大肠埃希菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制及分子分型

耐碳青霉烯类抗菌药物大肠埃希菌耐药机制的研究闫文娟;李轶;王山梅;孙明洁【摘要】Objective To investigate the drug resistance characteristics and mechanism of carbapenem-resistant Escherichia coli in Henan Provincial People's Hospital. Methods The identification and antimicrobial susceptibility in vitro of the isolates from qualified clinical specimens were analyzed by BD Phoenix 100 microorganism analysis system. The isolates of carbapenem-resistant Escherichia coli were screened according to the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) standard. Modified Hodges test and meropenem(MEM)-ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)-Na2 double-disk synergy test were used for phenotypic screening of the isolates. By polymerase chain reaction(PCR),the resistance genes,blaKPC,blaNDM,blaVIM,blaIMP and blaOXA-48,in the isolates were detected. The transferability of blaKPC in the blaKPC-positive isolates was studied by conjugation test. Results A total of 8 carbapenem-resistant Escherichia coli were screened from the 1 238 isolates. In the 8 isolates,7 isolates were resistant to imipenem (IPM)and MEM,but 1 isolate was only resistant to MEM. All the 8 isolates were positive in the modified Hodges test, and 6 isolates were positive in the MEM-EDTA double-disk synergy test. There were 2 isolates carrying blaKPC-2 and 3 isolates carrying blaIMP-4. Conjugation test indicated that blaKPC-2 could be transferred to Escherichia coli. Conclusions Carbapenem-resistant Escherichia coli carrying blaIMP-4 is firstly reported in the hospital. The resistancemechanism of carbapenem-resistant Escherichia coli in the hospital is mainly carrying blaKPC-2 and blaIMP-4,and the blaKPC-2 gene could be horizontally transmitted by plasmid.%目的：了解河南省人民医院耐碳青霉烯类抗菌药物大肠埃希菌的耐药特点和耐药机制。

