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转基因植物的筛选与鉴定随着植物转基因技术的不断进步，它对于分子遗传学研究和植物改良都具有特别重要的意义。
转基因植株的筛选在转基因技术中起着关键性的作用。
将含有35S启动子的基因载体PMDC150经农杆菌介导，利用农杆菌侵染拟南芥花序的方法转入拟南芥后得到T1代种子。
文章通过组织培养来筛选含有Kan抗性的转基因植株。
标签：拟南芥；转基因植物；筛选1 文献综述1.1 转基因植物的研究进展植物的遗传转化是指利用重组DNA，细胞组织培养等方法，将外源基因导入到植物的组织或细胞中，获得转基因植物的技术[1]。
从转基因植株成功之后，转基因技术飞速发展，如今，植物在抗病、抗虫和抗药等方面都有了转基因植株。
这种技术对改进农作物品质、提高产量等方面都有非常大的帮助。
1.2 基因转化技术随着人们对基因转化技术不断地深入研究和探索，现已发现多种基因转化的方法，例如农杆菌介导的基因转化、花粉管通道法等。
相比较其他植物基因的转化方法，农杆菌介导法有着减少成本、容易操作等优点，但对宿主细胞有着严格的要求。
每种方法都有其优缺点，所以根据植物的不同种类，我们要选择合理的转化方法，达到理想的转化效果。
1.3 本论文的目的和意义植物的转基因技术日新月异迅速发展，已经成为许多国家重点发展的新目标新领域，它所产生的巨大的社会和经济效益促使各个国家对其进行更加深入的研究，由其产生的巨大的生产潜能一定会推动社会的进步，改善人类现有的生产、生活质量以及健康水平。
本文以拟南芥为主要研究对象，通过转化后的农杆菌侵染拟南芥花序的方法及组织培养的方法进行了轉基因植物的筛选。
借由本次实验研究，可深入了解基因工程等相关领域的理论，可熟练掌握相关技术例如无菌操作技术、植物转基因技术、植物组织培养技术等等。
2 转基因植物的筛选与鉴定2.1 实验材料2.1.1 植物材料拟南芥2.1.2 载体与菌株重组表达载体PMDC150-35S（由实验室提供）、农杆菌菌株GV31012.1.3 主要试剂75%酒精、84消毒液、侵染缓冲液、限制性内切酶、卡那霉素、壮观霉素（重组表达载体含有的抗性）、利福平2.1.4 培养基LB培养基：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，15g/L琼脂（只固体培养基添加）1/2MS培养基2.2 实验方法2.2.1 拟南芥种植：将种子放在浸过水的滤纸上，放在4℃的冰箱中，不见光培养24小时，然后取出种子种在营养土里，在光照强度8000Lux，温度25℃的培养箱中经过光照16小时/黑暗8小时培养[2]。
植物的基因工程和转基因技术植物的基因工程和转基因技术是现代生物学领域中一项重要的研究内容。
通过利用基因工程和转基因技术，科学家们能够对植物进行遗传改良，从而实现提高作物产量、抗虫病和抗逆性能等目标。
本文将就植物基因工程的原理、应用和潜在的问题进行探讨，以便更好地理解这一领域的重要性和影响。
一、基因工程的原理基因工程是指通过分子生物学技术对生物体的基因进行改造的过程。
植物基因工程的核心是基因的克隆和转移。
首先，科学家们需要从源植物中提取目标基因，然后将其插入到目标植物的染色体中。
这一过程需要利用酶切与黏合技术来切割和粘合DNA分子，从而实现基因的克隆和转移。
二、转基因技术的应用转基因技术是基因工程的一种重要手段，通过这种技术，科学家们可以将外源基因导入到目标植物中，从而使其具备一些新的性状或特性。
转基因技术在农业和食品生产领域有着广泛的应用。
