实验一附录_植物转基因载体的介绍

植物遗传转化步骤植物遗传转化是指通过外源DNA的导入，使植物细胞或组织发生基因改变，从而获得具有特定性状的转基因植物。

这一技术在农业、医学和工业等领域有着广泛的应用。

下面将介绍植物遗传转化的基本步骤。

步骤一：选择外源DNA在植物遗传转化中，首先需要选择外源DNA，也就是我们要导入到植物细胞中的目标基因。

这个目标基因可以来自于其他物种，也可以是人工合成的。

目标基因的选择取决于我们希望在转基因植物中表达的特定性状。

步骤二：构建转化载体将目标基因导入植物细胞需要使用载体。

载体是一种专门设计用于植物遗传转化的DNA分子。

通常，载体由多个组成部分组成，包括启动子、终止子、选择标记和目标基因。

这些组成部分的功能是确保目标基因能够在植物细胞中正确表达。

步骤三：转化载体导入植物细胞一旦构建好转化载体，接下来就需要将其导入到植物细胞中。

目前，有多种方法可以实现这一步骤，包括农杆菌介导转化、基因枪法和电穿孔法等。

这些方法都可以有效地将外源DNA导入植物细胞，使其成为转基因细胞。

步骤四：筛选转基因细胞一旦植物细胞被导入外源DNA，我们需要对其进行筛选，以确定哪些细胞成功地获得了目标基因。

为了实现这一步骤，常常会在转化载体中加入选择标记基因，如抗生素抗性基因。

只有携带了目标基因的细胞才能存活下来，而其他细胞则会被筛选掉。

步骤五：培养和再生转基因植物筛选出的转基因细胞可以通过培养和再生来获得完整的转基因植物。

这一过程通常需要在培养基上进行，通过提供适当的营养物质和激素来促进细胞分裂和分化。

经过一段时间的培养，转基因细胞可以发展成为转基因植物。

步骤六：鉴定转基因植物需要对获得的转基因植物进行鉴定，以确认其是否成功地获得了目标基因。

这一步骤通常需要使用分子生物学技术，如PCR和Southern blot等，来检测目标基因的存在和表达。

只有经过鉴定的转基因植物才能用于进一步的研究或应用。

总结：植物遗传转化是一项复杂的技术，需要经历多个步骤才能成功。

转基因检测试剂盒(植物)介绍在今年年初，农业农村部制定了《2020年农业转基因生物监管工作方案》，该方案的主要就是为了切实做好农业转基因生物安全监管工作，保障我国农业转基因生物研究与应用的健康发展。

一直以来，转基因作物及其产品的检测技术是转基因生物安全管理的基础和技术保障，随着转基因技术研究和应用的不断扩大，国际贸易日益频繁，引种交流力度加大，每年都涌现出大量新的转化体和新的加工品，因此，只有通过准确检测和科学溯源，才能确保标识制度的实行，才能实现对转基因作物及其产品的有效监督和有力监管。

那么，对于不可见的转基因物质我们该如何快速有效地检测呢？可以使用转基因检测试剂盒。

Cry1C 转基因检测试剂盒也叫转基因植物蛋白浓度测定试剂盒，可用于转基因作物叶片蛋白浓度测定，转基因Cry1C 试剂盒系用特异性抗Cry1C 单抗包被的微孔板和酶标记抗Cry1C 单抗，双抗体夹心法检测Cry1C 基因表达产物，可以高灵敏度和特异性的检测转基因植物中的Bt-Cry1C 蛋白。

【Cry1C转基因检测试剂盒原理】转基因Cry1C 试剂盒系用特异性抗Cry1C 单抗包被的微孔板和酶标记抗Cry1C 单抗，双抗体夹心法检测Cry1C 基因表达产物，可以高灵敏度和特异性的检测转基因植物中的Bt-Cry1C 蛋白。

【Cry1C转基因检测试剂盒试剂准备】试剂盒中的20×浓缩洗涤液30 ml 加570 ml 灭菌ddH2O 溶解稀释至1×洗涤液，5×抽提液（30 ml）加120 ml ddH2O 稀释至1×抽提液，4℃存放备用。