㊃论 著㊃D O I :10.3969/j.i s s n .1672-9455.2023.18.009碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌耐药性及耐药基因分析*侯素君1,尹盟盟1,王均梅1,别海文1,梁永娟1,朱元祺21.山东省日照市中医医院检验科,山东日照276800;2.青岛大学附属医院检验科,山东青岛266003摘 要:目的 探讨医院碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌(C R E )的临床耐药性及耐药表型和基因型,为医院C R E 菌株感染的临床治疗及医院感染暴发的预防和控制提供科学依据㊂方法 收集2020年7月至2023年1月日照市中医医院临床患者标本中分离的77株C R E 菌株,采用全自动微生物分析仪进行细菌鉴定和药敏试验,采用改良碳青霉烯酶灭活试验(m C I M )和乙二胺四乙酸(E D T A )改良碳青霉烯酶灭活试验(e C I M )联合检测碳青霉烯酶表型,采用聚合酶链反应(P C R )扩增耐药基因并进行测序分型㊂结果 77株C R E 菌株主要分离自痰液,其次是尿液㊁胸腔积液;科室来源主要是颅脑外科㊁重症医学科㊁脑卒中监护室㊂C R E 菌株中肺炎克雷伯菌33株,大肠埃希菌15株,阴沟肠杆菌12株,其他细菌17株㊂C R E 菌株对替加环素敏感性为97.4%,阿米卡星为44.2%,复方磺胺甲噁唑为39.0%,对其他抗菌药物的敏感性均低于20.0%㊂m C I M 筛选碳青霉烯酶菌株的灵敏度为95.9%,特异度为100.0%㊂P C R 扩增结果显示49株C R E 菌株携带N D M 基因,24株C R E 菌株携带K P C 基因,1株C R E 菌株携带I M P 基因,3株未检出碳青霉烯酶基因;基因测序比对确定耐药基因亚型分别为b l a K P C -2㊁b l a N D M -1㊁b l a I M P -4㊂结论 C R E 菌株以肺炎克雷伯菌㊁大肠埃希菌㊁阴沟肠杆菌为主,具有较强的耐药性,肺炎克雷伯菌碳青霉烯类耐药基因主要为b l a K P C -2㊁大肠埃希菌耐药基因主要为b l a N D M -1,阴沟肠杆菌耐药基因主要为b l a N D M -1,临床需加强C R E 菌株检测,根据药敏试验结果合理选用抗菌药物,防范其在医院内暴发流行㊂关键词:碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌; 细菌耐药性; 耐药基因中图法分类号:R 446.5文献标志码:A 文章编号:1672-9455(2023)18-2667-05A n a l y s i s o n d r u g r e s i s t a n c e a n d d r u g r e s i s t a n c e g e n e s o f c a r b a pe n e m -r e s i s t a n t E n t e r o b a c t e r i a c e a e b a c t e r i a*H O U S u j u n 1,Y I N M e n g m e n g 1,WA N G J u n m e i 1,B I E H a i w e n 1,L I A N G Y o n g j u a n 1,Z HU Y u a n qi 21.D e p a r t m e n t o f C l i n i c a l L a b o r a t o r y ,R i z h a o M u n i c i p a l H o s p i t a l o f Tr a d i t i o n a l C h i n e s e M e d i c i n e ,R i z h a o ,S h a n d o n g 276800,C h i n a ;2.D e p a r t m e n t o f C l i n i c a l L a b o r a t o r y ,A f f i l i a t e d H o s p i t a l o f Q i n g d a o U n i v e r s i t y ,Q i n g d a o ,S h a n d o n g 266003,C h i n a A b s t r a c t :O b je c t i v e T o e x p l o r e t h e c l i n i c a l d r u g r e s i s t a n c e ,d r u g r e s i s t a n c e p h e n o t y p e s a n d g e n o t y p e s of c a r b a p e n e m -r e s i s t a n t E n t e r o b a c t e r i a c e a e (C R E )b a c t e r i a i n t h e h o s p i t a l s o a s t o p r o v i d e a s c i e n t i f i c b a s i s f o r t h e c l i n i c a l t r e a t m e n t o f C R E b a c t e r i a l s t r a i n s i n f e c t i o n a n d t h e p r e v e n t i o n a n d c o n t r o l o f t h e C R E b a c t e r i a l s t r a i n s i n f e c t i o n o u t b r e a k s .M e t h o d s S e v e n t y -s e v e n C R E s t r a i n s i s o l a t e d f r o m t h e c l i n i c a l p a t i e n t s s a m pl e s i n R i z h a o M u n i c i p a l H o s p i t a l o f T r a d i t i o n a l C h i n e s e M e d i c i n e f r o m J u l y 2020t o J a n u a r y 2023w e r e c o l l e c t e d ,t h e b a c t e r i a l i d e n t i f i c a t i o n a n d d r u g s u s c e p t i b i l i t y t e s t s w e r e c o n d u c t e d b y t h e f u l l a u t o m a t i c m i c r o b i o l o gi c a l a n a -l y z e r ,a n d t h e c a r b a p e n a s e p h e n o t y p e w a s d e t e c t e d b y t h e m o d i f i e d c a r b a p e n e n a s e i n a c t i v a t i o n m e t h o d (m C I M )a n d E D T A m o d i f i e d c a r b a p e n e n a s e i n a c t i v a t i o n m e t h o d (e C I M ).T h e d r u g -r e s i s t a n c e g e n e s w e r e a m -p l i f i e d b y p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n (P C R )a n d t h e s e q u e n c i n g w a s p e r f o r m e d .R e s u l t s S e v e n t y-s e v e n C R E s t r a i n s w e r e m a i n l y i s o l a t e d f r o m t h e s p u t u m s p e c i m e n ,f o l l o w e d b y t h e u r i n e a n d p l e u r a l e f f u s i o n .T h e d e -p a r t m e n t s w e r e m a i n l y t h e c r a n i o c e r e b r a l s u r g e r y,i n t e n s i v e c a r e m e d i c i n e a n d s t r o k e i n t e n s i v e c a r e u n i t .A -m o n g th e C R E s t r a i n s ,t h e r e w e r e 33s t r a i n s o f K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e ,15s t r a i n s o f E s c h e r i c h i a c o l i ,12s t r a i n s o f E n t e r o b a c t e r c l o a c a e a n d 17s t r a i n s o f o t h e r b a c t e r i a .T h e s e n s i t i v i t y o f t h e C R E s t r a i n s t o t i g a c y c l i n e w a s 97.4%,w h i c h t o a m i k a c i n w a s 44.2%,w h i c h t o c o t r i m o x a z o l e w a s 39.0%,a n d w h i c h t o o t h e r a n t i b a c t e r i a l d r u g s w a s l o w e r t h a n 20.0%.T h e s e n s i t i v i t y a n d s p e c i f i c i t y o f m C T M f o r s c r e e n i n g c a r b a p e n a s e s t r a i n w e r e 95.9%a n d 100.0%,r e s p e c t i v e l y .T h e P C R a m pl i f i c a t i o n r e s u l t s s h o w e d t h a t 49s t r a i n s o f C R E b a c t e r i a c a r -r i e d t h e N D M g e n e ,24s t r a i n s o f C R E b a c t e r i a c a r r i e d K P C g e n e ,1s t r a i n o f C R E b a c t e r i u m c a r r i e d I M P g e n e,㊃7662㊃检验医学与临床2023年9月第20卷第18期 L a b M e d C l i n ,S e pt e m b e r 2023,V o l .20,N o .18*基金项目:青岛大学附属医院 临床医学+X 科研项目(2019-3399);山东省日照市中医医院2021年度院级科研立项项目(R Z Z Y 2021L C -09)㊂ 作者简介:侯素君,女,副主任技师,主要从事临床病原微生物耐药监测及耐药机制方面的研究㊂Copyright ©博看网. All Rights Reserved.a n d3s t r a i n s d i d n o t d e t e c t c a rb a p e n e n a s e g e n e.T h e g e n e s e q u e nc i n g c o m p a r i s o nde t e r m i n e d t h a t t h e s u b t y p e s of d r ug r e s i s t a n c e g e n e w e r e b l a K P C-2,b l a N D M-1a n d b l a I M P-4.C o n c l u s i o n Th e C R E s t r ai n s a r e m a i n l y K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e,E s c h e r i c h i a c o l i a n d E n t e r o b a c t e r c l o a c a e w i t h s t r o n g d r u g r e s i s t a n c e.T h e c a r b a p e n e m r e s i s t a n t g e n e o f K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e i s i s m a i n l y b l a K P C-2,w h i c h o f E s c h e r i c h i a c o l i i s m a i n l y b l a N D M-1,a n d w h i c h o f E n t e r o b a c t e r c l o a c a e i s m a i n l y b l a N D M-1.C l i n i c s h o u l d s t r e n g t h e n t h e C R E s t r a i n s m o n i t o r i n g.T h e a n t i b a c t e r i a l d r u g s s h o u l d b e r e a s o n a b l y s e l e c t e d a c c o r d i n g t o t h e d r u g s u s c e p t i b i l i t y t e s t r e s u l t s t o p r e v e n t i t s o u t b r e a k s a n d e p i d e m i c i n t h e h o s p i t a l.K e y w o r d s:c a r b a p e n e m-r e s i s t a n t E n t e r o b a c t e r i a c e a e;b a c t e r i a l r e s i s t a n c e;d r u g r e s i s t a n c e g e n e当前,细菌耐药已成为全球公共健康领域的重大挑战,其中尤以碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌(C R E)引起的感染形势最为严峻,碳青霉烯类抗菌药物包括亚胺培南㊁美洛培南和厄他培南等,是治疗多重耐药革兰阴性杆菌所致感染最有效的抗菌药物之一㊂随着该类药物在临床的广泛应用,肠杆菌目细菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率呈逐年快速上升趋势[1]㊂耐药细菌感染致住院时间延长㊁费用增加㊁病死率增高,在社区或医院中可引起散发,交叉传播,甚至导致暴发流行,对婴幼儿㊁老年人和免疫缺陷者的威胁巨大㊂因此,探讨医院C R E菌株的耐药表型和基因型,可以为医院C R E菌株感染的临床治疗和医院感染暴发的防控提供科学依据㊂1材料与方法1.1菌株来源收集2020年7月至2023年1月日照市中医医院临床患者标本中分离的77株C R E菌株,剔除同一患者同一部位重复分离的菌株㊂1.2质控菌株大肠埃希菌A T C C25922㊁肺炎克雷伯菌A T C C700603㊁大肠埃希菌A T C C700323㊁大肠埃希菌A T C C35218㊁肺炎克雷伯菌A T C C B A A1705㊁肺炎克雷伯菌A T C C B A A2146均由省临床检验中心提供㊂1.3仪器与试剂 V I T E K2C o m p a c t全自动细菌鉴定及药敏分析仪(法国生物梅里埃公司)㊁L a b n e t C1301-230E U型手掌形离心机(美国L a b n e t公司)㊁B i o-R a d M y C y c i e r型P C R扩增仪(美国B i o-R a d公司)㊁E p p e n d o r f5415R型台式高速离心机(德国E p-p e n d o r f公司)㊁北京六一D Y C P-31D N型琼脂糖凝胶电泳仪(北京六一生物科技有限公司)㊁B i o-R a d凝胶成像仪(美国B i o-R a d公司)㊁B i o-R a d电泳槽(美国B i o-R a d公司),2ˑA c c u r a t e T a q预混液(湖南艾科瑞生物工程有限公司),D L2000D N A M a r k e r(日本T a K a R a公司),琼脂糖(日本T a K a R a公司),4S G e l-r e d核酸染料(香港B B I L i f e S c i e n c e C o r p o r a t i o n), W i z a r d G e n o m i c D N A P u r i f i c a t i o n K i t(美国P r o-m e g a公司),胰蛋白胨大豆肉汤培养基(T S B,杭州滨和微生物试剂公司),E t e s t条(温州市康泰生物科技有限公司),头孢哌酮/舒巴坦㊁替加环素药敏纸片均为英国O x i d公司产品㊂1.4方法1.4.1菌株鉴定及药敏试验菌株分离与培养严格按照‘全国临床检验操作规程“(第4版)[2]进行,使用V I T E K2C o m p a c t全自动微生物分析仪进行菌株鉴定及药敏试验㊂药敏试验结果判断根据美国临床和实验室标准协会(C L S I)最新版标准判断,收集临床标本中分离的肠杆菌目细菌药敏试验报告中亚胺培南㊁美洛培南最小抑菌浓度(M I C)ȡ4μg/m L或厄他培南ȡ2μg/m L(已用E t e s t条复核)的菌株[3]㊂1.4.2碳青霉烯酶表型确证试验改良碳青霉烯酶灭活试验(m C I M)操作步骤:参照C L S I2020年版M100操作标准,用1μL接种环挑一满环菌落,加入2 m L T S B肉汤中乳化,振荡10~15s,每管放入1张含10μg美洛培南的无菌纸片,确认纸片浸没于菌悬液中,35ħ孵育4h,将美洛培南纸片贴于已涂布大肠埃希菌A T C C25922悬液的MH平板,35ħ孵育18~ 24h,量取抑菌圈直径㊂乙二胺四乙酸(E D T A)改良碳青霉烯酶灭活试验(e C I M)操作步骤:另取一支试管,加入2m L T S B肉汤,再加入20μL0.5m o l/L E D T A溶液混匀,E D T A浓度最终为5mm o l/L㊂其余步骤同m C I M㊂m C I M判断标准:美洛培南抑菌圈直径为6~15mm或直径16~18mm但抑菌圈内有散在菌落时,为碳青霉烯酶阳性;抑菌圈直径ȡ19 mm,为碳青霉烯酶阴性;抑菌圈直径为16~18mm 或直径为19mm但抑菌圈内有散在菌落,则无法判断是否存在碳青霉烯酶,为碳青霉烯酶不确定[4]㊂e C I M判断标准:e C I M与m C I M结果比较,美洛培南抑菌圈直径相差ȡ5mm为金属β-内酰胺酶阳性,美洛培南抑菌圈直径相差ɤ4mm为金属β-内酰胺酶阴性,待测菌株产丝氨酸蛋白酶㊂1.4.3基因检测煮沸裂解法提取D N A模板,采用P C R扩增碳青霉烯酶耐药基因,扩增条件为94ħ预变性5m i n;94ħ变性30s,52ħ退火40s,72ħ延伸50s,共35个循环;72ħ再延伸10m i n㊂扩增后产物取10μL通过1.5%琼脂凝胶电泳30m i n,最终在凝胶成像仪上观察结果㊂引物信息见表1,引物序列查阅文献[5]获得,由上海生工生物工程有限公司合成引物,并进行相应的测序分析,与目的基因㊁阳性对照条带位置的扩增产物送上海生工生物工程有限公司完成测序,基因序列在h t t p://b l a s t.n c b i.n l m.n i h.g o v/b l a s t.c g i进行比对,确定耐药基因亚型㊂1.5统计学处理采用全国细菌耐药监测网提供的W h o n e t5.6软件收集药敏试验结果,使用S P S S21.0统计软件进行分析,计数资料以例数或百分比表示,比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义㊂㊃8662㊃检验医学与临床2023年9月第20卷第18期 L a b M e d C l i n,S e p t e m b e r2023,V o l.20,N o.18Copyright©博看网. All Rights Reserved.