例如，利用转基因技术，科学家们可以培育出具有抗虫病、抗逆性以及更高产量的转基因作物。
此外，转基因技术还可以用于培育抗除草剂的作物，从而降低农药的使用量，并提高农作物的耐草剂能力。
三、转基因技术的优势和潜在问题转基因技术在农业和食品生产中具有许多优势。
首先，转基因作物可以显著提高农作物的产量，从而满足人们日益增长的粮食需求。
其次，经过基因改良的作物具有更好的抗虫、抗逆性能，能够减少农药的使用，对环境友好。
此外，转基因技术还可以提高农作物的营养价值，改善其口感和储存能力。
然而，转基因技术也存在一些潜在的问题和争议。
首先，转基因作物可能对生态系统造成潜在的风险，例如，转基因植物的杂交可能会导致与野生植物的杂种，从而对生态多样性产生负面影响。
其次，由于转基因技术的高昂成本，这些技术可能会加大农民的经济负担。
此外，一些人对转基因技术持有担忧，担心食用转基因作物可能对人类健康产生潜在的风险。
四、基因工程和转基因技术的发展前景尽管存在一些潜在问题，基因工程和转基因技术仍然具有广阔的发展前景。
生物技术园艺植物基因工程步骤
园艺植物基因工程是指通过生物技术手段对园艺植物的基因进行改变或调控，以获得所需的遗传特性。
其步骤主要包括以下几个方面：
1. 目标设定：确定要改变的遗传特性和目标基因，例如提高植物的产量、抗性、品质等。
2. 基因克隆：从目标植物中提取DNA，并使用分子生物学技术将目标基因扩增、纯化，以获得目标基因片段。
3. 基因构建：将目标基因片段插入植物基因工程载体（例如农杆菌载体），并利用适当的限制性内切酶将其与载体DNA连接起来，形成重组DNA。
4. 转化方式选择：选择适合的转化方法将重组DNA导入目标植物细胞，主要有农杆菌介导转化、生物弹射法或冷冻融合法等。
5. 遗传转化：将经过构建的重组DNA导入植物细胞，使目标基因插入植物染色体，形成转基因植物。
6. 试管繁殖：对转基因植物进行离体培养，通过细胞分裂和组织增殖等技术，大规模繁殖转基因植物。
7. 筛选和鉴定：利用分子生物学和生化分析等技术对转基因植物进行鉴定和筛选，确认目标基因的存在和表达情况。
8. 田间试验和推广：在试验田或实际种植场进行转基因植物的田间试验，评估其生长发育、产量、品质和抗性等性状，同时进行安全性评估和环境风险评估。
9. 商业化推广：通过权威部门的安全评估和监管审核，将合格的转基因植物品种进行商业化推广，使其广泛应用于园艺产业。
需要注意的是，园艺植物基因工程步骤可能会因具体目标和植物而有所差异，以上步骤仅供参考。
植物基因工程实验教案：遗传转化技术的应用和优化植物基因工程是一种将目标基因移入植物细胞内的方法，以实现改良作物品种的过程。
这一技术可以应用于许多方面，如增强作物产量、提高作物品质、促进作物抗病抗虫能力等。
植物基因工程是一个极具潜力的领域。
本文将介绍植物基因工程实验教案中的遗传转化技术的应用和优化。
一、遗传转化技术遗传转化技术是一种将外源基因转移入植物细胞中的方法，该方法包括四个主要步骤：选择载体、制备载体、转化载体和鉴定基因。
选择载体：目前用于植物基因工程的两种载体是农杆菌和冷冻冻融法。
农杆菌转化法是最常用的方法之一，农杆菌以同源重组的方式在植物细胞中形成感染斑。
农杆菌将外源基因植入植物细胞中，目标基因将被插入植物细胞的染色体中。
制备载体：载体是一种可以将外源基因植入植物细胞内的DNA分子。
在制备载体的过程中，需要用到回收携带目标基因的载体。
常用的载体包括质粒和病毒，质粒是一种带有目标基因的圆形DNA分子，可以将目标基因直接植入质粒中。
转化载体：转化载体是指将目标基因输送至植物细胞内的过程。
转化方法主要有两种：物理转化和生物转化。
