ch17植物基因转化受体系统

主讲：胡银岗植物科学系农学院植物科学系西北农林科技大学农学院西北农林科技大学植物基因受体系统质粒介导基因转化直接导入的基因转化第四节花粉管通道法介导基因转化第五节病毒介导的基因转化第六节植物基因转化系统的选择第七节单子叶植物的基因转化依赖于良好的植物受体系统的建立。

用于转化的外植体（如发苗产生子叶、胚轴等）通过组织培养途径或其它非组织培养途径能高效、稳定地再生无性系接受外源DNA整合对转化选择抗生素敏感植物基因转化受体系统的条件（一）高效稳定的再生能力（二）较高的遗传稳定性（三）具有稳定的外植体来源（四）对选择性抗生素敏感（五）对农杆菌侵染有敏感性（一）高效稳定的再生能力从理论上讲，植物的任何体细胞都具有再生完整植（totipotency）但在组织培养的实践中，并不是所有的体细胞都能再生出完营养生长中心（分生组织）和薄壁细易再生出植株。

再生频率必须具有好的稳定性和重复性。

植物转化频率一般情况下只有0.1%。

基因转化操作，如农杆菌侵染，使用抗菌素筛选及继代培养，都会使转化外植体再生频率降低，有的甚至不能分化，或只能分化形成芽，而难以形成植株。

若只有10%再生率，则转化率10% ×0.1% = 0.01%后不影响其分裂和分化，并能稳定地将外源基因遗传给后代，保持遗传的稳定性，尽量减少变异。

不因导入优良性状的目的基因，使原有的目的性状（优良性状）在后代发生了变异。

注意组培过程（组培方法，再生途径及外植体基因型）引稳定的外植体来源，即外植体容易得到并且可以大量提供。

因基因转化的频率很低，需要多项反复地实验，所以就需要大量的外植体材料。

转化的外植体一般采用无菌实生苗的子叶、胚轴、幼叶等，或采用快速无需复杂的培养和繁殖操作过程，数量亦多；接种前的无菌处理简便易行；一些植物可由无菌幼苗形成愈伤组织和再生植株；无需保持无菌苗的无性系，只要有种子，随时可大量培养已适应组织培养条件，有利于外植体转化生长；可直接采用、无需消毒；材料来源量大而稳定。

名词解释：1.外植体：离体培养的器官、组织、细胞、细胞器称外植体。

2.细胞全能性：植物体的每一个细胞都携带有一套完整的基因组，并具有发育成为完整植株的潜在能力。

3.脱分化：将已分化的不分裂的静止细胞，放在培养基上培养后，细胞重新进入分裂状态。

一个成熟的细胞转变为分生状态的过程叫脱分化。

4.再分化:经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可有转变为各种不同细胞类型的能力。

5.继代培养：将初代培养得到的培养体移植于新鲜培养基中这种反复多次移植的培养，称为继代培养。

6.植物组织培养：是指用无菌方法使植物体的离体器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称，也称之为离体培养或试管培养。

7.MS培养基：它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。

特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。

其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。

它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。

有些培养基是由它演变而来的。

8.胚培养：植物在受精后，受精卵形成合子，随即进行第一次分裂，进而形成分生组织和幼胚，再发育成成熟胚。

在这个过程，胚靠消耗胚乳的营养而发育，同时胚处在胚囊环境中，可吸收氨基酸、维生素等营养。

9.花粉培养：花粉培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术。

由于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤组织或胚状体发育成的植株都是单倍体植株。

10. 细胞胚的发生：指在组织培养中，由一个非合子细胞(体细胞)，经过胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期），形成的具有双极性的胚状结构。

胚状体途径：非合子细胞通过与合子胚相似的胚胎发生过程形成的胚状结构，经过球型期、鱼雷期、心型期、子叶期发育过程的成熟胚状体可以萌发成为植株。

11.器官发生途径：外植体先脱分化形成愈伤组织，再由愈伤组织分化成不定芽，最后不定芽伸长、生根培养形成小植株（间接途径）或者外植体不经过愈伤组织直接形成不定芽，再经伸长、生根培养形成植株（直接途径）。