表1 P C R 扩增碳青霉烯类耐药基因引物引物引物序列(5'-3')目的基因产物长度(b p )N D M -F G G T T T G G C G A T C T G G T T T T Cb l a N D M 621N D M -RC G G A A T G G C T C A T C A C G A T C I M P -FG G A A T A G A G T G G C T T A A Y T C T C b l a I M P 232I M P -RG G T T T A A Y A A A A C A A C C A C C K P C -F m C G T C T A G T T C T G C T G T C T T Gb l a K P C 798K P C -R m C T T G T C A T C C T T G T T A G G C G V I M -FG A T G G T G T T T G G T C G C A T A b l a V I M 390V I M -RC G A A T G C G C A G C A C C A G O X A -48-FG C G T G G T T A A G G A T G A A C A C b l a O X A -48438O X A -48-RC A T C A A G T T C A A C C C A A C C G2 结 果2.1 C R E 菌株的种类与临床分布 77株C R E 临床分离株中,肺炎克雷伯菌33株(42.9%)㊁大肠埃希菌15株(19.5%)㊁阴沟肠杆菌12株(15.6%)㊁弗劳地枸橼酸杆菌7株(9.1%)㊁雷氏普罗威登斯菌3株(3.9%)㊁产气肠杆菌3株(3.9%)㊁奇异变形杆菌2株(2.6%)㊁产酸克雷伯菌2株(2.6%)㊂77株C R E 菌株来源标本以痰液和尿液为主,其中分离自痰液33株(42.86%)㊁尿液30株(38.96%)㊁胸腔积液6株(7.79%)㊁穿刺液5株(6.49%)㊁脑脊液2株(2.60%)㊂77株C R E 菌株的科室分布:颅脑外科23株,重症医学科10株,脑卒中监护室9株,急诊科6株,泌尿外科6株,肺病科5株,肝胆胰脾科3株,胸外科3株,脑病科2株,心血管内科2株,骨六科2株,康复科2株,髋膝骨科1株,风湿肾病科1株,妇科1株,肿瘤科1株㊂2.2 C R E 菌株药敏试验结果 77株C R E 菌株中超广谱β-内酰胺酶(E S B L s )的检出率为100.0%,对替加环素敏感性最高(97.4%),其次为阿米卡星(44.2%)㊁复方磺胺甲噁唑(39.0%),对其余抗菌药物的敏感性均低于20.0%㊂大肠埃希菌对阿米卡星的敏感性为80.0%,肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌对阿米卡星的敏感性分别为48.5%和50.0%㊂见表2㊂表2 C R E 菌株对常用抗菌药物的药敏试验结果(%)抗菌药物总计(n =77)耐药敏感肺炎克雷伯菌(n =33)耐药敏感大肠埃希菌(n =15)耐药敏感阴沟肠杆菌(n =12)耐药敏感阿米卡星55.844.251.548.520.080.050.050.0头孢唑啉100.00.0100.00.0100.00.0100.00.0头孢吡肟89.610.487.912.180.020.091.78.3头孢替坦94.85.290.99.193.30.7100.00.0头孢呋辛100.00.0100.00.0100.00.0100.00.0妥布霉素83.116.969.730.386.713.391.78.3庆大霉素79.219.963.636.480.020.091.78.3亚胺培南100.00.0100.00.0100.00.0100.00.0氨曲南80.519.597.03.020.080.083.316.7美洛培南100.00.0100.00.0100.00.0100.00.0呋喃妥因98.81.293.96.154.446.6100.00.0头孢曲松100.00.0100.00.0100.00.0100.00.0头孢他啶100.00.0100.00.0100.00.0100.00.0环丙沙星98.71.3100.00.093.30.7100.00.0左氧氟沙星89.610.484.815.286.713.391.78.3复方磺胺甲噁唑61.039.036.463.680.020.050.050.0氨苄西林100.00.0100.00.0100.00.0100.00.0替加环素2.697.40.0100.00.0100.00.0100.0头孢哌酮/舒巴坦96.13.993.96.193.30.7100.00.0哌拉西林钠/他唑巴坦100.00.0100.00.0100.00.0100.00.0阿莫西林/克拉维酸100.00.0100.00.0100.00.0100.00.02.3 耐药基因扩增结果 77株C R E 菌株中74株产碳青霉烯酶,3株未检出㊂其中,33株肺炎克雷伯菌中20株携带K P C 基因,12株携带N D M 基因,1株未检出碳青霉烯酶,主要产K P C (60.6%);15株大肠埃希菌中12株携带N D M 基因,3株携带K P C 基因,主要产N D M (80.0%);12株阴沟肠杆菌携带N D M 基因(100.0%);7株耐弗劳地枸橼酸杆菌携带N D M 基因(100.0%);3株雷氏普罗威登斯菌中2株携带N D M 基因,1株未检出碳青霉烯酶;3株产气肠杆菌中1株携带N D M 基因,1株携带K P C 基因,1株未检出碳青霉烯酶;2株产酸克雷伯菌中1株携带N D M基因,1株携带I M P 基因;2株奇异变形杆菌携带N D M 基因㊂碳青霉烯酶基因型中N D M 占66.2%(49/74),K P C 占32.4%(24/74),I M P 占1.4%(1/74)㊂琼脂电泳图见图1~3㊂2.4 碳青霉烯酶表型试验结果 74株携带碳青霉烯酶基因的C R E 菌株,其中71株m C I M 试验阳性,3株m C I M 试验均阴性,m C I M 筛选碳青霉烯酶菌株的灵敏度为95.9%,特异度为100.0%㊂m C I M 阳性菌株中,肺炎克雷伯菌32株,大肠埃希菌15株,阴沟肠㊃9662㊃检验医学与临床2023年9月第20卷第18期 L a b M e d C l i n ,S e pt e m b e r 2023,V o l .20,N o .18Copyright ©博看网. All Rights Reserved.杆菌12株,弗劳地枸橼酸杆菌7株,奇异变形杆菌2株,产气肠杆菌1株,产酸克雷伯菌1株,雷氏普罗威登斯菌1株㊂m C I M 结合e C I M 试验初步判断产金属β-内酰胺酶51株(m C I M 阳性,e C I M 阳性),产丝氨酸蛋白酶20株(m C I M 阳性,e C I M 阴性)㊂ 注:M 为D L 2000D N A 标志物;1为b l a N D M 阳性对照;2为b l a N D M阴性对照;3~16为临床菌株b l a N D M阳性㊂图1 P C R 扩增菌株b l a N D M基因的电泳图注:M 为D L 2000D N A 标志物;1为b l a K P C 阳性对照;2为b l a K P C阴性对照;3~17为临床菌株b l a K P C阳性㊂图2 P C R 扩增菌株b l a K P C基因的电泳图注:M 为D L 2000D N A 标志物;1为b l a I M P 阴性对照;2为b l a I M P阳性对照;4为临床菌株b l a I M P 阳性;3㊁5~12为临床菌株b l a I M P阴性㊂图3 P C R 扩增菌株b l a I M P 基因的电泳图2.5 基因测序 耐药基因扩增结果将与目的基因㊁阳性对照条带位置的扩增产物送上海生工生物工程有限公司完成测序,基因序列在h t t p://b l a s t .n c b i .n l m.n i h .g o v /b l a s t .c gi 进行比对,确定耐药基因型为b l a K P C -2㊁b l a N D M -1㊁b l a I M P -4㊂3 讨 论C R E 是当前最受关注的耐药威胁之一,我国C R E 的流行情况也比较严重㊂中国C H I N E T 细菌耐药性监测数据表明,2005年碳青霉烯类抗菌药物对肠杆菌目细菌保持着较高的抗菌活性,耐药率低于2%;到2010年,耐药率明显上升,达到5%;肺炎克雷伯菌的耐药率已高达10%[6]㊂2018年肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率全国平均为10.1%[7],2021年肺炎克雷伯菌耐药率上升到23.1%[8],肠杆菌目细菌对碳青霉烯类抗菌药物最常见的耐药机制为产碳青霉烯酶[9]㊂因此,快速㊁准确地检测本院耐药菌是否产碳青霉烯酶,了解C R E 菌株基因分型对于临床治疗和医院感染控制至关重要㊂本研究77株C R E 菌株中,肺炎克雷伯菌占42.9%,大肠埃希菌占19.5%,阴沟肠杆菌占15.6%,其他肠杆菌目细菌占22.0%,与陆书华等[10]㊁崔超琼等[11]的研究结果接近;主要碳青霉烯酶基因型中N D M 占66.2%(49/74),K P C 占32.4%(24/74),I M P 占1.4%(1/74)㊂C R E 菌株主要分离自痰液㊁尿液㊁胸腔积液,也可分离自脑脊液㊁血液㊁穿刺液等,说明耐药株引起的感染并不仅限于呼吸㊁泌尿系统,还可能引起颅内㊁血流㊁胸腔等多部位感染,其感染的广泛性应引起临床重视㊂C R E 菌株科室分布主要是颅脑外科㊁重症医学科㊁脑卒中监护室,这与重症监护室患者病因的复杂性㊁病情危重㊁免疫力低下㊁糖皮质激素和高效广谱抗菌药物长期应用,以及侵入性操作治疗较多有关㊂本研究药敏试验结果显示,77株C R E 菌株对青霉素类㊁头孢菌素类㊁头霉素类耐药率均为90%以上,与王珍珍等[12]研究结果一致,临床应慎重经验用药,对替加环素㊁阿米卡星㊁复方磺胺甲噁唑耐药率分别为2.6%㊁55.8%㊁61.0%[13],临床可选择这些药物治疗感染者㊂按照A m b l e r 分子分类方法可将碳青霉烯酶分为3类:(1)A 类丝氨酸碳青霉烯酶,以K P C 为主,该酶活性可被阿维巴坦抑制,产酶菌株通常仅对替加环素㊁多黏菌素或头孢他啶/阿维巴坦敏感;(2)B 类金属β-内酰胺酶,以N D M 型金属酶为主,该酶活性不能被阿维巴坦抑制,产酶菌株通常仅对替加环素㊁多黏菌素敏感,少数菌株对氨曲南敏感;(3)D 类丝氨酸碳青霉烯酶,以O X A -48为主,常见于儿童患者分离的肺炎克雷伯菌,该酶活性可被阿维巴坦抑制,产酶菌株通常仅对替加环素㊁多黏菌素或头孢他啶/阿维巴坦敏感㊂C R E 感染的治疗具有挑战性,应根据药敏试验结果㊁耐药表型或基因分型㊁感染的严重程度,选择有效的治疗方案㊂本研究利用C L S I 推荐的m C I M 和e C I M 试验联合检测碳青霉烯酶表型,m C I M 筛选碳青霉烯酶菌株的灵敏度为95.9%,特异度为100.0%[1],与之符合,结合e C I M 试验初步判断产金属β-内酰胺酶51株,产丝氨酸蛋白酶20株㊂m C I M 试验操作简单,成本低,不需要特殊试剂,灵敏度和特异度高,适合所有微生物室开展㊂m C I M 与e C I M 联合检测筛选碳青霉烯酶表型,对临床选择用药具有重要意义㊂P C R 扩增结果显示,77株C R E 菌株中74株产㊃0762㊃检验医学与临床2023年9月第20卷第18期 L a b M e d C l i n ,S e pt e m b e r 2023,V o l .20,N o .18Copyright ©博看网. All Rights Reserved.碳青霉烯酶,3株未检出,而E S B L s的检出率为100.0%,可能为高产头孢菌素酶(A m p C)或高产E S-B L s合并外膜孔蛋白缺失或变异以及细菌外排泵系统改变所致[14]㊂目前常见的碳青霉烯酶为K P C㊁V I M㊁N D M㊁I M P和O X A,国内以K P C㊁N D M和I M P为主[15]㊂本研究77株菌株主要流行的碳青霉烯酶基因型依次为N D M(66.2%)㊁K P C(32.4%)和I M P(1.4%),以N D M和K P C为主[16]㊂河南部分地区和海南省5家综合医院收集的C R E菌株中,主要的耐药基因型也是N D M[17-18],本研究耐药基因K P C 的检出率低于N D M,77株C R E菌株中,仅有1株耐碳青霉烯产酸克雷伯菌检出I M P基因㊂97.0% (32/33)的肺炎克雷伯菌㊁100.0%(15/15)的大肠埃希菌,100.0%(12/12)的阴沟肠杆菌携带碳青霉烯酶基因㊂碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌主要携带K P C-2基因[19],碳青霉烯类耐药大肠埃希菌和阴沟肠杆菌主要携带N D M-1基因,与陆书华等[10]报道一致㊂K P C和N D M耐药基因均可由质粒介导,通过菌株自身克隆以及不同菌种间水平转移,是C R E流行激增的主要原因㊂K P C-2和N D M-1可水解绝大多数β-内酰胺药物,包括碳青霉烯类,不同之处在于K P C-2为丝氨酸蛋白酶,水解氨曲南,能被新型酶抑制剂阿维巴坦所抑制,而N D M-1为金属酶,不水解氨曲南,不被阿维巴坦㊁韦博巴坦等抑制㊂总之,C R E呈现广泛耐药甚至全耐药的特征,使临床抗感染治疗面临无药可用的困境,导致感染患者病死率高㊂实验室应快速鉴别产碳青霉烯酶菌株,选择早期快速筛查的方法,加快开展联合药敏试验,有效降低C R E感染患者的病死率[20]㊂临床医生应掌握医院C R E临床分布特征及耐药基因㊁细菌耐药情况,根据药敏试验结果合理选用抗菌药物;院感防控部门需加强监督检查,共同遏制C R E菌株在不同患者和不同区域间流行播散,降低医院C R E感染发生率㊂参考文献[1]喻华,徐雪松,李敏,等.肠杆菌目细菌碳青霉烯酶的实验室检测和临床报告规范专家共识[J].中国感染与化疗杂志,2020,20(6):671-680.[2]尚红,王毓三,申子瑜.全国临床检验操作规程[M].4版.北京:人民卫生出版社,2015:560-851.[3]C e n t e r s f o r D i s c a s e C o n t r o l a n d P r e v e n t i o n(C D C).F a c i l i-t y g u i d a n c e f o r c o n t r o l o f c a r b a p e n e m-r e s i s t a n t E n t e r o b a c-t e r i a c e a e(C R E)[E B/O L].[2023-04-15].h t t p s://w w w.c d c.g o v/h a i/p d f s/c r e/c r e-g u i d a n c e-508.p d f.[4]C l i n i c a l a n d L a b o r a t o r y S t a n d a r d s I n s t i t u t e.P e r f o r m a n c es t a n d a r d s f o r a n t i m i c r p b i a l s u s c e p t i b i l i t y t e s t i n g:M100-S30[S].W a y n e,P A,U S A:C L S I,2020.[5]P O I R E L L,WA L S H T R,C U V I L L I E R V,e t a l.M u l t i-p l e x P C R f o r d e t e c t i o n o f a c q u i r e d c a r b a p e n e m a s e g e n e s [J].D i a g n M i c r o b i o l I n f e c t D i s,2011,70(1):119-123.[6]周宏伟,胡燕燕,张嵘.碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的检测方法[J].检验医学,2020,10(35):971-973. [7]国家卫生计生委合理用药专家委员会,全国细菌耐药监测网.2018年全国细菌耐药监测报告[J].中国合理用药探索,2020,17(1):1-10.[8]胡付品,郭燕,朱德妹,等.2021年C H I N E T中国细菌耐药监测[J].中国感染与化疗杂志,2022,22(5):521-530.[9]T Z O U V E L E K I S L,MA R K O G I A N N A K I S A,P S I C HO-G I O U M,e t a l.C a r b a p e n e m a s e s i n K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e a n d o t h e r E n t e r o b a c t e r i a c e a e:a n e v o l v i n g c r i s i s o f g l o b a ld i me n s i o n s[J].C l i n M i c r o b i o l R e v,2012,25(4):682-707.[10]陆书华,李晓哲,刘凌云,等.山东某院耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌临床感染特征及耐药基因分析[J].检验医学, 2020,35(8):757-762.[11]崔超琼,周义正,李承彬,等.耐碳青霉烯肠杆菌科细菌的耐药性和分子特征[J].检验医学与临床,2020,17(17): 2455-2459.[12]王珍珍,赵战勤,常永超,等.耐碳青霉烯革兰阴性杆菌耐药性及耐药基因b l a K P C的分子特征[J].中国感染控制杂志,2020,10(19):857-863.[13]杨玉琪,刘家云,徐修礼,等.某院耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的临床分布特点及药物敏感性分析[J].检验医学与临床,2021,18(1):1-5.[14]刘家旭,汪志勇.耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌耐药机制及流行高危因素的研究进展[J].贵州医药,2020,44(4): 543-546.[15]孙艳.耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌耐药机制及实验室检测研究进展[J].国际检验医学杂志,2020,41(4):2011-2016.[16]王素梅,张键东,王宇凡,等.耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌耐药基因分型[J].中华医院感染学杂志,2019,29(17): 2566-2570.[17]L I U C,Q I N S,X U H,e t a l.N e w d e l h i m e t a l l o-β-l a c t a-m a s e1(N D M-1),t h e d o m i n a n t c a r b a p e n e m a s e d e t e c t e di n c a r b a p e n e m-r e s i s t a n t e n t e r o b a c t e r c l o a c a e f r o m h e n a np r o v i n c e,C h i n a[J].P L o S O n e,2015,10(8):e0135044.[18]苏屿,李天娇,龙文芳,等.海南耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的耐药基因分析[J].中国抗菌药物杂志,2018,43(9): 96-100.[19]冯渐焘,陈爱文,李笃军,等.携带b l a K P C-3基因肺炎克雷伯菌新生儿分离株的研究[J].中国实验诊断学,2020, 24(9):1453-1457.[20]丁丽,陈佰义,李敏,等.碳青霉烯类耐药革兰阴性菌联合药敏试验及报告专家共识[J].中国感染与化疗杂志2023,23(1):80-90.(收稿日期:2023-05-23修回日期:2023-07-26)㊃1762㊃检验医学与临床2023年9月第20卷第18期 L a b M e d C l i n,S e p t e m b e r2023,V o l.20,N o.18Copyright©博看网. 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大肠埃希菌的临床分布及耐药性分析摘要】目的：探讨大肠埃希菌的分布及耐药性特点，为临床抗菌药物的使用提供依据。

