无菌技术、倒平板操作、平板划线操作、稀释操作、涂布平板操作

实验六平板划线法分离菌种一、实验目的1、了解平板划线法分离菌种的基本原理2、练习平板划线法分离菌种的基本操作，掌握无菌操作技术二、实验原理平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。

一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。

通常认为这种单菌落就是某微生物的“纯种”。

实际上同种微生物数个细胞在一起通过繁殖也可形成一个单菌落，故在科学研究中，特别是在菌种鉴定等工作中，必须对实验菌种的单菌落进行多次划线分离，才可获得可靠的纯种。

平板划线分离对细菌、酵母菌较为适宜，而霉菌和放线菌的分离多采用稀释分离法进行菌种的分离纯化。

具体的划线形式有多种，这里仅介绍一种经过长期实践并证明可获得良好实验效果的方法：将一个平板分成A、B、C、D4个面积不同的小区进行划线，A区面积最小，作为待分离菌的菌源区，B和C区为经初步划线稀释的过渡区，D区则是关键的单菌落收获区，它的面积最大，出现单菌落的概率也最高。

由此可知，这4个区的面积安排应做到D>C>B>A。

鉴别培养基是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助于快速鉴别某种微生物。

这样的培养基称之为鉴别培养基。

例如用以检查饮水和乳品中是否含有肠道致病菌的伊红美蓝培养基就是一种常用的鉴别性培养基。

（参考GB4789.38-2012食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数）其配方中含有乳糖、伊红和美蓝，用以鉴别肠道病原菌及其他杂菌。

伊红、美蓝作为指示剂，伊红系酸性染料，当大肠埃希氏菌或产气肠杆菌分解乳糖产酸时，由于细菌带正电荷，所以被伊红着色。

在大肠埃希氏菌中因为伊红与美蓝结合，所以菌落不呈红色，而是蓝紫黑色，且具有绿色金属光泽；菌落呈棕色者为产气肠杆菌；不分解乳糖的肠道病原菌则不着色，有时因产生碱性物质较多，细菌带负电荷，被美蓝着色后，菌落并不呈蓝色，因美蓝与伊红结合，所以菌落为淡紫色。

实验五微生物的分离、接种及培养法一目的要求1.掌握倒平板的方法、划线分离法、稀释平板分离法和菌落（活菌）计数法。

2.熟练掌握微生物的接种技术，学会微生物的一般培养方法和无菌操作技术。

二实验原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

常用的分离方法有： 1) 平板划线分离法；2）稀释平板分离法。

在食品发酵工业中，通过微生物的分离、纯化，选育优良的微生物菌种，以提高产品的质量和产量；在食品卫生管理方面，需要进行微生物检测，必须将微生物单一分离出来，加以鉴别和研究。

土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。

因此土壤是微生物多样性的重要场所，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。

微生物的分离和接种是微生物学中重要的技术之一，需要严格的无菌操作，否则使得微生物实验毫无意义。

三实验材料1.菌种：葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、酵母菌、毛霉、曲霉、青霉等含菌样品。

2.培养基：肉汤蛋白胨培养基（斜面、平板）、肉汤蛋白胨液体培养基、蔡氏琼脂培养基（斜面、平板）。

3.土壤（自带）或其他物品；无菌水，无菌培养基，无菌吸管，无菌三角瓶等。

四实验内容与步骤（一）微生物的分离技术1. 平板划线分离法借助划线使混杂的微生物在平板的表面分散开，以获得单个菌落，从而达到分离的目的。

具体方法如下：倒制平板→制备含菌样品稀释液→划线→倒置适温培养→观察记录（1)倒制平板：将固体培养基熔化→冷却至 50-55℃→注入培养皿内 15ml（无菌操作）→旋匀→静置凝固→即成平板→在皿盖边贴标。

（2)含菌样液制备：样品少许（1-10g），加入盛有无菌水的试管内，摇匀，制成菌悬液即可，能直接划线的样品（如体液、黏液、污水等），可省去这操作。

（3)划线：左手持平板，接种环经灼烧灭菌后，以无菌操作取样，迅速将接种环伸入培养皿，轻轻划线（切勿把平板表面划破）。

然后将培养皿倒置放入恒温培养箱37℃，培养24-48 小时，观察平板上出现的现象，注意菌落的形状，并做记录。

平板划线分离_实验六平板划线法分离菌种平板划线法分离菌种一、实验目的1、了解平板划线法分离菌种的基本原理2、练习平板划线法分离菌种的基本操作，掌握无菌操作技术二、实验原理平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。

一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。

通常认为这种单菌落就是某微生物的“纯种”。

实际上同种微生物数个细胞在一起通过繁殖也可形成一个单菌落，故在科学研究中，特别是在菌种鉴定等工作中，必须对实验菌种的单菌落进行多次划线分离，才可获得可靠的纯种。

平板划线分离对细菌、酵母菌较为适宜，而霉菌和放线菌的分离多采用稀释分离法进行菌种的分离纯化。

具体的划线形式有多种，这里仅介绍一种经过长期并证明可获得良好实验效果的方法：将一个平板分成A、B、C、D4个面积不同的小区进行划线，A区面积最小，作为待分离菌的菌源区，B和C区为经初步划线稀释的过渡区，D区则是关键的单菌落收获区，它的面积最大，出现单菌落的概率也最高。

