无菌技术、倒平板操作、平板划线操作、稀释操作、涂布平板操作

实验五微生物的分离、接种及培养法一目的要求1.掌握倒平板的方法、划线分离法、稀释平板分离法和菌落（活菌）计数法。

2.熟练掌握微生物的接种技术，学会微生物的一般培养方法和无菌操作技术。

二实验原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

常用的分离方法有： 1) 平板划线分离法；2）稀释平板分离法。

在食品发酵工业中，通过微生物的分离、纯化，选育优良的微生物菌种，以提高产品的质量和产量；在食品卫生管理方面，需要进行微生物检测，必须将微生物单一分离出来，加以鉴别和研究。

土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。

因此土壤是微生物多样性的重要场所，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。

微生物的分离和接种是微生物学中重要的技术之一，需要严格的无菌操作，否则使得微生物实验毫无意义。

三实验材料1.菌种：葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、酵母菌、毛霉、曲霉、青霉等含菌样品。

2.培养基：肉汤蛋白胨培养基（斜面、平板）、肉汤蛋白胨液体培养基、蔡氏琼脂培养基（斜面、平板）。

3.土壤（自带）或其他物品；无菌水，无菌培养基，无菌吸管，无菌三角瓶等。

四实验内容与步骤（一）微生物的分离技术1. 平板划线分离法借助划线使混杂的微生物在平板的表面分散开，以获得单个菌落，从而达到分离的目的。

具体方法如下：倒制平板→制备含菌样品稀释液→划线→倒置适温培养→观察记录（1)倒制平板：将固体培养基熔化→冷却至 50-55℃→注入培养皿内 15ml（无菌操作）→旋匀→静置凝固→即成平板→在皿盖边贴标。

（2)含菌样液制备：样品少许（1-10g），加入盛有无菌水的试管内，摇匀，制成菌悬液即可，能直接划线的样品（如体液、黏液、污水等），可省去这操作。

（3)划线：左手持平板，接种环经灼烧灭菌后，以无菌操作取样，迅速将接种环伸入培养皿，轻轻划线（切勿把平板表面划破）。

然后将培养皿倒置放入恒温培养箱37℃，培养24-48 小时，观察平板上出现的现象，注意菌落的形状，并做记录。

平板划线分离_实验六平板划线法分离菌种平板划线法分离菌种一、实验目的1、了解平板划线法分离菌种的基本原理2、练习平板划线法分离菌种的基本操作，掌握无菌操作技术二、实验原理平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。

一般是将混杂在一起的不同种微生物或同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。

通常认为这种单菌落就是某微生物的“纯种”。

实际上同种微生物数个细胞在一起通过繁殖也可形成一个单菌落，故在科学研究中，特别是在菌种鉴定等工作中，必须对实验菌种的单菌落进行多次划线分离，才可获得可靠的纯种。

平板划线分离对细菌、酵母菌较为适宜，而霉菌和放线菌的分离多采用稀释分离法进行菌种的分离纯化。

具体的划线形式有多种，这里仅介绍一种经过长期并证明可获得良好实验效果的方法：将一个平板分成A、B、C、D4个面积不同的小区进行划线，A区面积最小，作为待分离菌的菌源区，B和C区为经初步划线稀释的过渡区，D区则是关键的单菌落收获区，它的面积最大，出现单菌落的概率也最高。

由此可知，这4个区的面积安排应做到DCBA。

鉴别培养基是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助于快速鉴别某种微生物。

这样的培养基称之为鉴别培养基。

例如用以检查饮水和乳品中是否含有肠道致病菌的伊红美蓝培养基就是一种常用的鉴别性培养基。

（参考GB4789.38-2012食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数）其配方中含有乳糖、伊红和美蓝，用以鉴别肠道病原菌及其他杂菌。

伊红、美蓝作为指示剂，伊红系酸性染料，当大肠埃希氏菌或产气肠杆菌分解乳糖产酸时，由于细菌带正电荷，所以被伊红着色。

在大肠埃希氏菌中因为伊红与美蓝结合，所以菌落不呈红色，而是蓝紫黑色，且具有绿色金属光泽；菌落呈棕色者为产气肠杆菌；不分解乳糖的肠道病原菌则不着色，有时因产生碱性物质较多，细菌带负电荷，被美蓝着色后，菌落并不呈蓝色，因美蓝与伊红结合，所以菌落为淡紫色。

高中生物选修三：稀释涂布法与平板划线法的区别
一、平板划线分离法
先倒制无菌琼脂培养基平板，待充分冷却凝固后，在无菌条件下，用接种环沾取少量待分离的含菌样品，在无菌琼脂平板表面进行有规则的划线。