方法：收集我院2017年7月-2018年7月住院及门诊患者标本,培养分离出大肠埃希菌299株，并采用K-B纸片扩散法及法国梅里埃VITEK-2comPact全自动微生物分析仪进行鉴定与药物敏感试验，验证是否为产超广谱β-内酰胺酶菌株。

结果：对299株大肠埃希菌，不同来源标本来自不同病区以及产生了ELBLs的比值，药物敏感性分析均作了详细统计（见表1、2、3）。

结论：临床上亚胺培南和美罗培南可作为首选药物。

大肠埃希菌对多种常用抗生素呈现出较高的耐药性。

【关键词】大肠埃希菌临床分布耐药性 ELBLs【中图分类号】R978.1 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2019）11-0149-03大肠埃希菌（E.coli）是人类和大多数温血动物肠道中的正常菌群，当机体抵抗力下降时可成为条件致病菌，可引起患者腹泻、肺炎、尿路感染、血流感染等[1]。

近年来，由于抗菌药物的不合理使用，导致大量耐药菌株的出现，严重影响到抗菌药物的治疗效果。

熟悉其分布规律及抗菌药物的敏感性，有助于临床早期制定治疗方案。

1.资料与方法1.1 标本来源收集我院2017年7月-2018年7月门诊及住院患者（同一患者剔除重复标本）的各种临床标本，参照《全国临床检验操作规程》第4版对送检标本进行分离培养，选择经鉴定为大肠埃希菌的299份标本作为研究对象。

1.2 药敏纸片及培养基抗菌药物纸片购于赛默飞尔科技（中国）仪器有限公司，培养基采用M-H琼脂培养基购于江门市凯林贸易有限公司。

1.3 仪器与试剂采用法国生物梅里埃公司VITEK-2comPact检测系统，全自动药敏试验卡片VITEK AST-GN13为VITEK-2comPact检测系统配套产品(法国生物梅里埃公司)。

1.4 质控菌株大肠埃希菌ATCC25922，购于卫生部临床检验中心，对药敏试验每周进行一次质控。

碳青霉烯类抗生素耐药状况及耐药机理分析[摘要]目的: 探讨碳青霉烯类抗生素耐药状况及耐药机理。

方法: 利用excel表格对我院2010~2014年期间综合重症监护室中各种碳青霉烯类抗生素使用情况、用药密度、检测菌分离情况进行统计分析。

结果: 2010~2014年期间，我院综合重症监护室碳青霉烯类抗生素的用药密度分别为32.7、30.12、29.52、28.55、27.15，呈逐年下降趋势。

各年度检测率变化较小，鲍曼不动杆菌检出率呈逐年增加趋势。

非发酵革兰氏阴性菌（鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌）对碳青霉烯类抗生素的耐药率显著高于肠杆菌科细菌（大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌），耐药率随用药密度的减少变化不大。

结论: 碳青霉烯类抗生素的临床使用应慎重，注意用药的合理性。

[关键词]碳青霉烯类抗生素，耐药状况，耐药机理[Abstract] objective: to study the penicillium carbon alkene antibiotic drug resistance situation and mechanism of drug resistance. Methods: in our hospital from 2010 to 2014, using excel spreadsheet to integrated in the intensive care unit during various carbon penicillium alkene antibiotics usage, the density of medication, bacteria separation conditions were analyzed. Results: during 2010 ~ 2014, and our general intensive care unit carbon penicillium alkene antibiotic drug density were 32.7, 30.12, 29.52, 28.55, 29.52, declining trend year by year. The annual detection rate of change is small, acinetobacter baumannii incidence increased year by year. The fermentation of gram-negative bacteria (acinetobacter baumannii, pseudomonas aeruginosa) on carbon penicillium alkene antibiotic resistant rate was significantly higher than that of enterobacteriaceae bacteria (e. coli), sewer e. coli, klebsiella pneumoniae, with resistance reduction medicine density changed little. Conclusion: penicillium carbon alkene clinical use of antibiotics should be careful, pay attention to the rationality of drug use.[Key words] penicillium carbon alkene of antibiotics, drug resistance, resistance mechanism碳青霉烯类抗生素是自20世纪70年代开始研究的-内酰胺类抗生素，具有耐受性好、抗菌谱广、毒性低、抗菌活性强等优点，是目前临床上治疗重症细菌感染、肠杆菌科细菌感染、多重耐菌株感染的首选药物。

论大肠埃希菌对碳青霉烯类及喹诺酮类抗菌药物的耐药性作者：李国芳来源：《健康之友·下半月》2019年第09期【摘要】目的：对大肠杆菌对喹诺酮类抗菌药物和碳青霉烯类药物的耐药性进行论述，了解其耐药情况和分布情况，并分析危险因素。

方法：回顾分析2018年1月份到12月份收集的大肠埃希菌耐药率，并分析其潜在危险因素。

结果：一共检测出813株大肠埃希菌，主要来源是尿液标本和痰标本当中，各自占有的比例是37.8%，43.55%。

大肠埃希菌对喹诺酮类药物所产生的耐药率是63.6%%，而对碳青霉烯类药物产生的耐药率是2.2%，相比于国家所检测的大肠埃希菌耐药率53.4%，该差异具有统计做意义，P<0.05。

大肠埃希菌对左氧氟沙星和亚胺培养的耐药率和其使用强度没有相关性。

结论：需要对医院抗菌药物使用的进一步加强管理，对喹诺酮类药物和碳青霉烯类药物使用进行规范，避免出现这两类药物耐药的大肠埃希菌。

【关键词】大肠埃希菌;喹诺酮类抗菌药物;耐药性;用药强度【中图分类号】R37 【文献标识码】A 【文章编号】1002-8714（2019）09-00129-02现阶段，在临床方面，出现了逐渐增长的革兰阴性菌的检出量，越来越受到了医院的重视并且其逐渐成為主要的院内感染病原菌。

相关数据表明，在医院的临床样本当中革兰阴性菌具82.04%的检出率，大肠埃希菌具有逐渐上升的检出率。

在医院内，大肠埃希菌是很常见的感染病原菌，会造成很多部位发生感染，多耐药性患者很有可能出现脓毒血症和菌血症，对预后效果造成严重影响。

如果不合理使用抗菌药物，由于大肠埃希菌能够产生相应的酶，那么其对喹诺酮类药物和碳青霉烯类药物产生的耐药性就会逐渐增加。

相关标准和行动计划在这样的情况下得以颁布。

本实验研究三甲医院中大肠杆菌对喹诺酮类抗菌药物和碳青霉烯类药物的耐药性的情况分析，了解其耐药情况和分布情况，并且对抗菌药物耐药率和使用强度之间的关系进行分析，并分析危险因素，以此来为临床用药和合理用药提供参数。

