁胺卡那霉素和左旋氧氟沙星，其中以携带OXA-23型碳青霉烯酶基因为主，应严格监测其耐药情况，针对性地选用抗生素，对防止其流行和多重耐药性的产生有着重要意义。
鲍曼不动杆菌是一种分离率和耐药性最高的不动杆菌，是一种条件致病菌，也是重要的医院感染病原菌。
近年来，由于广谱抗菌药物的滥用，多重耐药不动杆菌日趋增多，甚至出现多重耐药和全耐菌株，给临床治疗带来极大的困难。
因为鲍曼不动杆菌在干燥物体表面生存时间可长达25 d以上，极易造成流行，给临床抗感染治疗带来很大的困难，也对院内感染的控制提出了新的要求[1]。
鲍曼不动杆菌的耐药机制非常复杂，如产酶、PBP改变外膜蛋白缺失等因素有关。
本文通过对21株对耐碳青霉烯类抗生素的鲍曼不动杆菌的耐药性和基因分析，进一步了解其耐药机制，为临床治疗和控制感染提供依据。
1材料与方法1.1菌株来源所有菌株均为从本院2009年1月-2011年1月住院患者痰液、血液、尿液等标本分离所得的非重复菌株，标准菌株为大肠ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853。
・论 著・耐碳青酶烯鲍氏不动杆菌碳青酶烯酶基因型的研究顾怡明1,郭 丽2,张 杰1(1.北京天坛医院呼吸科,北京100050;2.北京市第六医院呼吸科,北京100007)摘要:目的 研究北京天坛医院耐碳青酶烯鲍氏不动杆菌产碳青酶烯酶的类型。
方法 收集北京天坛医院耐碳青酶烯鲍氏不动杆菌20株,对碳青酶烯酶基因OXA 223、OXA 224、IMP 、V IM 进行聚合酶链反应(PCR )及序列分析。
结果 20株耐碳青酶烯鲍氏不动杆菌全部检测到OXA 223型基因,所有菌株均未检测到OXA 224、IMP 、V IM 型基因。
结论 北京天坛医院耐碳青酶烯鲍氏不动杆菌的碳青酶烯酶基因型以OXA 223型为主。
关键词:鲍氏不动杆菌;碳青酶烯类;碳青酶烯酶中图分类号:R378 文献标识码:A 文章编号:100524529(2009)1321638203C arbapenemase G enotype of C arbapenem 2resistant Acinetobacter ba uma nniiGU Y i 2ming 3,GUO Li ,ZHAN G Jie(3B ei j i ng Ti ant an Hos pit al ,Ca pit al U ni versit y of M edical S ciences ,B ei j i ng 100050,Chi na )Abstract :OB JECTIVE To investigate the carbapenemase genotype of carbapenem 2resistant A cinetobacter bauman 2nii isolated f rom Beijing Tiantan Hospital.METH ODS Twenty strains of carbapenem 2resistant A.baumannii werecollected f rom Beijing Tiantan Hospital.OXA 223,OXA 224,IMP and V IM genes were detected by polymerase chain reaction (PCR )and DNA sequencing method.RESU LTS All strains produced OXA 223carbapenemases by PCR and sequencing ,and OXA 224,IMP and V IM genes were not found.CONC L USIONS OXA 223Carbapenemase is a main type of carbapenem 2resistant A.baumannii in Beijing Tiantan Hospital.K ey w ords :A cinetobacter baumannii ;Carbapenem ;Carbapenemase收稿日期:2009203209; 修回日期:2009205212通讯作者:张杰,E 2mail :kngym @ 鲍氏不动杆菌属于非发酵菌属,广泛分布于自然界及健康人的皮肤表面,是医院感染的重要病原菌之一。
碳青酶烯类抗菌药物是目前控制鲍氏不动杆菌感染的最有效药物。
近年来随着抗菌药物的广泛应用,对耐碳青酶烯类鲍氏不动杆菌呈不断上升趋势,给临床治疗带来极大困难。