物理转化是指通过高斯粒子加速器等物理手段将目标基因输送至植物细胞内；生物转化是指使用农杆菌或病毒将外源基因输送至植物细胞内。
鉴定基因：鉴定基因是指确定转化后的植物细胞中是否成功植入了外源基因。
通常使用PCR和Southern杂交等方法对植物细胞进行鉴定。
二、遗传转化技术的应用1. 增强作物产量：遗传转化技术可以实现植物细胞的营养分配和代谢的调节，从而提高作物的生长速度和生产力；2. 提高作物品质：通过遗传转化技术，可以改善作物的色、香、味等特征；3. 促进作物抗病抗虫能力：外源基因的应用可以帮助作物提高其对病菌、虫害等的抵抗力；4. 创建新的生物技术：可以通过遗传转化技术创建新的生物技术，例如转基因药物、疫苗等。
三、遗传转化技术的优化虽然遗传转化技术在基因工程领域中应用较为广泛，但是该技术仍存在一些问题。
转基因植物的检测与鉴定宫雪超于丽杰高金秋哈尔滨师范大学环境与生命科学院黑龙江哈尔滨摘要对植物转基因过程中报告基因的种类和应用范围转基因植物的检测和鉴定方法转基因植物检测和鉴定方法的评价进行了综述关键词转基因植物检测鉴定评价中图分类法文献标识码文章编号植物转基因实验因受体系统的限制外源基因的转化频率较低为了达到转化目的必然要获得大量的转化材料如何在数以千万计的转化植株或细胞中快速有效地检测出转基因阳性植株或细胞外源基因是否整合到植物染色体上整合的方式如何整合到染色体上的外源基因是否正确表达等问题就成为重要的研究课题根据外源基因表达的不同水平对外源基因的检测和鉴定可以分为三个水平进行整合水平转录水平和翻译水平本文从外源基因表达的不同水平阐述转基因植物的检测与鉴定外源基因整合水平的鉴定检测外源基因是否转化成功首先是对报告基因进行检测必要时再进行目的基因的检测检测目的基因需要采用分子杂交方法报告基因报告基因必须具有两大特点一是表达产物和产物的类似功能在未转化的植物细胞内并不存在二是便于检测目前植物基因工程中使用的报告基因一般是编码酶的基因大致分为两类抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因现在常用的报告基因主要有基因基因冠瘿碱合成酶基因H基因基因基因荧光素酶基因二氢叶酸还原酶基因等近年来绿色荧光蛋白基因作为一种新型的报告基因在植物基因转化及基因表达调控中得到应用并显示出较其他几个报告基因更大的优越性基因的检测基因具有以下优点①适用于各种生物的基因转化②检测方法简便无需底物酶辅因子等物质只要有紫外光或蓝光照射其表达产物就可以发出绿色荧光这对转化细胞的检测极为有利③便于活体检测十分有利于活体内基因表达调控的研究④检测时可获得直观信息有利于转基因植物安全性问题的研究及防范若此报告基因通过自然杂交扩散到其他栽培植物或杂草中时很容易通过光照获得直观信息基因的检测基因也是广泛用作转基因植物细菌和真菌的报告基因尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化试验中基因应用的最多基因端与其他结构形成的融合基因能正常表达所产生的融合蛋白仍具有活性这为研究外源基因表达的具体细胞部位及组织部位提供了条件这是它的一大优点但是需要注意的是有一些植物在胚胎状态时能产生内源活性在转基因和代的子叶花粉和胚珠中检测到活性随着组织的成熟衰老表达逐渐停止在实验过程中要设定严格的阴性对照活性的检测方法有很多包括组织化学法色谱法荧光法等其中植物切片组织化学定位分析是分辨组织中不同细胞个体和不同的细胞类型基因表达差异的一种有效方法转基因植株的检测聚合酶链式反应是首选的转基因产品检测方法技术能够有效地扩增低拷贝的靶片段可以检测到每克样品含有～的转化基因成分对转基因产品大分子量检测的