㊀２０２１,３７(１)中国人兽共患病学报C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e sD O I :１０．３９６９/j．i s s n ．１００２－２６９４．２０２０．００．１７９ 实验研究产新德里金属βＧ内酰胺酶大肠埃希菌耐碳青霉烯类药物相关机制研究和分子分型傅芬蕊１,２,张㊀娅１,３,潘玉红１,４,曹颖平１,４,郑培烝１,４福建省自然科学基金(N o ．２０１６J ０１４６６)通讯作者:郑培烝,E m a i l :z h e n g p e i z h e n g ＠a l i y u n ．c o m ;O R C I D :００００Ｇ０００２Ｇ６３４２Ｇ０７４５作者单位:１．福建医科大学附属协和医院,福州㊀３５０００１;２．宁德市医院,宁德㊀３５２０００;３．九江学院附属医院,九江㊀３３２０００;４．福建医科大学医学技术与工程学院,福州㊀３５０００４摘㊀要:目的㊀研究某三甲医院临床分离的产新德里金属βＧ内酰胺酶(N D M )大肠埃希菌的耐药机制和分子流行病学特征.方法㊀在某三甲医院收集的耐碳青霉烯类大肠埃希菌中利用聚合酶链反应(P C R )筛查是否携带N DM 基因,通过测序确定N DM 型别并进一步检测其它碳青霉烯酶相关基因和广谱βＧ内酰胺酶类耐药基因.通过载体构建和表达研究N D M Ｇ１㊁N D M Ｇ６及N D M Ｇ９对亚胺培南的水解能力.采用多位点序列分型(M L S T )对产N D M 大肠埃希菌进行分子分型.结果㊀共筛选出８株携带N D M 大肠埃希菌,其中２株为N D M Ｇ９型,６株为N D M Ｇ６型.４株大肠埃希菌同时携带N DM Ｇ６㊁T E M 和C T X ＧM Ｇ１基因,１株同时携带N DM Ｇ６㊁T E M 和C T X ＧM Ｇ９基因.携带N DM Ｇ１㊁N DM Ｇ６与N DM Ｇ９重组菌对亚胺培南均耐药,最小抑菌浓度(M I C )分别为３２μg /m L ㊁１２８μg /m L 和６４μg /m L .产N D M 大肠埃希菌M L S T 分型结果为S T ２２６㊁S T ６４８和S T １２８４型各１株,S T １０１型５株,此５株均来源于神经内科.结论㊀首次发现同时携带N DM Ｇ６㊁T E M 和C T X ＧM Ｇ１基因和携带N DM Ｇ６㊁T E M 和C T X ＧM Ｇ９基因的大肠埃希菌,N D M Ｇ６㊁N D M Ｇ９对亚胺培南的耐药性比N D M Ｇ１强,应引起重视.M L S T 分型结果提示某三甲医院可能存在耐碳青霉烯类大肠埃希菌的院内局部传播.关键词:大肠埃希菌;耐药;新德里金属βＧ内酰胺酶;多位点序列分型中图分类号:R ３７８．２㊀㊀㊀文献标识码:A ㊀㊀㊀文章编号:１００２－２６９４(２０２１)０１－００５３－０７C a r b a p e n e m Ｇr e s i s t a n c em e c h a n i s m s a n dm o l e c u l a r t y p i n g of E s c h e r i c h i a c o l i p r o d u c i ng N e wD e lh im e t a l βＧl a c t a m a s e F U F e n Ｇr u i １,２,Z H A N G Y a １,３,P A N Y u Ｇh o n g １,４,C A O Y i n g Ｇp i n g １,４,Z H E N GP e i Ｇz h e n g１,４(１．F u j i a n M e d i c a lU n i v e r s i t y U n i o n H o s p i t a l ,F u z h o u ３５０００１,C h i n a ;２．N i n g d eM u n i c i p a lH o s p i t a l ,N i n gd e ３５２０００,C h i n a ;３．J i u j i a n g U n i v e r s i t y A f f i l i a t e d H o s p i t a l ,J i u j i a n g ３３２０００,C h i n a ;４．S c h o o l o f M e d i c a lT e c h n o l o g y a n dE n g i n e e r i n g ,F u j i a n M e d i c a lU n i v e r s i t y ,F u z h o u ３５０００４,C h i n a )A b s t r a c t :T h e a i m o f t h i ss t u d y w a s t o i n v e s t i g a t e t h er e s i s t a n c e m e c h a n i s m sa n d m o l e c u l a re p i d e m i o l o gi c a l f e a t u r e so f E s c h e r i c h i ac o l i s t r a i n s p r o d u c i n g N e wD e l h im e t a l βＧl a c t a m a s e (N D M )c o l l e c t e d i n a t h i r d c l a s sAh o s p i t a l ．N DM g e n e sw e r e s c r e e n e dw i t hP C R i n c a r b a p e n e m Ｇr e s i s t a n t E s c h e r i c h i a c o l i s t r a i n s ．T y p e s o f N DM g e n e sw e r e i d e n t i f i e db y s e q u e n c i n g ．O t h e r c a r b a p e n e m Ｇr e s i s t a n c e r e l a t e d g e n e sa n de x t e n d e d Ｇs p e c t r u m ＧβＧl a c t a m a s e g e n e sw e r ed e t e c t e db y P C Rf o r N DM g e n e p o s i t i v e s t r a i n s ．A n e x p r e s s i o n s y s t e m w a s u s e d t o e v a l u a t e t h e i m i p e n e m Ｇh y d r o l y s i s a b i l i t y o fN D M Ｇ１,N D M Ｇ６a n dN D M Ｇ９．M o l e c u l a r t y p i n g o f E s c h e r i c h i a c o l i p r o d u c i n g N D M w a s p e r f o r m e dw i t h t h em u l t i l o c u s s e q u e n c e t y p i n g (M L S T )m e t h o d ．E i g h t s t r a i n s o f E s c h e r i c h i a c o l i p r o d u c i n g N D M w e r e i d e n t i f i e d ,a m o n g wh i c hs i xw e r eN D M Ｇ６s t r a i n s ,a n dt h er e m a i n d e rw e r eN D M Ｇ９s t r a i n s ．F o u r s t r a i n so f E s c h e r i c h i ac o l i w e r ef o u n dt os i m u l t a n e o u s l y c a r r y N DM Ｇ６,T E M a n d C T X ＧM Ｇ１g e n e s ,a n do n e s t r a i nw a s f o u n d t o s i m u l t a n e o u s l y c a r r y N DM Ｇ６,T E M a n d C T X ＧM Ｇ９g e n e s ．R e c o m b i n a n t E s c h e r i c h i a c o l i s t r a i n s e x p r e s s i n gN DM Ｇ１,N DM Ｇ６a n d N DM Ｇ９g e n e sw e r e r e s i s t a n t t o i m i pe n e m ,w i t h m i n i m u mi n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n so f３２μg /m L ,１２８μg/m La n d６４μg /m L ,r e s p e c t i v e l y．M L S Tr e v e a l e d f o u r d i s t i n c t s e Ｇq u e n c e t y p e s (S T s ),a m o n g wh i c h f i v e s t r a i n s o f S T １０１w e r e c o l Ｇl e c t e d f r o mt h en e u r o l o g i c a l u n i t ,a n d t h e r e m a i n i n g t h r e e s t r a i n s w e r eS T ２２６,S T ６４８a n dS T １２８４,r e s p e c t i v e l y ．T h i s s t u d y r e po r t s t h e f i r s t i d e n t i f i c a t i o no f E s c h e r i c h i ac o l i s i m u l t a n e o u s l y c a r r y i n g N DM Ｇ６,T E M a n d C T X ＧM Ｇ１g e n e s ,o r N DM Ｇ６,T E M a n d ３５C T XＧMＧ９g e n e s．N o t a b l y,ND MＧ６w a s a s s o c i a t e dw i t h t h eh i g h e s t i m i p e n e mh y d r o l y s i s a b i l i t y,a n dw a s f o l l o w e db y N D MＧ９a n dN D MＧ１．T h eM L S Tr e s u l t s i n d i c a t e d t h a t an o s o c o m i a l i n f e c t i o no f c a r b a p e n e mＧr e s i s t a n tE s c h e r i c h i a c o l i o c c u r r e d l o c a l l y i na t h i r d c l a s sAh o s p i t a l．K e y w o r d s:E s c h e r i c h i a c o l i;r e s i s t a n c e;N e w D e l h im e t a l l oＧβＧl a c t a m a s e;m u l t i l o c u s s e q u e n c e t y p i n gS u p p o r t e db y t h eN a t u r a l S c i e n c eF o u n d a t i o no fF u j i a nP r o v i n c e(N o．２０１６J０１４６６)C o r r e s p o n d i n g a u t h o r:Z h e n g P e iＧz h e n g,E m a i l:z h e n g p e i z h e n g＠a l i y u n．c o m㊀㊀大肠埃希菌是引起人类各种感染如泌尿道㊁呼吸道㊁创面伤口的感染以及菌血症常见的病原体之一.近年来,由于抗菌药物使用不规范,大肠埃希菌对抗菌药物的耐药性明显增强,出现耐碳青霉烯类药物的大肠埃希菌.根据全国耐药性监测网２０１８年的数据,大肠埃希菌对碳青霉烯类药物全国平均耐药率为１．５％.碳青霉烯类药物是目前临床上控制革兰阴性菌感染最有效的抗生素之一,对大肠埃希菌具有强大抗菌活性,一旦出现耐药,将使得感染后的治疗变得十分困难.大肠埃希菌对碳青霉烯类药物最常见的耐药机制是产碳青霉烯酶[１].碳青霉烯酶是指所有能水解碳青霉烯类的βＧ内酰胺酶,依据A m b l e r分子分类将碳青霉烯酶分为A类碳青霉烯酶㊁B类金属βＧ内酰胺酶(M e t a l l oＧβＧl a c t a m a s e,M B L)和D类苯唑西林酶(O x a c i l l i n a s e,O X A).自２００９年在印度分离的大肠埃希菌中发现新德里金属βＧ内酰胺酶１(N e w D e l h im e t a l l oＧβＧl a c t a m a s eＧ１,N D MＧ１)以来,产N D M型酶的大肠埃希菌在世界范围内被广泛报道,而亚洲大陆被认为是主要的流行区域,特别是中国和印度[２],目前已发现２０多种型别的N D M.本文收集来自住院患者的耐碳青霉烯类药物大肠埃希菌８株,对其耐药机制和分子分型进行研究,结果报道如下.１㊀材料和方法１．１㊀菌株来源㊀从住院患者临床标本中分离的８株对亚胺培南耐药的大肠埃希菌.１．２㊀仪器与试剂㊀V I T E KＧ２c o m p a c t全自动微生物分析仪㊁革兰阴性细菌鉴定卡(G N)㊁药敏卡片(A S TＧG N１６)㊁亚胺培南E t e s t试纸条(法国生物梅里埃公司)㊁P C R扩增仪(美国A p p l i e dB i o s y s t e m s 公司)㊁凝胶成像分析系统(美国B I OＧR A D公司)㊁T a q D N A聚合酶(２．５U/μL)㊁d N T P(２．５mm o l/L)㊁D N A纯化回收试剂盒㊁质粒小提试剂盒及T O P１０感受态细胞(北京天根生化科技有限公司)㊁p C R２．１载体(２５n g/μL)(美国I n v i t r o g e n生命技术公司)㊁MＧH琼脂(英国O x o i d公司)㊁引物的合成及P C R产物测序(上海博尚生物技术有限公司).１．３㊀方㊀法１．３．１㊀菌株鉴定与药敏㊀使用V I T E KＧ２c o m p a c t 全自动微生物分析仪进行菌株鉴定和药敏.采用亚胺培南E t e s t试纸条对亚胺培南耐药性进行验证.药敏结果根据２０１９年C L S I的抗菌药物敏感性试验标准进行判断.以大肠埃希菌A T C C２５９２２为质控菌株.１．３．２㊀碳青霉烯酶基因检测及测序㊀煮沸法提取细菌D N A模板,采用P C R法扩增常见的A类碳青霉烯酶基因(K P C㊁G E S㊁S M E㊁I M I/NM C)㊁B类金属酶基因(N DMＧl i k e㊁I MPＧl i k e㊁V I MＧl i k e㊁S I MＧ１㊁G I MＧ１和S P M)㊁D类苯唑西林酶基因(O X AＧ２３Ｇl i k e㊁O X AＧ２４Ｇl i k e㊁O X AＧ５８Ｇl i k e和O X AＧ１４３Ｇl i k e)和广谱βＧ内酰胺酶类耐药基因(S HV㊁T E M㊁C T XＧMＧ１群㊁C T XＧMＧ２群㊁C T XＧMＧ８群㊁C T XＧMＧ９群和C T XＧMＧ２５群).P C R的扩增体系均为２５μL:上下游引物各０．５μL(１０μmm o l/L),１μL模版D N A,２．５μL１０ˑT a q B u f fＧe r,２μLd N T P,０．５μLT a q聚合酶(２．５U/μL),用灭菌水补足至２５μL.反应参数为:９４ħ预变性５m i n;９４ħ３０s,５５ħ３０s,７２ħ１m i n,循环３０次;７２ħ延伸１０m i n.扩增产物用１％琼脂糖凝胶进行电泳,凝胶成像分析系统进行结果观察.电泳阳性产物送测序公司纯化并双向测序,所得测序结果使用B L A S T与G e n B a n k中的序列进行比对. N DMＧl i k e基因阳性的标本再用N DMＧf u l l引物扩增N DM型基因全长,经测序确定具体的N DM基因型别.引物名称㊁引物序列及预计产物长度见表１.４５中国人兽共患病学报２０２１,３７(１)表１㊀扩增耐药基因相关引物信息T a b ．