第六章 植物基因工程在自然界的许多双子叶植物中，常常发生一种严重危害植物生长的病害——冠瘿。

已知90多科，600多种双子叶植物都能感染这种病。

一般认为单子叶植物和裸子植物对此病不敏感。

70年代中期，世界上几个实验室发现诱发肿瘤的根癌农杆菌中含有大量的诱瘤质粒Ti(tumor-inducing plasmid),且证实了肿瘤的形成正是由于pTi 中的特定片段——T-DNA 转移并稳定地整合进植物细胞核基因组中的结果；由于其上载着的冠瘿碱合成基因和激素合成基因表达，因此分泌冠瘿碱并形成肿瘤。

人们就把这种冠瘿的形成过程称作天然的植物细胞转化系统。

农杆菌将自身的DNA 插入植物细胞诱发肿瘤只对其本身是有益的，重要原因之一是因课程基因工程原理与技术 班级 生物科学05 生物技术05 教师 詹亚光 范桂枝 学期第二学期 课时 6学时 上课日期 课的类型理论 授课章节 第六章 植物基因工程（1）植物基因转化受体系统的条件（2）植物基因转化受体系统的类型和特性。

（3）植物基因工程载体的种类和特性（4）根癌农杆菌Ti 质粒的结构与功能：T-DNA 、Vir 区操纵子的基因结构与功能。

（5）农杆菌Ti 质粒基因转化机理（6）农杆菌Ti 质粒的改造及载体构建（7）载体构建中常用的选择标记及报告基因（8）根癌农杆菌的转化程序及操作原理（9）外源基因在植物中的表达教学目的和要求 了解植物基因转化受体系统的类型、特性掌握Ti 质粒的结构与功能，植物载体构建原理，植物基因工程常用的载体类型。

教材分析 重点 根癌农杆菌Ti 质粒介导的基因转化的原理和方法难点 植物载体构建原理关键点 转基因植物的获取和检测主要教具和设备材料 投影仪、电脑、常规教学设备教法 板书与多媒体授课相结合思考题 1. 植物基因工程载体种类？2. 根癌农杆菌转化程序？心得为农杆菌诱发植物细胞合成冠瘿碱为自己提供食物。

植物自身不能利用这种物质，只能为它的合成付出代价，别的细菌也不能利用它，在自然条件下，只有农杆菌能分泌分解冠瘿碱的酶，将这些特异产物作为唯一的碳源和氮源来利用。

2．植物遗传转化的载体系统。

作为植物遗传转化的载体必须是能进入宿主细胞内进行复制和表达的核酸分子。

目前的载体系统有病毒的载体系统和质位的载体系统两大类。

（1）病毒载体系统：植物病毒作为植物遗传转化的载体系统是由植物病毒的侵染特性所决定的。

以病毒作载体的表达系统为瞬时表达系统，其一般不能把外源基因整合到植物细胞基因组中。

植物病毒的感染率很高，在较短时间内可获得较大的表达量。

但因以病毒为载体的表达系统每个宿主材料都要接种病毒载体，故瞬时表达系统不易起始。

作为病毒载体的病毒最好是双链DNA植物病毒。

目前已有十几种植物病毒被改造成不同类型的外源蛋白表达载体中；包括椰菜叶病毒（CaMV）、烟草花叶病毒（TMV）、豇豆花叶病毒（CPMV）和马铃薯X病毒（PVX）等。

其中在TMV载体中成功表达的外源病毒至少有150种以上。

（2）农杆菌质粒载体系统：质粒载体系统中最常用的质粒有：Ti质粒和Ri质粒。

Ti 质粒存在于根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中，Ri质粒存在于发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenis）中。

Ti质粒和Ri质粒在结构和功能上有许多相似之处，具有基本一致的特性。

但实际工作中，绝大部分采用Ti质粒。

农杆菌质粒是一种能实现DNA转移和整合的天然系统。

Ti质粒有两个区域：T-DNA区（是质粒上能够转移整合入植物受体基因组并能在植物细胞中表达从而导致冠瘿瘤的发生，且可通过减数分裂传递给子代的区域）和Vir区（编码能够实现T-DNA转移的蛋白）。

T-DNA长度为12-24kb之间，两端各有一个含25hp重复序列的边界序列，在整合过程中左右边界序列之间的T-DNA可以转移并整合到宿主细胞基因组中，研究发现只有边界序列对DNA的转移是必需的，而边界序列之间的T-DNA并不参与转化过程，因而可以用外源基因将其替换。

Vir区位于T-DNA以外的一个35kb内，其产物对T-DNA的转移及整合必不可少。