【样品准备】称取约20 mg 叶片，加0.5 ml 1×抽提液（使用前30 min 放置室温）研磨至匀浆，室温放置30 min，测定前把样品上清液稀释5-20 倍。

测定茎干和胚乳中的Bt 蛋白时，样品称取约40 mg，加1 ml 1×抽提液研磨。

植物转基因原理与技术植物转基因原理与技术转基因是指通过基因工程技术将外源基因导入到受体细胞中的过程。

微生物和动物细胞转基因开展较早，技术也比较成熟，相对动物和微生物转基因来说，植物转基因开展较晚。

自1984年获得第一株转基因烟草以来，近二十年的时间里在数百种植物中获得成功。

下面就植物转基因的原理和常见技术做一简单介绍。

原理根据植物细胞能再生成植株的全能性，利用生物媒介或其他物理化学的方法和技术将外源基因导入受体细胞并且整合到基因组中，通过组织培养获得完整植株。

在培养过程中为了筛选阳性转基因植物往往采用植物敏感的抗生素进行筛选，最后经过分子生物学和生理方面的检测来鉴定抗性生根的植株是否是真正的转基因植物。

以技术为媒介，一个植物转基因系统必然涉及到外源基因和受体细胞。

外源基因可以是克隆到质粒等载体中的或是未经克隆的裸露基因。

受体细胞根据转基因技术和植物的类型的不同，可以选择外植体，愈伤组织，原生质体等。

一个好的转基因受体细胞应该是具有高效稳定的再生能力，并且能接受外源基因的整合，并对选择抗生素敏感的无性繁殖系。

植物转基因流程图如下所示。

外植体）愈伤组织瞬时表达外源基因植物受体细胞原生质体生殖细胞稳定表达获得抗性生根转基因苗转基因植物的检测和鉴定（PCR, Southern blot ,Northern blot,生理指标鉴定等）技术就植物转基因技术而言可以根据转化系统的原理分为三大系统：载体转化技术，直接转化技术和种质转化技术。

下面分别叙述。

一载体转化技术载体转化技术是指通过农杆菌的Ti 或Ri质粒，植物病毒的DNA或RNA等生物载体介导基因进入并整合到植物基因组上的方法。

其中土壤农杆菌转化系统是目前研究最为清楚而且转化最成功的方法。

病毒载体转化系统的研究也取得一些成就。

土壤农杆菌是一类浸染受伤植物并且形成冠瘿瘤的革兰氏阴性菌。

它的致瘤能力来源于存在于细胞内的Ti（tumour-induced）质粒。

第1篇一、实验目的1. 掌握拟南芥转基因技术的基本原理和方法。

2. 熟悉转基因操作流程，包括目的基因的克隆、转化、筛选和鉴定等步骤。

3. 了解转基因技术在植物基因功能研究中的应用。

二、实验原理拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种广泛应用的植物模式生物，具有生长周期短、繁殖速度快、基因组序列已完全解析等特点，使其成为研究植物生长发育、基因调控和生物技术的理想材料。

转基因技术是将外源基因导入植物基因组中，使其在植物细胞中表达，从而改变植物性状或赋予其新的功能。

本实验采用农杆菌介导的转基因方法，将目的基因导入拟南芥基因组中。

实验流程包括以下步骤：1. 目的基因的克隆：从基因库或基因组DNA中提取目的基因，通过PCR技术扩增目的基因片段。

2. 载体构建：将目的基因克隆到载体上，如T载体或pBI121载体。

3. 农杆菌转化：将重组载体与农杆菌共培养，使农杆菌感染拟南芥细胞。

4. 植物再生：将感染了重组载体的拟南芥叶片接种到含有抗生素的培养基上，筛选出含有目的基因的转基因植株。

5. 鉴定：通过PCR、Southern blotting等方法对转基因植株进行鉴定。

三、实验材料1. 拟南芥野生型植株（Col-0）2. 农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株E. coli JM1093. 目的基因片段4. T载体或pBI121载体5. PCR试剂、限制性内切酶、DNA连接酶等6. 培养基、抗生素、琼脂糖等四、实验步骤1. 目的基因的克隆：根据目的基因的序列设计引物，进行PCR扩增。