１㊀P r i m e r i n f o r m a t i o n f o r r e s i s t a n c e g e n e a m pl i f i c a t i o n 引物名称引物序列(５ᶄＧ３ᶄ)扩增产物长度/b p参考文献K P C 上游:C G G T G T G T A C G C G A T G G A T A ５７４本文下游:T C C G G T T T T G T C T C C G A C T G G E S 上游:C G G T T T C T A G C A T C G G G A C A ３２１本文下游:C G T T T G G T T T C C G A T C A G C C S M E 上游:A T A G C G A C A A T G G G G C A A C A ３００本文下游:C A G C A G G A A C A C T A G C A C G AI M I /NM C上游:A T C G G T G G T C C T G A G G G T A T ３０１本文下游:C G T A T G C T C C G C A A C T A C C AO X A Ｇ２３Ｇl i k e 上游:G A T C G G A T T G G A G A A C C A G A ５０１[３]下游:A T T T C T G A C C G C A T T T C C A T O X A Ｇ２４Ｇl i k e 上游:G G T T A G T T G G C C C C C T T A A A２４６[３]下游:A G T T G A G C G A A A A G G G G A T T O X A Ｇ５１Ｇl i k e 上游:T A A T G C T T T G A T C G G C C T T G ３５３[４]下游:T G G A T T G C A C T T C A T C T T G G O X A Ｇ５８Ｇl i k e 上游:A A G T A T T G G G G C T T G T G C T G ５９９[３]下游:C C C C T C T G C G C T C T A C A T A CO X A Ｇ１４３Ｇl i k e 上游:T G G C A C T T T C A G C A G T T C C T１４９[５]下游:T A A T C T T G A G G G G G C C A A C CI M P Ｇl i k e 上游:G A A T A G (A /G )(A /G )T G G C T T A A (C /T )T C T C １８８[６]下游:C C A A A C (C /T )A C T A (G /C )G T T A T C V I M Ｇl i k e 上游:G T T T G G T C G C A T A T C G C A A C ３８２[６]下游:A A T G C G C A G C A C C A G G A T A G S I M Ｇ１上游:G T A C A A G G G A T T C G G C A T C G ５６９[６]下游:T G G C C T G T T C C C A T G T G A GG I M Ｇ１上游:T C A A T T A G C T C T T G G G C T G A C ７２[６]下游:C G G A A C G A C C A T T T G A A T G G S P M 上游:C T A A A T C G A G A G C C C T G C T T G ７９８[６]下游:C C T T T T C C G C G A C C T T G A T C N DM Ｇl i k e 上游:T C C T C A A C T G G A T C A A G C A G G ２４９本文下游:A A A A T A C C T T G A G C G G G C C A N DM Ｇf u l l 上游:A T G G A A T T G C C C A A T A T T A T G C A C ８１３[７]下游:T C A G C G C A G C T T G T C G G CP r e ＧN DM Ｇf u l l 上游:C A C C T C A T G T T T G A A T T C G C C ９８４[８]下游:C T C T G T C A C A T C G A A A T C G C S H V 上游:A G G A T T G A C T G C C T T T T T G ３９３[９]下游:A T T T G C T G A T T T C G C T C GT E M 上游:A T G A G T A T T C A A C A T T T C C G８５８[１０]下游:C C A A T G C T T A A T C A G T G A G G C T X ＧM Ｇ１群上游:G G T T T A A A A A A T C A C T G C G T C８３３[１１]下游:T T G G T G A C G A T T T T A G C C G C５５１期傅芬蕊,等:产新德里金属βＧ内酰胺酶大肠埃希菌耐碳青霉烯类药物相关机制研究和分子分型表１(续)引物名称引物序列(５ᶄＧ３ᶄ)扩增产物长度/b p参考文献C T X ＧM Ｇ２群上游:A T G A T G A C T C A G A G C A T T C G ８６５[１２]下游:T G G G T T A C G A T T T T C G C C G C C T X ＧM Ｇ８群上游:A T G A T A G A G A C A T C G C G T T A A G ８６０[１３]下游:C G G T G A C G A T T T T C G C G G C A G C T X ＧM Ｇ９群上游:A T G G T G A C A A A G A G A G T G C A ８６３[１２]下游:C C C T T C G G C G A T G A T T C T C C T X ＧM Ｇ２５群上游:C A C A C G A A T T G A A T G T T C A G９２３[１４]下游:T C A C T C C A C A T G G T G A G T １．３．３㊀N D M Ｇ１㊁N D M Ｇ６与N D M Ｇ９酶水解亚胺培南能力的比较㊀实验分为８组,见表２.分别扩增含与不含启动子序列的N DM Ｇ１㊁N DM Ｇ６及N DM Ｇ９型基因全长(携带N DM Ｇ１型基因的菌株来源于本实验室保存的菌株),引物分别为P r e ＧN DM Ｇfu l l 与N DM Ｇf u l l ,引物序列见表１,反应体系及条件同上.按D N A 纯化回收试剂盒方法对上述基因全长进行纯化,根据p C R２．１载体试剂说明书进行转化.根据抗性筛选与蓝白筛选挑选转化成功的重组T O P １０感受态细胞,进行P C R 检测耐药基因,测序证实转化是否成功和N D M 型别是否正确,琼脂稀释法测亚胺培南M I C 值.表２㊀N D M Ｇ１㊁N D M Ｇ６及N D M Ｇ９水解亚胺培南能力试验分组情况T a b ．２㊀G r o u p e d e v a l u a t i o no f t h e i m i p e n e m Ｇh y d r o l ys i s a b i l i t y o fN D M Ｇ１,N D M Ｇ６a n dN D M Ｇ９菌株解释㊀T O P １０T O P １０感受态细胞T O P １０＋p C R２．１含空载体的重组菌T O P １０＋p C R２．１＋N DM Ｇ１含N DM Ｇ１全长基因的重组菌T O P １０＋p C R２．１＋N DM Ｇ６含N DM Ｇ６全长基因的重组菌T O P １０＋p C R２．１＋N DM Ｇ９含N DM Ｇ９全长基因的重组菌T O P １０＋p C R ２．１＋P r e ＧN DM Ｇ１含启动子和N DM Ｇ１全长基因的重组菌T O P １０＋p C R ２．１＋P r e ＧN DM Ｇ６含启动子和N DM Ｇ６全长基因的重组菌T O P １０＋p C R ２．１＋P r e ＧN DM Ｇ９含启动子和N DM Ｇ９全长基因的重组菌１．３．４㊀多位点序列分型(M L S T )㊀对携带有N DM 基因的８株大肠埃希菌进行分型,P C R 扩增７个管家基因,即a d k ㊁f u m C ㊁g y r B ㊁i c d ㊁m d h ㊁pu r A 和r e c A ,所用引物序列及预计产物长度参考网站(h t Ｇt ps ://e n t e r o b a s e ．r e a d t h e d o c s ．i o /e n /l a t e s t /m l s t /m l s t Ｇl e g a c yＧi n f o Ｇe c o l i ．h t m l ).P C R 的扩增体系及扩增参数同上.扩增的P C R 产物的测序结果提交到p u b M L S T 数据库进行在线序列比对获得序列型.２㊀结㊀果２．１㊀菌株鉴定与表型筛查结果㊀本次收集的８株大肠埃希菌,经鉴定均为对亚胺培南不敏感的大肠埃希菌.经亚胺培南E t e s t 试纸法验证所有菌株均对亚胺培南不敏感.见表３.２．２㊀碳青霉烯酶基因筛查与测序结果㊀８株对亚胺培南不敏感大肠埃希菌所测A 类和D 类碳青霉烯酶基因均为阴性,B 类碳青霉烯酶基因中除N DM Ｇl i k e 基因为阳性外,其余均为阴性;广谱βＧ内酰胺酶基因中７株T E M 基因阳性,４株C T X ＧM Ｇ１基因阳性,１株C T X ＧM Ｇ９基因阳性,具体见表３.扩增８株N DM 基因全长,电泳结果与预计条带大小(８１３b p )相近,如图１所示.将P C R 产物进行双向测序,序列经比对分析,６株为携带N DM Ｇ６基因,２株为携带N DM Ｇ９基因,见表３.２．３㊀N D M Ｇ１㊁N D M Ｇ６和N D M Ｇ９水解亚胺培南能力结果㊀以T O P １０感受态细胞和含有空载体的重组菌作为阴性对照,仅含有N DM Ｇ１Ｇfu l l 基因㊁N DM Ｇ６Ｇf u l l 基因和N DM Ｇ９Ｇf u l l 基因的重组菌,因不含启动子,N DM 型基因无法表达,故表现为对亚胺培南敏感,与阴性对照组结果相同,M I C 值均为０．２５μg /m L .而含有P r e ＧN DM Ｇ１Ｇfu l l 基因㊁６５中国人兽共患病学报２０２１,３７(１)表３㊀８株产新德里金属βＧ内酰胺酶大肠杆菌临床相关信息㊁耐药基因检测及分子分型结果T a b ．３㊀R e l a t e d c l i n i c a l i n f o r m a t i o n ,r e s i s t a n c e g e n e d e t e c t i o na n dm o l e c u l a r t y p i n g o f e i gh t s t r a i n s o f E s c h e r i c h i a c o l i p r o d u c i n g N e wD e l h im e t a l βＧl a c t a m a s e 科室年龄(岁)标本类型亚胺培南E t e s t 试纸法碳青霉烯酶基因广谱βＧ内酰胺酶基因M L S T分型结果康复科５３中段尿＞３２(R )N DM Ｇ６T E M S T １０１神经内科８６中段尿８(R )N DM Ｇ６T E M ,C T X ＧM Ｇ１S T １０１神经内科８１中段尿４(R )N DM Ｇ６T E M ,C T X ＧM Ｇ１S T １０１神经内科８４中段尿＞３２(R )N DM Ｇ６T E M ,C T X ＧM Ｇ１S T １０１神经内科６７中段尿＞３２(R )N DM Ｇ６T E M ,C T X ＧM Ｇ１S T １０１血液科６０分泌物３(I )N DM Ｇ６T E M ,C T X ＧM Ｇ９S T ６４８呼吸内科６４痰２(I)N DM Ｇ９－S T １２８４小儿外科１７分泌物１２(R )N DM Ｇ９T E MS T ２２６１Ｇ８分别为８株待检菌株;M 为D N A m a r k e r;阴性为阴性对照图１㊀N D M 基因扩增产物电泳图F i g ．１㊀E l e c t r o ph o r e s i s o fP C R p r o d u c t s o f t h e N D M g e n e P r e ＧN DM Ｇ６Ｇf u l l 基因及P r e ＧN DM Ｇ９Ｇf u l l 型基因的重组菌对亚胺培南均耐药,对亚胺培南的M I C 值分别为３２μg /m L ㊁１２８μg /m L 和６４μg/m L .２．４㊀M L S T 结果㊀对该８株耐药大肠埃希菌进行分子分型,S T １０１型有５株㊁S T ２２６㊁S T ６４８和S T １２８４型各１株.见表３.３㊀讨㊀论自２００９年首次发现产N D M Ｇ１酶的菌株以来,产N D M 型酶的菌株迅速向其他国家播散,在世界各地均有发现并报道.我国及世界上流行的分离菌中检出率较高的N D M 型酶基因主要为N DM Ｇ１和N DM Ｇ５[１５].本次实验在８株大肠埃希菌中均检测出N DM 基因,其中６株携带N DM Ｇ６基因,２株携带N DM Ｇ９基因.而N DM Ｇ６基因在２０１２年第一次从新西兰病人携带的大肠杆菌中鉴定出来以来[１６],国内外关于N DM Ｇ６基因报道均较少见.N DM Ｇ９基因是我国学者２０１４年在肺炎克雷伯菌中首次报道发现[１７],目前已在韩国㊁我国大陆及台湾地区等地均发现了携带N DM Ｇ９基因的大肠杆菌㊁肺炎克雷伯菌等细菌[１８].为了进一步分析菌株耐药基因的携带情况,还筛查８株耐药菌的广谱βＧ内酰胺酶基因,发现大肠埃希菌中存在多种耐药基因共存现象,几乎所有的耐药菌株均携带有T E M 基因,４株耐药菌同时携带有N DM Ｇ６㊁T E M 和C T X ＧM Ｇ１基因,１株同时携带N DM Ｇ６㊁T E M 和C T X ＧM Ｇ９基因,目前国内外均未见此类报道.本文结果显示N D M Ｇ１㊁N D M Ｇ６和N D M Ｇ９水解亚胺培南能力从强到弱依次为N D M Ｇ６㊁N D M Ｇ９和N D M Ｇ１,文献中未见同时比较以上３种型别N D M 水解亚胺培南能力的报道.对于N DM 型基因,目前已发现了２０多个型别,而它们之间大多只有几个碱基的不同.N DM Ｇ６基因㊁N DM Ｇ９基因与N DM Ｇ１基因的区别是分别在基因６９８位置(CңT )和４５４位置(GңA )上存在有一个碱基的改变,从而导致氨基酸分别由丙氨酸转变为缬氨酸㊁谷氨酸转变为赖氨酸.氨基酸的改变会影响N D M 蛋白的二级结构,可能改变N D M 蛋白的空间结构,从而改变N D M 与底物即碳青霉烯类药物的结合特性,表现出不同的水解能力.不同类型的N D M 水解碳青霉烯类药物的具体机制有待进一步研究.本次研究还采用M L S T 法对８株耐药大肠埃希菌进行分型,结果为:５株携带N DM Ｇ６基因大肠埃希菌为S T １０１型,１株携带N DM Ｇ６基因大肠埃７５１期傅芬蕊,等:产新德里金属βＧ内酰胺酶大肠埃希菌耐碳青霉烯类药物相关机制研究和分子分型希菌为S T６４８型,有２株携带N DMＧ９基因大肠埃希菌分别为S T２２６型和S T１２８４型.在２０１２年首次报道产N DMＧ６基因的大肠埃希菌,其分型结果也为S T１０１型,而在国外报道,产N DM型基因的大肠埃希菌中,也有发现其M L S T分型结果为S T１０１型[１９],提示大肠埃希菌S T１０１型与N D M型碳青霉烯酶基因关系密切.S T６４８型大肠埃希菌常在产超广谱βＧ内酰胺酶的大肠埃希菌中发现[２０],在英国㊁日本分别首次报道产N DMＧ５和N DMＧ７基因的大肠埃希菌,其分型结果均为S T６４８型[２１],国内学者也有在S T６４８型大肠埃希菌中发现N DMＧ５基因,但并未检测出携带有N DMＧ６基因,国际上也并未发现携带有N DMＧ６基因的S T６４８型.产N DM基因的S T１２８４型大肠埃希菌在国内外鲜有报道发现,第一次在S T１２８４型大肠埃希菌中检出N DMＧ５基因是在２０１５年,而后虽有再次检出N DMＧ５基因,但到目前为止未检出携带有包括N DMＧ９基因在内其它N DM型基因.国内外均未在S T２２６型大肠埃希菌中发现N DM型基因.本次分离的８株耐药大肠埃希菌有５株M L S T 分型结果一致,均为S T１０１型,且均检出N DMＧ６基因.其中４株来自神经内科患者,１株来自康复科患者.通过查阅临床相关资料发现,这位康复科患者是在神经内科治疗一段时间后转入康复科的,且与２号患者曾在同一个病房治疗.２号患者长期卧床治疗,在其住院期间,３号㊁４号和５号患者也在神经内科治疗,而且３号和４号患者前后入住同一张病床.以上患者多为免疫力低下㊁有留置导尿管史和长期卧床的老年人.综合以上因素提示这些病人极有可能是在医院内发生了交叉感染.对此,临床上应尽量缩短留置导尿管的时间㊁合理使用抗菌药物㊁规范医护人员的操作和加强对各种医疗器械的消毒措施,同时应重视并加强院感监控力度,避免耐药菌株的传播和医院内感染的发生.利益冲突:无引用本文格式:傅芬蕊,张娅,潘玉红,等．产新德里金属βＧ内酰胺酶大肠埃希菌耐碳青霉烯类药物相关机制研究和分子分型[J]．中国人兽共患病学报,２０２１,３７(１):５３Ｇ５９．D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１００２Ｇ２６９４．２０２０．００．１７９参考文献:[１]T a nK,N g u y e n J,N g u y e nK,e t a l．P r e v a l e n c e o f t h e c a r b a p e nＧe mＧh e t e r o r e s i s t a n t p h e n o t y p e a m o n g E S B LＧp r o d u c i n g E s c h eＧr i c h i a c o l i a n dK l e b s i e l l a p n e u m o n i a e c l i n i c a l i s o l a t e s[J]．JA n t iＧm i c r o bC h e m o t h e r,２０２０,７５(６):１５０６Ｇ１５１２．D O I:１０．１０９３/j a c/ d k a a０４８[２]L i J,Y uT,T a oX Y,e t a l．E m e r g e n c e o f a nN D MＧ５Ｇp r o d u c i n g E s c h e r i c h i a c o l i s e q u e n c e t y p e４１０c l o n e i n i n f a n t s i n a c h i l d r e n s h o s p i t a l i n C h i n a[J]．I n f e c t D r u g R e s i s t,２０２０,１３:７０３Ｇ７１０．D O I:１０．２１４７/I D R．S２４４８７４[３]W o o d f o r dN,E l l i n g t o n M J,C o e l h oJ M,e t a l．M u l t i p l e xP C R f o r g e n e se n c o d i n gp r e v a l e n tO X Ac a r b a p e n e m a s e s i n A c i n e t oＧb a c t e r s p p[J]．I n t JA n t i m i c r o bA g e n t s,２００６,２７(４):３５１Ｇ３５３．D O I:１０．１０１６/j．i j a n t i m i c a g．２００６．０１．００４[４]B r o w nS,Y o u n g H K,A m y e s S G．C h a r a c t e r i s a t i o n o fO X AＧ５１, an o v e lc l a s s D c a r b a p e n e m a s ef o u n di n g e n e t i c a l l y u n r e l a t e d c l i n i c a l s t r a i n so f A c i n e t o b a c t e rb a u m a n n i i f r o m A r g e n t i n a[J]．C l i n M i c r o b i o l I n f e c t,２００５,１１(１):１５Ｇ２３．D O I:１０．１１１１/j．１４６９Ｇ０６９１．２００４．０１０１６．x[５]H i g g i n sP G,L e h m a n n M,S e i f e r t H．I n c l u s i o no f O X AＧ１４３p r i m e r si na m u l t i p l e x p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n(P C R)f o r g e n e s e n c o d i n gp r e v a l e n tO X Ac a r b a p e n e m a s e s i n A c i n e t o b a c t e r s p p[J]．