鲍氏不动杆菌对碳青酶烯类抗菌药物的耐药机制复杂,产生碳青酶烯酶是其重要原因,本研究对临床分离的耐碳青酶烯鲍氏不动杆菌进行碳青酶烯酶基因型的研究。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株来源 收集2007年6-12月北京天坛医院临床分离的耐碳青酶烯鲍氏不动杆菌20株。
质控菌株为铜绿假单胞菌标准菌株A TCC27853购自中国药品生物制品检定所,产IM P 21型和产V IM 22型金属酶的阳性对照菌株由北京协和医院惠赠。
1.1.2 药敏纸片与培养基 药敏纸片包括亚胺培南(IM P )、美罗培南(M ER )、氨曲南(A TM )、头孢吡肟(FEP )、头孢他啶(CA Z )、头孢哌酮/舒巴坦(CFS )、阿米卡星(AM K )、环丙沙星(CIP )、哌拉西林(PIP )、哌拉西林/他唑巴坦(TZP )、空白药敏纸片,所有药敏纸片均购自英国Oxoid 公司;M 2H 药敏培养基由中国检验检疫科学研究院北京陆桥技术有限责任公司提供。
1.1.3 仪器与试剂 PCR 引物、DNA 相对分子质量标准DL2000DNA 标志物、Ex Taq 酶购自大连宝生物工程有限公司;PCR 扩增仪为美国PE 公司产品,UV P 凝胶电泳成像仪为美国Image Store 7500型产品。
1.2 方法1.2.1 药敏试验 采用K 2B 纸片琼脂扩散法,重新测定菌株对临床常用的10种抗菌药物的敏感性,结果参照2005年美国临床实验室标准化研究所(CL SI )进行,实验数据采用W HON ET5.3软件进行分析。
・8361・Chin J Nosocomiol Vol.19No.1320091.2.2 细菌DNA的提取 采用煮沸法提取细菌DNA作为PCR用模板,-20℃保存备用。
1.2.3 PCR扩增 各种碳青酶烯酶基因型包括IM P型、V IM型、OXA223型和OXA224型的PCR 扩增所用引物参考文献[123]合成,PCR反应体系均为25μl,扩增完毕,将PCR产物点样于1.5%琼脂糖凝胶,以120V电压电泳30min后在紫外灯下观察结果。
引物的具体序列及扩增长度见表1。
表1 碳青酶烯酶基因PCR扩增所用引物序列及产物长度基 因 引物序列 (5′→3′) 产物长度(bp)IMP F:CTACCGCA GCA GA GTCT T T G587 R:AACCA GT T T T GCCT TACCA TVIM F:A T GT TCAAACT T T T GA GTAA G801 R:CTACTCAACGACT GA GCGOXA223F:GA T GT GTCA TA GTA T TCGTCG1067 R:TCACAACAACTAAAA GCACT GOXA224F:ATG AAAAAATTT AT ACTTCCT AT ATTCAG C825 R:T TAAA T GA T TCCAA GA T T T TCTA GC1.2.4 PCR产物 PCR产物送大连宝生物公司纯化,利用ABI PRISM TM377XL型DNA测序仪进行测序,结果在美国生物技术信息中心(NCB I)的GenBank中用BLAST程序与已知序列进行比对。
2 结 果2.1 药敏结果 20株鲍氏不动杆菌均为多药耐药,20株耐碳青酶烯鲍氏不动杆菌对临床常用的10种抗菌药物药敏情况见表2。
表2 20株耐碳青酶烯鲍氏不动杆菌对10种抗菌药物的耐药率(%)抗菌药物 耐药株数耐药率亚胺培南20100.0美罗培南20100.0氨曲南1890.0头孢吡肟20100.0头孢他啶20100.0头孢哌酮/舒巴坦20100.0阿米卡星1890.0环丙沙星20100.0哌拉西林20100.0哌拉西林/他唑巴坦20100.02.2 PCR扩增结果 20株鲍氏不动杆菌经OXA2 23引物扩增均呈阳性,PCR产物送宝生物公司纯化、测序,共测得1035个核苷酸,结果与GenBank 已知序列对比,经BL AST程序分析,证实为OXA2 23型碳青酶烯酶基因。
20株鲍氏不动杆菌经IM P、V IM和OXA224引物扩增均阴性。
见图1。
M:DNA标志物;1:阳性对照;2:阴性对照; 3、4:阳性产物;5、6:阴性产物。
图1 OXA223型碳青酶烯酶基因PCR电泳图谱3 讨 论 鲍氏不动杆菌是引起医院感染的重要条件致病菌,多见于重症监护病房、脑外科、血液科、肿瘤科等危重症及免疫力低下的患者。
近年来,由于革兰阴性杆菌不断产生头孢菌素酶(AmpC酶)及超广谱β2内酰胺酶(ESBL s),临床上大量使用碳青酶烯类抗菌药物,在抗菌药物选择的压力下,耐碳青酶烯鲍氏不动杆菌的比率逐渐升高。
鲍氏不动杆菌对碳青酶烯类抗菌药物的耐药机制十分复杂。
包括产生碳青酶烯酶、Amp C酶及ESBL s、外膜蛋白缺失、主动外排机制等,其中产生碳青酶烯酶是导致耐药的重要原因。