由此可知，这4个区的面积安排应做到DCBA。

鉴别培养基是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助于快速鉴别某种微生物。

这样的培养基称之为鉴别培养基。

例如用以检查饮水和乳品中是否含有肠道致病菌的伊红美蓝培养基就是一种常用的鉴别性培养基。

（参考GB4789.38-2012食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数）其配方中含有乳糖、伊红和美蓝，用以鉴别肠道病原菌及其他杂菌。

伊红、美蓝作为指示剂，伊红系酸性染料，当大肠埃希氏菌或产气肠杆菌分解乳糖产酸时，由于细菌带正电荷，所以被伊红着色。

在大肠埃希氏菌中因为伊红与美蓝结合，所以菌落不呈红色，而是蓝紫黑色，且具有绿色金属光泽；菌落呈棕色者为产气肠杆菌；不分解乳糖的肠道病原菌则不着色，有时因产生碱性物质较多，细菌带负电荷，被美蓝着色后，菌落并不呈蓝色，因美蓝与伊红结合，所以菌落为淡紫色。

高中生物选修三：稀释涂布法与平板划线法的区别
一、平板划线分离法
先倒制无菌琼脂培养基平板，待充分冷却凝固后，在无菌条件下，用接种环沾取少量待分离的含菌样品，在无菌琼脂平板表面进行有规则的划线。

划线的方式有连续划线、平行划线、扇形划线或其它形式的划线。

通过这样在平板上进行划线稀释，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来。

经培养后，可在平板表面形成分散的单个菌落。

但单个菌落并不一定是由单个细胞形成的，需再重复划线1-2次，并结合显微镜检测个体形态特征，才可获得真正的纯培养物。

●用途：一般多用于从菌株的纯化
●优点：简便快速，可以观察菌落特征
●缺点：不能用于计数
二、稀释涂布平板法
该法是将已熔化并冷却至约50℃(减少冷凝水)的琼脂培养基，先倒入无菌培养皿中, 制成无菌平板。

待充分冷却凝固后，将一定量(约0.1 ml)的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用三角形无菌玻璃涂棒涂布，使菌液均匀分散在整个平板表面，倒置温箱培养后挑取单个菌落。

●用途：一般多用于筛选菌株
●优点：可以计数，可以观察菌落特征。

计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。

经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。

此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。

●缺点：操作相对麻烦。

无菌技术：主要包括1、对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒；2、将用于微生物培养的器皿、接种的用具和培养基等进行灭菌；3、为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；4、实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。

倒平板操作：1、将灭菌过的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。

2、右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰；3、用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约10～20ml）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖，轻轻摇匀。

4、等待平板冷却凝固（大约需5～10min）后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。

平板划线操作：1、将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红；2、在火焰旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的棉塞；3、将试管口通过火焰；4、将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液；5、将试管口通过火焰，并塞上棉塞；6、左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。

注意不要划破培养基。

7、灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。

重复以上操作，在三区域内划线。

注意不要将最后一区域的划线与第一区相连。

8、将平板倒置，放入培养箱中培养。

稀释操作：1、将分别盛有9ml水的6支试管灭菌，并按10¹～10的6次方（打不出六次方来）的顺序编号。

2、用移液管吸取1ml培养的菌液，注入10¹倍稀释的试管中。

用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。

3、从10¹倍稀释的试管中吸取1ml稀释液，注入10²倍稀释的试管中，重复第2步的混匀操作。

依次类推，直达完成最后一支试管的稀释。

注：移液管需要经过灭菌。

操作时，试管口和移液管应在离火焰的1～2cm处。

涂布平板操作：1、将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中；2、取少量菌液（不超过0.1ml），滴加到培养基表面；3、将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10s；4、用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。

无菌操作根本技术无菌操作技术不仅在微生物学研究和应用上起着举足轻重的作用，在许多生物技术中也被广泛应用，例如转基因技术、单克隆抗体技术等。

无菌室，微生物实验室内专辟的一个小房间，室外设一个缓冲间，缓冲间的门和无菌室的门不要朝向同一方向，以免气流带进杂菌。

无菌室和缓冲间都必须密闭，无菌室内的地面、墙壁必须平整，不易藏污纳垢、便于清洗，室内装备的换气设备必须有空气过滤装置。

工作台的台面应该处于水平状态，无菌室和缓冲间都装有紫外线灯〔距离工作台面1米〕，工作人员进入无菌室应穿戴灭过菌的服装、帽子。

超净台，主要功能是利用空气层流装置排除工作台面上部包括微生物在内的各种微小尘埃，通过电动装置使空气通过高效过滤器具后进入工作台面，使台面始终保持在流动无菌空气控制之下。