I n tJA n t i m i c r o b A g e n t s,２０１０,３５(３):３０５．D O I:１０．１０１６/j．i j a n t i m i c a g．２００９．１０．０１４[６]M e n d e sR E,K i y o t aK A,M o n t e i r o J,e t a l．R a p i dd e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o no fm e t a l l oＧb e t aＧl a c t a m a s eＧe n c o d i n g g e n e s b y m u l t iＧp l e x r e a lＧt i m eP C Ra s s a y a n dm e l t c u r v e a n a l y s i s[J]．JC l i n M iＧc r o b i o l,２００７,４５(２):５４４Ｇ５４７．D O I:１０．１１２８/J C M．０１７２８Ｇ０６[７]H o r n s e y M,P h e eL,W a r e h a m D W．An o v e l v a r i a n t,N D MＧ５, o ft h e N e w D e l h im e t a l l oＧβＧl a c t a m a s ei na m u l t i d r u gＧr e s i s t a n t E s c h e r i c h i a c o l i S T６４８i s o l a t e r e c o v e r e d f r o ma p a t i e n t i n t h eUＧn i t e dK i n g d o m[J]．A n t i m i c r o b A g e n t s C h e m o t h e r,２０１１,５５(１２):５９５２Ｇ５９５４．D O I:１０．１１２８/A A C．０５１０８Ｇ１１[８]K a a s eM,N o r d m a n nP,W i c h e l h a u sT A,e t a l．N D MＧ２c a r b a pＧe n e m a s e i n A c i n e t o b a c t e r b a u m a n n i i f r o m E g y p t[J]．JA n t i m iＧc r o bC h e m o t h e r,２０１１,６６(６):１２６０Ｇ１２６２．D O I:１０．１０９３/j a c/d k r１３５[９]B h a t t a c h a r j e eA,S e n M R,P r a k a s hP,e t a l．R o l e o f b e t aＧl a c t aＧm a s e i n h i b i t o r s i ne n t e r o b a c t e r i a l i s o l a t e s p r o d u c i n g e x t e n d e dＧs p e c t r u mb e t aＧl a c t a m a s e s[J]．JA n t i m i c r o bC h e m o t h e r,２００８,６１(２):３０９Ｇ３１４．D O I:１０．１０９３/j a c/d k m４９４[１０]T o n k iM,M o h a rB,Šišk oＧK r a l j e v iK,e t a l．H i g h p r e v a l e n c e a n d m o l e c u l a rc h a r a c t e r i z a t i o n o fe x t e n d e dＧs p e c t r u mβＧl a c t aＧm a s eＧp r o d u c i n g P r o t e u s m i r a b i l i s s t r a i n s i ns o u t h e r nC r o a t i a [J]．J M e d M i c r o b i o l,２０１０,５９(P t１０):１１８５Ｇ１１９０．D O I:１０．１０９９/j mm．０．０１６９６４Ｇ０[１１]P a r kY J,L e eS,K i m Y R,e t a l．O c c u r r e n c e o f e x t e n d e dＧs p e cＧt r u m(b e t a)Ｇl a c t a m a s e sa n d p l a s m i dＧm e d i a t e d A m p C(b e t a)Ｇl a c t a m a s e s a m o n g K o r e a ni s o l a t e so f P r o t e u s m i r a b i l i s[J]．JA n t i m i c r o bC h e m o t h e r,２００６,５７(１):１５６Ｇ１５８．D O I:１０．１０９３/ j a c/d k i４０８[１２]G a r r e cH,D r i e u xＧR o u z e t L,G o l m a r d J L,e t a l．C o m p a r i s o n o f n i n e p h e n o t y p i c m e t h o d sf o rd e t e c t i o n o fe x t e n d e dＧs p e c t r u mb e t aＧl ac t a m a s e p r od u c t i o nb y E n te r o b a c t e r i a c e a e[J]．JC l i nM iＧc r o b i o l,２０１１,４９(３):１０４８Ｇ１０５７．D O I:１０．１１２８/J C M．０２１３０Ｇ１０[１３]N a v o nＧV e n e z i a S,C h m e l n i t s k y I,L e a v i t tA,e t a l．D i s s e m i n aＧt i o no f t h e C T XＧMＧ２５f a m i l y b e t aＧl a c t a m a s e s a m o n g K l e b s i e l l a８５中国人兽共患病学报２０２１,３７(１)p n e u m o n i a e,E s c h e r i c h i a c o l i a n d E n t e r o b a c t e rc l o a c a e a n d iＧd e n t i f i c a t i o no f t h en o v e l e n z y m eC T XＧMＧ４１i n P r o t e u sm i r aＧb i l i s i n I s r a e l[J]．JA n t i m i c r o bC h e m o t h e r,２００８,６２(２):２８９Ｇ２９５．D O I:１０．１０９３/j a c/d k n１８２[１４]G o r e nM G,N a v o nＧV e n e z i a S,C h m e l n i t s k y I,e t a l．C a r b a p e nＧe mＧr e s i s t a n tK P CＧ２Ｇp r o d u c i n g E s c h e r i c h i ac o l i i na T e lA v i vM e d i c a lC e n t e r,２００５t o２００８[J]．A n t i m i c r o b A g e n t s C h eＧm o t h e r,２０１０,５４(６):２６８７Ｇ２６９１．D O I:１０．１１２８/A A C．０１３５９Ｇ０９[１５]Z o u H,J i aX,L i u H,e t a l．E m e r g e n c eo fN D MＧ５Ｇp r o d u c i n g E s c h e r i c h i ac o l i i nat e a c h i n g h o s p i t a l i nC h o n g q i n g,C h i n a: I n c FＧt y p e p l a s m i d s m a y c o n t r i b u t e t o t h e p r e v a l e n c e o f b l a N D MＧ５[J]．F r o n tM i c r o b i o l,２０２０,１１:３３４．D O I:１０．３３８９/ f m i c b．２０２０．００３３４[１６]W i l l i a m s o nD A,S i d j a b a tH E,F r e e m a nJ T,e ta l．I d e n t i f i c aＧt i o na n dm o l e c u l a r c h a r a c t e r i s a t i o no fN e wD e l h im e t a l l oＧβＧl a cＧt a m a s eＧ１(N D MＧ１)Ｇa n d N D MＧ６Ｇp r o d u c i n g E n t e r o b a c t e r i a c e a e f r o m N e w Z e a l a n d h o s p i t a l s[J]．I n tJ A n t i m i c r o b A g e n t s,２０１２,３９(６):５２９Ｇ５３３．D O I:１０．１０１６/j．i j a n t i m i c a g．２０１２．０２．０１７[１７]W a n g X,L iH,Z h a oC,e t a l．N o v e lN D MＧ９m e t a l l oＧβＧl a c t aＧm a s e i d e n t i f i e d f r o maS T１０７K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e s t r a i n iＧs o l a t e d i nC h i n a[J]．I n t JA n t i m i c r o bA g e n t s,２０１４,４４:９０Ｇ９１．D O I:１０．１０１６/j．i j a n t i m i c a g．２０１４．０４．０１０[１８]L i nY C,K u r o d a M,S u z u k i S,e t a l．E m e r g e n c eo f a n E s c h eＧr i c h i a c o l i s t r a i n c oＧh a r b o u r i n g m c rＧ１a n db l a N D MＧ９f r o ma uＧr i n a r y t r a c t i n f e c t i o n i nT a i w a n[J]．JG l o bA n t i m i c r o bR e s i s t,２０１９,１６:２８６Ｇ２９０．D O I:１０．１０１６/j．j g a r．２０１８．１０．００３[１９]Q a m a rMU,W a l s hT R,T o l e m a nMA,e t a l．D i s s e m i n a t i o n o f g e n e t i c a l l y d i v e r s e N D MＧ１,Ｇ５,Ｇ７p r o d u c i n gＧG r a mＧn e g a t i v e p a t h o g e n s i s o l a t e d f r o m p e d i a t r i c p a t i e n t s i nP a k i s t a n[J]．F uＧt u r eM i c r o b i o l,２０１９,１４(１):６９１Ｇ７０４．D O I:１０．２２１７/f m bＧ２０１９Ｇ００１２[２０]P e i r a n oG,P i t o u t J D D．E x t e n d e dＧS p e c t r u mβＧL a c t a m a s eＧP r oＧd u c i n g E n t e r o b a c t e r i a c e a e:u p d a t eo n m o l e c u l a re p i d e m i o l o g y a n dt r e a t m e n to p t i o n s[J]．D r u g s,２０１９,７９(１４):１５２９Ｇ１５４１．D O I:１０．１００７/s４０２６５Ｇ０１９Ｇ０１１８０Ｇ３[２１]M i z u n oY,Y a m a g u c h iT,M a t s u m o t oT．Af i r s t c a s eo fN e wD e l h im e t a l l oＧβＧl a c t a m a s eＧ７i na nE s c h e r i c h i ac o l i S T６４８i s oＧl a t e i nJ a p a n[J]．J I n f e c tC h e m o t h e r,２０１４,２０(１２):８１４Ｇ８１６．D O I:１０．１０１６/j．j i a c．２０１４．０８．００９收稿日期:２０２０Ｇ０５Ｇ２２㊀编辑:张智芳(上接第５２页)[２９]S c h e y K L,W a n g Z,W e n k e J L,e t a l．A q u a p o r i n s i n t h e e y e: e x p r e s s i o n,f u n c t i o n,a n dr o l e s i no c u l a rd i s e a s e[J]．B i o c h i mB i o p h y sA c t a,２０１４,１８４０(５):１５１３Ｇ１５２３．D O I:１０．１０１６/j．b b a g e n．２０１３．１０．０３７[３０]H i b u s eT,M a e d aN,N a g a s a w aA,e t a l．A q u a p o r i n s a n d g l y cＧe r o lm e t a b o l i s m[J]．B i o c h i m B i o p h y sA c t a,２００６,１７５８(８):１００４Ｇ１０１１．D O I:１０．１０１６/j．b b a m e m．２００６．０１．００８[３１]A l v a r a d oM E,R u b i a n oC,Sán c h e zW,e t a l．C a l c i u mＧb i n d i n g p r o t e i n s t h a t a r e t y p e Bᵡr e g u l a t o r y s u b u n i t s o f p h o s p h a t a s e２A i n G i a r d i ai n t e s t i n a l i s[J]．P a r a s i t o lR e s,２０１８,１１７(１０):３２０５Ｇ３２１４．D O I:１０．１００７/s００４３６Ｇ０１８Ｇ６０１９Ｇz[３２]P r a s a dR,A t u l,S o n iA,e t a l．E x p r e s s i o n,c h a r a c t e r i z a t i o n, a n dc e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f k n o w p a i n s,p a p a i nＧl i k e c y s t e i n e p r oＧt e a s e s o f t h e P l a s m o d i u mk n o w l e s i m a l a r i a p a r a s i t e[J]．P L o S O n e,２０１２,７(１２):e５１６１９．D O I:１０．１３７１/j o u r n a l．p o n e．００５１６１９[３３]张佳凤,郝文波,肖斌,等．抗弓形虫水通道蛋白多肽抗体的制备及鉴定[J]．中国人兽共患病学报,２０１５,３１(１０):９０３Ｇ９０７．D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１００２Ｇ２６９４．２０１５．１０．００２[３４]钟亮尹,刘思敏,曾智华,等．弓形虫C D P K５基因多克隆抗血清的制备及功能鉴定[J]．重庆医学,２０１６,４５(１６):２１８２Ｇ２１８５．D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１６７１Ｇ８３４８．２０１６．１６．００８[３５]冯宪敏,张宏梅,李瑶,等．蓝氏贾第鞭毛虫P P D K多肽抗体制备与定位研究[J]．中国病原生物学杂志,２０１５,１０(２):１４４Ｇ１４７．D O I:１０．１３３５０/j．c j p b．１５０２１０[３６]肖斌,陈瑜,李林海,等．兔抗弓形虫C o r A家族M g２＋转运蛋白多肽抗体的制备及鉴定[J]．生物技术通讯,２０１６,２７(６):７７８Ｇ７８２．D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１００９Ｇ０００２．２０１６．０６．００６[３７]C a o i l i S E．B e n c h m a r k i n g BＧc e l l e p i t o p e p r e d i c t i o nw i t h q u a n t iＧt a t i v ed o s eＧr e s p o n s ed a t ao na n t i p e p t i d ea n t i b o d i e s:t o w a r d s n o v e l p h a r m a c e u t i c a l p r o d u c td e v e l o p m e n t[J]．B i o m e d R e s I n t,２０１４,２０１４:８６７９０５．D O I:１０．１１５５/２０１４/８６７９０５[３８]W a n g F,Y eB．B i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i sa n dc o n s t r u c t i o no f p h y l o g e n e t i c t r e e o fA q u a p o r i n s f r o m E c h i n o c o c c u s g r a n u l o s u s [J]．P a r a s i t o lR e s,２０１６,１１５(９):３４９９Ｇ３５１１．D O I:１０．１００７/ s００４３６Ｇ０１６Ｇ５１１４Ｇ２收稿日期:２０２０Ｇ０４Ｇ２４㊀编辑:张智芳９５１期傅芬蕊,等:产新德里金属βＧ内酰胺酶大肠埃希菌耐碳青霉烯类药物相关机制研究和分子分型。