碳青酶烯酶属于β2内酰胺酶,分为苯唑西林酶(D类酶)和金属酶(B类酶)。
D类酶根据氨基酸的同源性分为两组: OXA223、27型;OXA224、25、26、40型。
B类酶文献报道最多的为IM P型和V IM型金属酶。
近年来,在国内外均有产OXA223型碳青酶烯酶鲍氏不动杆菌暴发流行的报道[4,5]。
本研究对20株耐碳青酶烯鲍氏不动杆菌进行碳青酶烯酶类型的研究,通过PCR引物扩增发现所有菌株均存在OXA223型基因,本研究未扩增出OXA224型、IM P型和V IM型等其他类型的碳青酶烯酶,说明产OXA223型碳青酶烯酶是北京天坛医院鲍氏不动杆菌对碳青酶烯类抗菌药物耐药的重要机制。
本研究收集北京天坛医院的鲍氏不动杆菌进行研究,发现在所有对碳青酶烯类抗菌药物耐药的鲍氏不动杆菌中,有80%的菌株对临床常用的抗菌药物都表现为耐药,这与文献报道的相一致[6],由此说明,一旦分离出耐碳青酶烯鲍氏不动杆菌,将可能造成临床无药可用的严重后果。
对于耐碳青酶烯鲍氏不动杆菌的感染,文献报道多黏菌素类抗菌药物可作为控制感染的最后选择[7],由于该类药物的肾毒・9361・中华医院感染学杂志2009年第19卷第13期性及神经毒性等不良反应,限制了其在临床上的应用。
国内外多个耐药监测报告显示,鲍氏不动杆菌一旦出现对碳青酶烯类耐药,就意味着对多种抗菌药物的耐药,即泛耐药株。
泛耐药株的产生,给临床抗感染治疗带来巨大困难,患者病死率极高,因此减少耐药菌株的产生和播散致关重要。
首先,要求临床医师合理应用第三代头孢菌素和碳青酶烯类抗菌药物,减轻对耐药菌株筛选的压力,避免耐药菌的出现。
此外,建立本地区的耐药监测机制,一旦发现耐药株,需采取严格的消毒隔离措施,避免交叉感染,减少细菌播散。
参考文献:[1] Poirel L,Naas T,Nicolas D,et al.Characterization of VIM22,a carbapenem2hydrolyzing metalloβ2Lactamase and it splasmid2and integron2borne gene from a Pseudomonas aerugi2nosa clinical isolate in France[J].Antimicrob Agent s Che2mot her,2000,44(4):8912897.[2] Ohara M,K ouda S,Onodera M,et al.Molecular character2ization of imipenem2resistant Pseudomonas aeruginosa in Hi2roshima,Japan[J].Microbiol Immunol,2007,51(3):2712277.[3] J eon BC,J eong SH,Bae IK,et al.Investigation of a nosoco2mial outbreak of imipenem2resistant A cinetobacter baumanniiproducing t he OXA223β2lactamase in K orea[J].J Clin Mi2crobiol,2005,43(5):224122245.[4] 董晓勤,周田美,魏泽庆,等.杭州市区4所医院鲍氏不动杆菌耐药性及耐药基因研究[J].中华医院感染学杂志,2007,17(3):2502253.[5] Thierry N,Marc L,Claire H,et al.Outbreak of carbapen2em2resistant A cinetobacter baumannii producing t he carbap2enemase OXA223in a tertiary care hospital of Papeete,French Polynesia[J].J Clin Microbiol,2005,43(9):482624829.[6] 王辉,孙宏莉,宁永忠,等.不动杆菌属多重耐药及泛耐药的分子机制研究[J].中华医学杂志,2006,86(1):17222.[7] 汪复.多重耐药铜绿假单胞菌与鲍曼不动杆菌严重感染的防治策略[J].中国感染与化疗杂志,2007,7(3):2302232.认真洗手预防交叉感染张 芳1,张 萌2,李 娜2,谢景红2(1.武警总医院消毒供应科2.质控办,北京100039)关键词:洗手;预防;交叉感染中图分类号:R197.323 文献标识码:B 文章编号:100524529(2009)1321640201 根据美国2002年的调查,医务人员手卫生依从性仅50%～81%。