灵敏度可以达到样品含量的因为的高度特异性及检测所需的模板量仅为以内所以为外源基因整合的检测提供了便利条件尤其是在转化材料少又需及早检测的时候现在已经利用该技术对欧美杨番茄辣椒葡萄豆瓣菜小麦等转基因植物进行鉴定是转基因植物鉴定中最简单最常用的方法检测具有用量少操作简单成本低耗时少不需要同位素等优点但检测也存在缺点由于扩增十分灵敏有时会出现假阳性扩增因此检测只能作为初步结果杂交证明外源基因在植物染色体上整合情况的最可靠方法是杂交只有经过分子杂交鉴定为阳性的植株才可以称为转基因植物年第期牡丹江师范学院学报自然科学版总第期收稿日期利用杂交~可以确定外源基因在植物中的组织结构和整合位置~拷贝数以及转基因植株世代外源基因的稳定性]分子杂交是进行核酸序列分析~重组子鉴定及检测外源基因整合表达的强有力手段~它具有灵敏性高~特异性强的特点~是当前鉴定外源基因整合及表达的权威方法杂交可以清除操作过程中的污染以及转化愈伤组织中质粒残留所引起的假阳性信号~准确度高~但杂交程序复杂~成本高~且对实验技术条件要求较高根据杂交时所用的方法~核酸分子杂交又可分为印迹杂交<>~斑点<>杂交或狭缝<>杂交和细胞原位<>杂交等现在已在水稻]~玉米~大白菜]~豆瓣菜]~马铃薯~杏~烟草等植物中得到广泛应用外源基因转录水平的鉴定转录水平上的检测方法主要就是杂交~它以和探针杂交的技术检测基因在转录水平上的表达杂交杂交和杂交相比~更接近性状表现~更具有现实意义~被广泛用于转基因植物的检测~]~现已用于杨树~豆瓣菜~马铃薯~草莓~烟草等转基因植物的检测中但提取条件严格~在材料内含量不如高~不适于大批量样品的检测检测<>也是检测外源在植物体内转录表达的一种方法如果从细胞总提取物中得到特异的扩增条带~则表明外源基因实现了转录此法简单~快速~但对外源基因转录的最后决定~还需与杂交的实验结果结合外源基因表达蛋白的检测外源基因编码的蛋白在转基因植物中能够正常表达并表现出应有的功能是植物基因工程的最终目的杂交杂交是集蛋白质电泳~印迹和免疫测定为一体的检测方法它具有很高的灵敏性~可以从植物细胞总蛋白中检出的特异蛋白质~若是提纯的蛋白质~可检出～杂交检测目的基因在翻译水平的表达结果~可得知被检植物细胞内目的蛋白是否表达~表达的浓度大小及大致的分子量能直接显示目的基因在转化体中是否经过转录~翻译最终合成蛋白而影响植株的性状表现一般来讲~杂交的结果与性状表现有直接关系~]检测<酶联免疫吸附法>是一种利用免疫学原理检测抗原~抗体的技术由于酶的放大作用~使测定的灵敏度极高~可检测出的目的物~同时酶反应还具有很强的特异性除了可溶性抗原<抗体>之外~还可以检测含表面抗原的细胞该方法已用于辣椒~水稻~烟草~番茄~]等转化植株的鉴定工作中的检测虽然很灵敏~但容易出现本底过高的问题~应予以充分的注意蛋白检测试纸蛋白检测试纸是一种基于的改进方法或者~用于转基因植物表达量的检测]先将特异性抗体吸附在膜上~将膜蘸入样品溶液~蛋白质随着液相扩散~遇到抗体~发生抗原抗体反应~通过阴性对照筛选阳性结果~给出转基因成分含量的大致范围此方法操作简单~费用低~耗时少<～>原位杂交检测原位杂交技术目前在植物基因工程研究中已成为外源基因在染色体上整合定位及在组织细胞内表达定位的主要方法原位杂交技术主要有同位素原位杂交和荧光原位杂交<>~使用放射性同位素标记~放射自显影检出该方法灵敏性强~对于单拷贝的序列检出非常有效原位杂交可以分为三个层次:①染色体原位杂交~可以确定外源基因在染色体上的整合位置及整合方式~还可以研究外源基因的整合方式对外源基因遗传稳定性~外源基因表达的影响~以及不同的转化方式与外源基因整合方式的关系等重大机理问题;②组织细胞原位杂交~