划线的方式有连续划线、平行划线、扇形划线或其它形式的划线。

通过这样在平板上进行划线稀释，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来。

经培养后，可在平板表面形成分散的单个菌落。

但单个菌落并不一定是由单个细胞形成的，需再重复划线1-2次，并结合显微镜检测个体形态特征，才可获得真正的纯培养物。

●用途：一般多用于从菌株的纯化
●优点：简便快速，可以观察菌落特征
●缺点：不能用于计数
二、稀释涂布平板法
该法是将已熔化并冷却至约50℃(减少冷凝水)的琼脂培养基，先倒入无菌培养皿中, 制成无菌平板。

待充分冷却凝固后，将一定量(约0.1 ml)的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用三角形无菌玻璃涂棒涂布，使菌液均匀分散在整个平板表面，倒置温箱培养后挑取单个菌落。

●用途：一般多用于筛选菌株
●优点：可以计数，可以观察菌落特征。

计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。

经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。

此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。

●缺点：操作相对麻烦。

实验一培养基的配置（一）牛肉膏蛋白胨培养基的配置（用于分离培养细菌以及测定其数目、天然培养基，）1、称量牛肉膏可以放在小烧杯、表面皿、称量纸中称量，热水溶解后倒入大烧杯。

蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速；滤纸不可称量牛肉膏。

2、溶解加水加热搅拌，药品完全溶解（若配置固体培养基，则加入1%~2%的琼脂，再加热融化，此过程需不断搅拌，以防止琼脂糊底或溢出）定容。

若偏酸，滴加1mol/L NaOH3、调pH 待培养基冷却至室温时检测其pH 不停搅拌并随时用pH试纸检测，若偏碱，滴加1mol/L HClpH调节通常放在加琼脂之前；应注意pH不要调过头，以免回调影响各离子浓度。

液体培养基：滤纸4、过滤固体培养基：4层纱布趁热过滤固体培养基：试管高度的1/5，灭菌后摆斜面、三角瓶的1/25、分装半固体培养基：试管高度的1/36、加透气膜7、包扎将三角瓶的棉塞外包双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿透气膜。

8、灭菌上述培养基121.0℃湿热灭菌20min9、摆斜面斜面长度不超过试管总长1/210、无菌检查37℃温箱培养1-2d（二）高氏1号培养基的配制（放线菌、组合培养基）1、称量和溶解可溶性淀粉加冷水调成糊状，再加水加热溶解；微量成分FeSO4*7H2O 现配成高浓度的储备液后加入：100ml+1g=0.01g/ml 再在1000ml+1ml储备液。

2、同上（三）马丁氏培养基（霉菌、半组合培养基）1、称量和溶解土豆去皮切块煮开半小时，各成分溶解好后，将孟加拉红配成1%的水溶液，在1000ml培养液中加3.3ml，加入琼脂加热融化2、同上3、链霉素的加入它受热易分解，故临用前将培养基融化后待温度降至45℃左右才能加入。

可先将其配成1%溶液，在100ml培养基中加0.3ml，使每ml培养集中含其30μg。

注意事项：称药品时牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖；谨慎调pH，避免多次回调影响各离子浓度；分装过程中注意不要使培养基沾在管上，以免引起试剂污染。

【考纲要求】【考点预测】从近几年高考试题看，微生物的营养、培养基的种类和配制、进行微生物的培养与分离等内容是命题的素材。

培养基的种类与配制是本模块的重点内容，今年高考命题可能会从下面三个方面展开：1．培养基及其无菌技术2．应用选择培养基分离某种特定的微生物3．有关的实验原理、方法、步骤和预测本专题内容侧重考查学生的实际应用能力，考查知识点分布主要集中在微生物的营养、培养基种类和配制、程序及其注意事项、无菌技术、微生物的选择和鉴别培养等。

以非选择题为主，为选做题之一。

【重点解析】微生物的实验室培养1、2、3、4(1)培养基需冷却至50℃时开始倒平板①原因：琼脂是一种多糖，在98℃以上熔化，在44℃以下凝固，倒平板时高于50℃则会烫手，低于50℃时若不能及时操作，琼脂就会凝固。

②估计培养基温度的方法是：培养基从灭菌锅中取出冷却一段时间后用手触摸，感觉上以刚不烫手为准。

(2)平板倒置原因：平板皿盖上会凝结水珠，培养基表面的温度也较高，平板倒置后，既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止肛盖上的水珠落入培养基，造成污染。