将扩增产物与T载体连接，转化E. coli JM109感受态细胞，筛选阳性克隆。

2. 载体构建：将目的基因克隆到pBI121载体上，进行酶切和连接反应。

将连接产物转化E. coli JM109感受态细胞，筛选阳性克隆。

3. 农杆菌转化：将重组载体与农杆菌共培养，使农杆菌感染拟南芥叶片。

将感染后的叶片接种到含有抗生素的培养基上，筛选出含有目的基因的转基因植株。

第1篇一、实验目的本实验旨在通过分子生物学技术检测转基因烟草植株中目标基因的整合和表达情况，验证转基因植株的遗传稳定性，为后续的转基因烟草的研究和应用提供科学依据。

二、实验材料1. 转基因烟草植株：含有目标基因的烟草再生植株。

2. 实验试剂：DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、DNA分子量标准、限制性内切酶、连接酶、T载体、感受态细胞、质粒提取试剂盒等。

3. 实验仪器：PCR仪、凝胶成像系统、离心机、电泳仪、显微镜等。

三、实验方法1. DNA提取- 将转基因烟草植株的叶片剪成小块，使用DNA提取试剂盒提取总DNA。

2. PCR扩增- 设计特异性引物，针对目标基因进行PCR扩增。

- 将提取的DNA作为模板，进行PCR扩增。

3. 电泳检测- 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增条带。

4. 测序验证- 对扩增的特异性条带进行测序，验证其序列与目标基因的一致性。

5. Southern blot检测- 使用限制性内切酶酶切转基因烟草植株DNA和野生型烟草DNA。

- 将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，转移至硝酸纤维素膜上。

- 使用放射性同位素标记的目标基因探针进行杂交。

- 显影后观察杂交信号。

6. Northern blot检测- 提取转基因烟草植株RNA，进行反转录PCR，扩增目标基因mRNA。

- 将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，转移至硝酸纤维素膜上。

- 使用放射性同位素标记的目标基因探针进行杂交。

- 显影后观察杂交信号。

四、实验结果1. PCR扩增- 转基因烟草植株DNA的PCR产物在预期位置出现特异性条带，而野生型烟草DNA没有扩增产物。

2. 测序验证- 测序结果显示，扩增产物序列与目标基因序列一致。

3. Southern blot检测- 转基因烟草植株DNA的酶切产物与探针杂交后，在预期位置出现杂交信号，而野生型烟草DNA没有杂交信号。

4. Northern blot检测- 转基因烟草植株RNA的RT-PCR产物与探针杂交后，在预期位置出现杂交信号，而野生型烟草RNA没有杂交信号。

农杆菌介导的植物转基因技术一、实验目的1 了解低温离心机、恒温振荡培养箱、超净工作台等仪器的使用。

2 学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理；掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术的操作流程。

二、实验原理农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。

农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。

因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。

人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

实验一培养基配制一、仪器和试剂1、仪器：高压灭菌锅，超净工作台2、药品：Beef extract (牛肉浸膏) 5g/L ，Yeast extract (酵母提取物) 1g/L ，Peptone (蛋白胨) 5g/L ，Sucrose (蔗糖) 5g/L ，MgSO4.7H2O 0.4g/100ml ，Agar (琼脂) 1.5g/100ml， MS粉，有机溶液，肌醇，Fe盐，NAA（萘乙酸），6-BA （6-苄氨基腺嘌呤），卡那霉素（kan），利福平（rif），链霉素（str）。

二、实验方法第一组配制YEB固体培养基1、配制250mlYEB固体培养基：先称取1.25g Beef extract (牛肉浸膏)；1.25g Peptone (蛋白胨)；0.25g Yeast extract (酵母提取物)；1.25g Sucrose (蔗糖)；1g MgSO4.7H2O；琼脂粉3.75g；将上述药品置于250ml三角瓶中，用量筒称取200ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至250ml，用NaOH调pH=7.4。

称，用高压灭菌锅进行灭菌。

3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60℃时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100μg/ml kan+50μg/ml Str+50μg/ml rif），以免温度过高导致抗生素失效。