对特定的基因表达的进行组织细胞分布的空间定位~获得外源基因在植物组织细胞内表达情况<是否表达~表达位置~表达量等>;③外源基因表达蛋白的组织细胞免疫定位~指利用外源基因表达蛋白的抗体~通过免疫反应确定表达蛋白在转基因植物组织及细胞中的分布该方法也是研究转基因植物中外源基因功能~外源蛋白稳定性及功能蛋白含量的重要手段检测方法的评估用提取方法对目的基因进行检测方法简便~适合大批量样品的分析~又能检测目的基因的完整性~是早期检测的较好方法]~~杂交分别从整合~转录~翻译水平检测外源基因~是检测外源基因最经典~最可靠的方法虽然现在出现了一些像~等功能类似~方便快捷的检测技术~然而由于其技术本身的原因~还不能取代以上技术在转基因植物检测和鉴年第期牡丹江师范学院学报!自然科学版"# !总第期"定上的权威地位随着科学技术的发展 各种新的检测方法也在不断涌现 例如生物传感器筛选法 远红外线光谱法 定量 实时基因芯片等 每种检测方法都有其自身的优点和不足 应该根据不同的检测目的和要求 选择合适的方法 在实际工作中把几种方法结合运用 可获得外源基因不同表达水平的信息 是准确检测转基因植物产品的合理策略参考文献王学聘 卞祖娴 张晋华 等 欧美杨转基因植物的 检测 林业科学 朱新产 导入外源 对小麦基因表达的影响 西北植物学报 刘建强 孙仲序 赵春芝 转基因植物鉴定方法的研究概况 山东林业科技 李乃坚 袁四清 卡那霉素胁迫对转基因烟草种子发芽的影响 广东农业学报毛慧珠 唐惕 曹湘玲 等 抗虫转基因甘蓝及其后代的研究 中国科学 辑编辑 琳莉收稿日期 基金项目 黑龙江发展高新技术产业专项资金无基质喷雾栽培法生产脱毒小薯的研究于洪涛黑龙江省农业科学院绥化研究所 黑龙江绥化摘要 研究了无基质喷雾栽培法生产马铃薯脱毒小薯过程中不同品种 不同苗来源及不同收获方式对块茎产量的影响 结果表明 无基质喷雾栽培法生产马铃薯小薯以扦插苗分期收获效果最佳 无基质喷雾栽培比较适合栽培早熟品种以早大白最佳 关键词 无基质 马铃薯 脱毒小薯 中图分类法 文献标识码 文章编号在马铃薯良种繁育体系中 原种的生产是关键环节 其质量的高低和数量的多少直接影响马铃薯的生产 无基质喷雾栽培法是一种极有前途的核心种薯生产方法 其主要技术是将适于马铃薯不同发育时期的营养液适时适量地喷于保持在黑暗状态下的马铃薯植株根际 使马铃薯根际获得充分的养分 促进马铃薯块茎的生长 马铃薯喷雾栽培技术在我国尚属起步阶段 提高其生产效率是生产实践中亟待解决的问题 为此 本试验对无基质喷雾栽培法生产马铃薯脱毒小薯过程中不年第 期牡丹江师范学院学报 自然科学版总第 期转基因植物的检测与鉴定作者：宫雪超， 于丽杰， 高金秋， GONG Xuechao， YU Lijie， GAO Jinqiu作者单位：哈尔滨师范大学环境与生命科学院,黑龙江,哈尔滨,150025刊名：牡丹江师范学院学报（自然科学版）英文刊名：JOURNAL OF MUDANJING TEACHERS' COLLEGE(NATURAL SCIENCES EDITION)年，卷(期)：2007(1)被引用次数：3次1.Datta S K;A Petew 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植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定〖实验目的〗1．了解创建烟草突变体库的方法；2．理解每种方法的基本原理；3．掌握农杆菌介导的转基因方法以及转基因产物筛选和鉴定的基本过程。
〖实验原理〗随着越来越多植物的全基因组测序工作的完成，在此基础上开展功能基因组的研究是目前的核心研究内容之一。