在条件较困难的地方，也可以用木制无菌箱代替超净台〔正面开有两个洞，不操作时用推拉式小门挡住，操作时可以将双臂伸进去；正面上部装有玻璃，便于在内部操作，箱内部装有紫外线灯，从侧面小门可以放进去器具和菌种、细胞株等〕。

微生物的培养在微生物的培养过程中，要保持培养物纯洁性；培养微生物的要领，是为所需要的微生物提供良好的生存环境，同时阻止或抑制其他微生物的生长。

〔一〕培养基1.认识培养基的根本组成成分，从生物体构成的根本元素这一角度理解培养基中为什么都需要具备这些根本成分。

2.培养基的用途和种类：液体和固体两大类。

3.不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方；尽管培养基的配方各不相同，但是其根本成分都包括水、碳源、氮源和无机盐。

4.培养基是否合格〔无菌试验〕：培养基在恒温箱中保温1～2d 后无菌落生长〔液体不变浑浊〕，说明培养基的制备是成功的，否那么需要重新制备。

〔二〕无菌技术1.无菌技术的概念：无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。

日常的生活环境中，每时每刻每处都存在着微生物，任何一个不经意的动作都可能将某种微生物引入到培养物中。

第2课时 微生物的培养技术及应用课标要求 1.获得纯净的微生物培养物是发酵工程的基础。

2.阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的基础。

3.阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品和无菌区域不被微生物污染的技术。

4.举例说明通过调整培养基的配方可有目的的培养某种微生物。

5.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。

6.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。

考点一 微生物的培养技术及应用1．培养基的配制(1)培养基的概念、用途和类型①概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。

②用途：用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。

③种类：按物理性质分⎩⎪⎨⎪⎧液体培养基↓(加入凝固剂，如琼脂)固体培养基(2)培养基的配方①主要营养物质：水、碳源、氮源、无机盐。

②其他条件：pH 、特殊营养物质和氧气。

如下表：微生物 乳酸杆菌 霉菌 细菌 厌氧微生物 特殊需求添加维生素pH 调至酸性pH 调至中性或弱碱性无氧2.无菌技术(1)目的：获得纯净的微生物培养物。

(2)关键：防止杂菌污染。

(3)消毒与灭菌的比较 项目 消毒灭菌 作用强度 较为温和的理化因素 强烈的理化因素 作用程度杀死物体表面或内部一部分微生物杀死物体内外的所有微生物芽孢和孢子一般不能杀灭能杀灭适用对象实验操作的空间、操作者衣着和双手微生物培养器皿、接种用具和培养基等常用方法煮沸消毒法、巴氏消毒法等湿热灭菌法、干热灭菌法、灼烧灭菌法等(4)注意事项①实验操作时，应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品接触。

②为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近进行。

3．微生物的纯培养(1)概念辨析(2)酵母菌纯培养的操作步骤(3)平板划线法操作步骤下图是平板划线操作的示意图，据图回答下列问题：(1)用图中字母和箭头表示平板划线操作的正确步骤：d→b→f→a→e→c→h→g。

常用的微生物分离纯化方法(总7页)-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除(一) 常用的微生物分离纯化方法菌种分离纯化的方法有：稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法、平板划线分离法、稀释摇管法、液体培养基分离法、单细胞分离法、选择培养分离法等。

其中前三种方法最为常用,不需要特殊的仪器设备, 分离纯化效果好, 现分别简述如下1. 稀释混合倒平板法平板是指经熔化的固体培养基倒入无菌培养皿中, 冷却凝固而成的盛有固体培养基的平皿。

该法是先将待分离的含菌样品, 用无菌生理盐水作一系列的稀释(常用十倍稀释法, 稀释倍数要适当), 然后分别取不同稀释液少许 (0.5-1.0ml)于无菌培养皿中, 倾入已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基, 迅速旋摇, 充分混匀。

待琼脂凝固后, 即成为可能含菌的琼脂平板。

于恒温箱中倒置培养一定时间后, 在琼脂平板表面或培养基中即可出现分散的单个菌落。

每个菌落可能是由一个细胞繁殖形成的。

挑取单一个菌落, 一般再重复该法1-2次,结合显微镜检测个体形态特征,便可得到真正的纯培养物。

若样品稀释时能充分混匀,取样量和稀释倍数准确,则该法还可用于活菌数测定。

图4 混合倒平板操作法示意图图5 涂布平板操作法示意图2. 稀释涂布平板法采用上述稀释混合倒平板法有两个缺点，一是会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间,缺乏溶氧而生长受影响,形成的菌落微小难于挑取；一是在倾入熔化琼脂培养基时，若温度控制过高,易烫死某些热敏感菌，过低则会引起琼脂太快凝固, 不能充分混匀。

在微生物学研究中, 更常用的纯种分离方法是稀释涂布平板法。

该法是将已熔化并冷却至约50℃(减少冷凝水)的琼脂培养基, 先倒入无菌培养皿中,制成无菌平板。

待充分冷却凝固后,将一定量(约0.1 ml)的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面, 再用三角形无菌玻璃涂棒涂布,使菌液均匀分散在整个平板表面, 倒置温箱培养后挑取单个菌落。