·细菌学·大肠埃希菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制及分子分型张嵘　池丹　蔡加昌　胡燕燕　周宏伟　杨玮　吕火烊　陈功祥【摘要】　目的　研究大肠埃希菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制及分子分型。

方法　２００７—２０１１年从杭州市３家医院分离到２２株对碳青霉烯类抗生素不敏感的大肠埃希菌。

琼脂稀释法测定抗生素最低抑菌浓度（ＭＩＣ）；接合试验、ＰＣＲ扩增和序列分析等研究细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的分子机制。

脉冲场凝胶电泳（ＰＦＧＥ）、多位点序列分型（ＭＬＳＴ）和系统发育分型（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｙｐｉｎｇ）等对菌株进行分子分型。

结果　２２株大肠埃希菌亚胺培南和美罗培南的ＭＩＣ范围为１～１６μｇ／ｍｌ，厄他培南为２～６４μｇ／ｍｌ。

所有菌株产ＫＰＣ－２型碳青霉烯酶及各种β－内酰胺酶，部分菌株同时产质粒介导的ＡｍｐＣ酶。

２２株大肠埃希菌均可通过接合试验或转化试验将碳青霉烯耐药性传递给大肠埃希菌ＥＣ６００，使后者获得ｂｌａＫＰＣ－２基因及与供体菌相似的耐药性。

ＰＦＧＥ显示仅少数菌株为相同克隆或密切相关；ＭＬＳＴ显示最常见的序列类型为ＳＴ１３１（９株）和ＳＴ６４８（５株），ＳＴ３８和ＳＴ４０５各２株；系统发育分析显示９株ＳＴ１３１菌株均为Ｂ２群，另有１１株属于Ｄ群，Ｂ１群和Ａ群各１株。

结论　杭州地区产ＫＰＣ－２大肠埃希菌主要为世界范围流行的多重耐药菌株ＳＴ１３１，其次为ＳＴ６４８。

ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０２５４－５１０１．２０１４．０４．００２基金项目：浙江省自然科学基金（Ｙ１２Ｈ２０００１４）作者单位：３１０００９杭州，浙江大学医学院附属第二医院检验科（张嵘，蔡加昌，胡燕燕，周宏伟，陈功祥）；３２５０３５温州医科大学检验医学院、生命科学学院（池丹，陈功祥）；杭州市中医院检验科（杨玮）；浙江省人民医院检验科（吕火烊）通信作者：陈功祥，Ｅｍａｉｌ：ｂｒｉｇｉｔｔｅ＿ｚｘ＠１６３．ｃｏｍ，电话：０５７１－８７７８３６４６【关键词】　大肠埃希菌；碳青霉烯；分子分型；ＫＰＣ－２；ＳＴ１３１Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｔｙｐｅｓｏｆｃａｒｂａｐｅｎｅｍ－ｎｏｎ－ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｉｓｏｌａｔｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ＺｈａｎｇＲｏｎｇ倡，ＣｈｉＤａｎ，ＣａｉＪｉａｃｈａｎｇ，ＨｕＹａｎｙａｎ，ＺｈｏｕＨｏｎｇｗｅｉ，ＹａｎｇＷｅｉ，ＬｙｕＨｕｏｙａｎｇ，ＣｈｅｎＧｏｎｇｘｉａｎｇ．倡ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｔｈｅＳｅｃｏｎｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｃｉｎｅ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１０００９，ＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＣｈｅｎＧｏｎｇｘｉａｎｇ，Ｅｍａｉｌ：ｂｒｉｇｉｔｔｅ＿ｚｘ＠１６３．ｃｏｍ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｔｙｐｅｓｏｆｃａｒｂａｐｅｎｅｍ－ｎｏｎ－ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅＥｓｃｈｅ－ｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｉｓｏｌａｔｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｃａｒｂａｐｅｎｅｍｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｗｅｎｔｙ－ｔｗｏｃａｒｂａｐ－ｅｎｅｍ－ｎｏｎ－ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅＥ．ｃｏｌｉｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍ３ｈｏｓｐｉｔａｌｓｉｎＨａｎｇｚｈｏｕｆｒｏｍ２００７ｔｏ２０１１．Ｔｈｅｍｉｎｉ－ｍｕｍｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ（ＭＩＣｓ）ｏｆａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｔｏｔｈｏｓｅｉｓｏｌａｔｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙａｇａｒｄｉｌｕｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄａｎｄＥ－ｔｅｓｔ．ＴｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｃａｒｂａｐｅｎｅｍｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＥ．ｃｏｌｉｉｓｏｌａｔｅｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ＰＣＲａｎｄＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｐｕｌｓｅｄ－ｆｉｅｌｄｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＰＦＧＥ），ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓｓｅ－ｑｕｅｎｃｅｔｙｐｉｎｇ（ＭＬＳＴ），ａｎｄｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｙｐｉｎｇｗｅｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙｏｆｔｈｏｓｅｉｓｏｌａｔｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＴｈｅＭＩＣｓｏｆｉｍｉｐｅｎｅｍａｎｄｍｅｒｏｐｅｎｅｍｔｏ２２Ｅ．ｃｏｌｉｉｓｏｌａｔｅｓｗｅｒｅｒａｎｇｅｄｆｒｏｍ１μｇ／ｍｌｔｏ１６μｇ／ｍｌ，ａｎｄｔｈｅＭＩＣｓｏｆｅｒｔａｐｅｎｅｍｗｅｒｅ２μｇ／ｍｌｔｏ６４μｇ／ｍｌ．ＡｌｌＥ．ｃｏｌｉｉｓｏｌａｔｅｓｐｒｏｄｕｃｅｄｔｈｅＫＰＣ－２ｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｓｅａｎｄｖａｒｉｏｕｓβ－ｌａｃｔａｍａｓｅｓ，ａｎｄｓｏｍｅｏｆｔｈｅｍａｌｓｏｐｒｏｄｕｃｅｄｐｌａｓｍｉｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄＡｍｐＣｅｎｚｙｍｅｓ．Ｃａｒｂａｐｅｎｅｍｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｗａｓｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｂｙｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｆｒｏｍ２２Ｅ．ｃｏｌｉｉｓｏ－ｌａｔｅｓｔｏＥ．ｃｏｌｉＥＣ６００ｓｔｒａｉｎｓ．ＴｈｅＥ．ｃｏｌｉｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔｓｏｒｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓａｃｑｕｉｒｅｄｔｈｅｂｌａＫＰＣ－２ｇｅｎｅａｎｄｓｈｏｗｅｄｓｉｍｉｌａｒａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙｐａｔｔｅｒｎｓｉｎｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｗｉｔｈｄｏｎｏｒｓｔｒａｉｎｓ．Ｏｎｌｙａｆｅｗｉｓｏｌａｔｅｓｗｅｒｅｉｎ－ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈａｂｌｅｏｒｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄａｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｂｙＰＦＧＥ．ＦｏｕｒｓｅｑｕｅｎｃｅｔｙｐｅｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇＳＴ１３１（９ｉｓｏｌａｔｅｓ），ＳＴ６４８（５ｉｓｏｌａｔｅｓ），ＳＴ３８（２ｉｓｏｌａｔｅｓ）ａｎｄＳＴ４０５（２ｉｓｏｌａｔｅｓ）ｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙＭＬＳＴ．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙ－ｓｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔ９ＳＴ１３１ｉｓｏｌａｔｅｓｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｇｒｏｕｐＢ２ａｎｄｔｈｅｏｔｈｅｒｉｓｏｌａｔｅｓｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏｇｒｏｕｐＤ（１１ｉｓｏｌａｔｅｓ），ｇｒｏｕｐＢ１（１ｉｓｏｌａｔｅ）ａｎｄｇｒｏｕｐＡ（１ｉｓｏｌａｔｅ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＴｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｔｙｐｅｏｆｐｒｅｖａｌｅｎｔＥ．ｃｏｌｉｉｓｏｌａｔｅｓｐｒｏｄｕｃｉｎｇＫＰＣ－２ｆｒｏｍＨａｎｇｚｈｏｕｗａｓＳＴ１３１，ｗｈｉｃｈｉｓａｎｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｅｐｉ－ｄｅｍｉｃ，ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔｃｌｏｎｅ，ｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙＳＴ６４８．【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ；Ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｔｙｐｉｎｇ；ＫＰＣ－２；ＳＴ１３１ 由于抗生素在临床的广泛应用和不合理使用，细菌耐药问题日益严重且越来越受到关注。