植物插入突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容，在此基础上也能进行正向遗传学及反向遗传学的研究。
在创制突变体的策略上，传统方法是使用物理或化学诱变方法获得，其优点是可在尽可能短的时间内获得饱和突变体。
与传统的物理和化学诱变方法相比，生物诱变(T-DNA和转座子插人诱变)通常可标记突变基因，从而较为容易地分离鉴定靶基因。
最近数年，通过农杆菌介导的T-DNA插入突变已成为国际公认的植物功能基因组学的主要研究方法之一。
烟草是植物基因组研究的一种模式植物，其突变体库的创建是烟草功能基因组学研究中的重要内容，其目的是通过大规模的突变体库平台快速全方位的了解基因组中各个基因的功能。
突变体的创制是遗传学研究的基础，也是分离基因和基因功能鉴定的最要途径。
通过诱导培养，使烟草产生愈伤组织，利用土壤农杆菌感染愈伤组织，实现T-DNA标签在烟草愈伤组织基因组中大量随机插人，利用植物细胞的全能性，经过抗性筛选，诱导分化，从抗性愈伤组织获得烟草突变体再生植株，获得各突变体的纯合材料，从而建立烟草突变体的数据库，然后分析突变性状与T-DNA的共分离关系，存在共分离的材料用适当的Tail-PCR克隆技术获得T-DNA的侧翼基因组序列，用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析（图实验4-1）。
T-DNA 载体构建转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子筛选T2，获突变子，应为3:1分离确定T-DNA与突变型共分离的个体产生纯合后代克隆T-DNA两侧的植物DNA（Tail PCR)利用侧翼DNA序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因基因功能的验证（遗传互补测验，分离的野生基因转化突变体，回复功能）图实验4-1 T-DNA标签克隆基因的基本流程TAIL-PCR分离法是利用多个嵌套的T-DNA插入序列特异性引物（根据T-DNA中靠近右边界处的核苷酸序列设计的引物，Tm值57-62℃和一个短的随机简并引物（AD，Tm值44-46℃）组合，以突变体基因组DNA为模板，进行多次PCR反应，采取高温特异性扩增与低温随机扩增相间进行的方法，最后获得T-DNA插入侧翼区特异性扩增片段（实验图4-2），可作为探针，筛选分离基因。
TAIL-PCR分离法可以降低非侧翼区特异产物的背景，同时它可以产生2个以上嵌套的目的片段，与其它方法相比TAIL-PCR 方法具有简便、特异、高效、快速和灵敏等特点，已经在拟南芥和水稻等植物中获得了成功及广泛的应用。
实验图4-2 TAIL-PCR反应流程图本实验用含T-DNA载体质粒pCAMBIA1301的LBA4404农杆菌菌株转染烟草愈伤组织，让T-DNA随机插入烟草的基因组中形成T-DNA突变体，通过PCR特异扩增HPT基因片段来鉴定转基因烟草，以TAIL-PCR法获得转基因烟草突变体的侧翼基因片段，测序后将获得侧翼基因片段的序列与GeneBank中的已知序列对比，获得功能基因的全序列。
〖仪器、材料和试剂〗（一）仪器高速冷冻离心机，PCR仪，超净工作台，恒温摇床，隔水式恒温培养箱，光照培养箱，紫外可见分光光度计，凝胶成象仪或Dark Reader，恒温水浴锅，微孔加热器，电泳仪，水平板电泳槽，天平，酸度计，旋涡混合器。
（二）材料烟草幼苗，含T-DNA载体质粒pMD83rc的LBA4404农杆菌菌株，Ex-taq DNA 聚合酶，DNA 1kb laddeer，GoldView核酸染料。