5．纯化大肠杆菌操作过程中的注意事项微生物的接种方法中最常用的是稀释涂布平板法和平板划线法（1）稀释涂布平板法 稀释涂布平板的操作比较复杂，且各个细节均需保证“无菌”．应特别注意：①酒精灯与培养皿的距离要合适。

②吸管头不要接触任何其他物体。

③吸管要在酒精灯火焰周围使用。

（2）平板划线法操作步骤：①操作第一步即取菌种之前及每次划线之前接种环都需要进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧目的如下表：②从第二次以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。

例 1 某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。

实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察计数。

请回答与此实验相关的问题。

(1)培养基中含有蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供了 和 。

微生物的分离纯化：平板分离法基本原理分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程。

平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。

即用接种环将菌种接至平板培养基上，或用移液管、滴管将一定体积的菌液移至平板培养基上，然后培养。

其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

包括稀释涂布平板法稀释混合平板法平板划线法土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方，所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的，因此，土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地。

本实验采用三种不同的培养基和方法从土壤中分离细菌、放线菌、酵母菌和霉菌。

操作步骤采样：选取校园内或校园附近地点，用无菌药匙，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样约30g，装入事先准备好的无菌瓶内并盖好。

编号并记录地点、时间及其他环境条件。

一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。

制备土壤稀释液土壤稀释液的制备和稀释液的取样（建议稀释到10-即可）无菌操作1.取三只无菌培养皿，在皿底用记号笔写上稀释度、组别观察分离出的真菌菌落形态。

稀释混合平板法土壤稀释液的制备和稀释液的取样倒平板的无菌操作将融化的琼脂培养基,冷却至50℃左右(以手背能忍受的温度为准)，在酒精灯火焰旁，右手掌心握住三角瓶的底部，左手拿平皿并松动试管塞或瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出，灼烧瓶口。

用左手的大拇子将皿盖掀开一缝，至瓶口刚好伸入，向皿内注入培养基（约15 mL,铺满皿底），迅速盖好皿盖。

左手持培养皿稍加旋转摇动，使培养基均匀分布于整个培养皿底部，然后平置于桌面水平位置,待凝后即为平板。

也可将平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夹住管塞并打开培养皿，再注入培养基，摇匀后制成平板。

无菌操作基本技术无菌操作技术不仅在微生物学研究和应用上起着举足轻重的作用，在许多生物技术中也被广泛应用，例如转基因技术、单克隆抗体技术等。

无菌室，微生物实验室内专辟的一个小房间，室外设一个缓冲间，缓冲间的门和无菌室的门不要朝向同一方向，以免气流带进杂菌。

无菌室和缓冲间都必须密闭，无菌室内的地面、墙壁必须平整，不易藏污纳垢、便于清洗，室内装备的换气设备必须有空气过滤装置。

工作台的台面应该处于水平状态，无菌室和缓冲间都装有紫外线灯（距离工作台面1米），工作人员进入无菌室应穿戴灭过菌的服装、帽子。

超净台，主要功能是利用空气层流装置排除工作台面上部包括微生物在内的各种微小尘埃，通过电动装置使空气通过高效过滤器具后进入工作台面，使台面始终保持在流动无菌空气控制之下。

在条件较困难的地方，也可以用木制无菌箱代替超净台（正面开有两个洞，不操作时用推拉式小门挡住，操作时可以将双臂伸进去；正面上部装有玻璃，便于在内部操作，箱内部装有紫外线灯，从侧面小门可以放进去器具和菌种、细胞株等）。

微生物的培养在微生物的培养过程中，要保持培养物纯净性；培养微生物的要领，是为所需要的微生物提供良好的生存环境，同时阻止或抑制其他微生物的生长。

（一）培养基1.认识培养基的基本组成成分，从生物体构成的基本元素这一角度理解培养基中为什么都需要具备这些基本成分。

2.培养基的用途和种类：液体和固体两大类。

3.不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方；尽管培养基的配方各不相同，但是其基本成分都包括水、碳源、氮源和无机盐。

4.培养基是否合格（无菌试验）：培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长（液体不变浑浊），说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。

（二）无菌技术1.无菌技术的概念：无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。

日常的生活环境中，每时每刻每处都存在着微生物，任何一个不经意的动作都可能将某种微生物引入到培养物中。

在具备无菌环境和获得无菌材料后，还要始终保持无菌状态，才能对某种特定的已知微生物进行研究或利用它们的功能，否则外界的各种微生物很容易混入。