（三）试剂1. 2×CTAB提取液100mmol/L Tris-HCl pH8.02％（w/v）CTAB1.4mol/L NaCl40mmol/L b-巯基乙醇20mmol/L EDTA2. TE缓冲液10mmol/L Tris-HCl pH8.01mmol/L EDTA3. 50´TAE电极缓冲液1000mlTris 54g硼酸27.5g0.5mol/L EDTA 20ml4. 10％次氯酸钠5. 氯仿：异戊醇(V:V，24：1)6. 70％乙醇7. 溶液I：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris.HCl（pH8.0），10 mmol/L EDTA（pH8.0）100ml8. 溶液III：60ml 5mol/L乙酸钾，11.5ml 11.5％冰乙酸，28.5ml无菌水100ml9. 溶液II：分别配制0.4 mol/L NaOH和2％SDS溶液（各30ml），用时1:1混合10. LB液体培养基配制每升培养基，应在950mL去离子水中加入：胰蛋白胨(bacto-typtone) 10g酵母提取物(bacto-yeast extract) 5gNaCl 10g摇动容器直至溶质完全溶解，加入200uL 5mol/L NaOH调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1升，121℃高压灭菌20分钟。
11. MS基本培养基大量元素mg/L 微量元素mg/L 有机营养mg/LNH4NO31650 KI 0.83 甘氨酸 2.0KNO31900 H3BO3 6.2 烟酸0.5 CaCl2·2H2O 440 MnSO4·4H2O 22.3 盐酸吡哆醇（Vb6）0.5 MgSO4·7H2O 370 ZnSO4·7H2O 8.6 盐酸硫胺素（Vb1）0.lKH2PO4170 NaMoO4·2H2O 0.25 肌醇100CoCl2·6H2O 0.025CuSO4·5H2O 0.025FeSO4·7H2O 27.8配制方法母液：大量元素（50×）400mL硝酸铵33g；硝酸钾38g；磷酸二氢钾3.4g；七水合硫酸镁7.4g；铁元素（100×）200mL七水合硫酸亚铁0.556g；七水合EDTA二钠0.746g；有机营养（100×）200mLGly 0.040g；VB1 0.002g；VB6 0.010g；肌醇2g；烟酸0.010g；微量元素（1000×）200mL碘化钾166mg；硼酸1240mg；一水合硫酸锰3380mg；七水合硫酸锌1720mg；二水合钼酸钠44mg；五水合硫酸铜5mg；六水合氯化钴5mg；氯化钙（50×）400mL 氯化钙8.8g12. 愈伤组织诱导与分化培养基：MS基本培养基＋0.2mg/L 6-BA＋0.02mg/L NAA＋3%蔗糖＋0.6%琼脂其中6-BA 取25mg用少量1M NaOH溶解后定容到50mL；NAA取25mg用少量1M NaOH溶解后定容到50mL；2,4-D取50mg用少量1M NaOH溶解后定容到100mL；以上激素母液均为0.5mg/mL13. 筛选培养基：MS基本培养基＋0.2mg/L 6-BA ＋0.02mg/L NAA＋3%蔗糖＋0.6%琼脂＋100mg/L羧苄青霉素14. 抗生素母液的配制KANA（50mg/mL）1g KANA溶于20mL蒸馏水；RIF（50mg/mL）0.25g RIF溶于少量乙醇再定容至50mL；STR（30mg/mL）0.6g STA溶于20mL蒸馏水；羧苄青霉素（100mg/mL）2g羧苄青霉素溶于20mL蒸馏水。
潮霉素B（50mg/mL）可以直接购买〖实验步骤〗I 烟草外植体的无菌培养和诱导再生1. 烟草叶片预培养：取烟草完全展开的幼叶，用自来水洗净晾干。
在超净工作台中将叶片浸于70％酒精中30秒，然后移入10％的次氯酸钠溶液中5～10分钟（消除外植体表面的微生物）。
无菌水至少洗涤3次（消毒液对外植体有很大伤害，必须清洗干净），每次停留3～5min。
将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm大小块或用6mm打孔器凿成圆盘。
2. 烟草叶片的诱导再生：自行设计MS培养基中的NAA、6-BA植物激素浓度，诱导烟草叶片生根或生芽；将上述处理过的无菌叶片接种在含有不同浓度植物激素的MS固体培养基中，每周定期观察并更换培养基。
II 转基因烟草的培养1. 农杆菌的培养：将含T-DNA载体的农杆菌单菌落接种到20ml LB液体培养基中（Kana50ug/ml、RIF、STR），27℃，180r／min振摇培养过夜。
将2ml菌液转入20ml LB液体培养基中，与上述的相同条件培养6小时左右，使菌液达到OD600＝0.2～0.5，用来侵染烟草叶片。
2. 烟草叶片预培养：取烟草完全展开的幼叶，用自来水洗净晾干。
在超净工作台中将叶片浸于70％酒精中30秒，然后移入10％的次氯酸钠溶液中5～10分钟（消除外植体表面的微生物）。
无菌水至少洗涤3次（消毒液对外植体有很大伤害，必须清洗干净），每次停留3～5min。
将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm大小块或用6mm打孔器凿成圆盘。
3. 愈伤组织转化：在80r/min摇床上旋转浸染5～10分钟。
将叶外植体置于无菌滤纸上吸去多余的菌液（如果叶片粘附细菌过多，可以在无菌水中漂洗1～2次）。
4. 共培养：将侵染过菌液的叶片接种在MS愈伤组织诱导和分化培养基上，在26℃黑暗条件下共培养3天。
5. 筛选培养与分化：将共培养处理的烟草叶片转移到凝固后的筛选培养基上（100ug/L羧苄青霉素和50ug/L潮霉素B，羧苄青霉素起到抑制农杆菌生长的作用。
如果农杆菌生长未被抑制，农杆菌将抑制叶外植体的生长）。
每隔3～4天继代一次，培养条件为，光照2000lx，温度26℃，日照16h。
4周后转基因细胞分裂生长形成大量愈伤组织并有根、芽分化。
接种烟草叶片于无激素的MS培养基上培养，培养条件同上，同时作为对照实验（无愈伤组织生长和器官分化）。
Ⅲ转基因烟草的检测1. 剪取培养后的转化烟草和前期实验未转基因烟草叶片小片，液氮中研磨至粉末状，加入0.5mL65℃预热CATB抽提液65℃水浴抽提30min，间歇混匀；2. 取上清各加入0.5mL氯仿异戊醇（体积比24:1）去除蛋白，12000rpm离心10min；3. 取上清加入1体积预冷异丙醇至-20℃出沉淀30～60min，8000rpm离心15min；4. 弃上清，70%乙醇洗涤2次干燥，避光保存；5. 加入15μL蒸馏水溶解并电泳检测（0.7%琼脂糖凝胶电泳）；6. 提取pMDC83rc质粒：（1）3-5ml过夜菌12000rpm离心1min，弃上清；（2）加300μL预冷溶液I，颠倒混匀6-8次；（3）加300μl新鲜不预冷溶液II，颠倒混匀6-8次；（4）加300μl预冷溶液III，颠倒混匀6-8次；（5）12000 rpm 15min，转移上清液；（6）加入0.5倍体积的异丙醇，混匀，室温放置3min，如上离心12min；（7）弃上清，70%乙醇洗沉淀；（8）空气干燥，20ml 蒸馏水溶解，-20℃贮存。
