BSA性状定位

bsa建库原理及流程概述及解释说明1. 引言1.1 概述BSA建库（Bulked Segregant Analysis）是一种分子生物学技术，用于筛选与某种性状相关的基因或DNA序列。

它通过将多个个体样本按照性状的表现分成两组，将大量个体混合在一起，然后通过高通量测序技术对这些混合样品进行测序，从而快速、高效地鉴定出与目标性状相关的DNA区域。

1.2 文章结构本文将首先介绍BSA建库的原理和流程，并说明其在不同领域的应用情况。

然后，我们将重点解释BSA建库过程中的关键要点，包括实验设计与样品准备、DNA提取与消化反应以及连接反应与文库构建等方面。

最后，在结论部分总结BSA建库原理和流程，并展望其未来发展方向。

1.3 目的本文旨在全面介绍BSA建库技术及其应用领域，详细解释其中涉及到的关键要点。

通过阅读本文，读者能够了解BSA建库的工作原理和实施流程，并能够根据自己的需求进行相应实验设计和操作步骤。

同时，本文也将探讨BSA建库技术未来的应用前景，为相关领域的研究提供参考和借鉴。

2. BSA建库原理及流程：2.1 BSA建库原理：BSA（Bulked Segregant Analysis）建库是一种用于研究遗传物质中的单倍型差异的高通量测序技术。

其原理基于遗传连锁，通过比较不同表型特征的样品群体之间的遗传变异来确定与感兴趣性状相关的基因或位点。

BSA建库通过首先将具有相同表型特征的个体样本混合在一起构建“bulks”，然后通过对这两个bulks进行全基因组测序来鉴定差异位点。

这些差异位点通常是导致观察到的表型差异的潜在候选位点。

2.2 BSA建库流程：BSA建库可以分为样品处理、DNA提取、文库构建和测序四个主要步骤。

第一步是样品处理，首先需要确定参与研究的两个bulks，即具有不同表型特征的个体混合群体。

根据研究目标和实验设计，选择适当数量的样品进行构建。

第二步是DNA提取，从每个bulks中提取高质量的总DNA，并使用核酸消化酶（例如限制性内切酶）对DNA进行消化反应，将DNA片段切割成小段。

我就是SuperStar——基因定位之BSA前两天有小伙伴留言介绍BSA，这里继续带大家回顾下李广伟师兄在2017年发的BSA教程，之后我还会写一篇有关的文章讲讲BSA 实战话说到了基因组时代，通过正向遗传学，找到一个基因，基本就是三个方法：GWAS、bin-map、BSA。

无论何种方法，用的基本原理还是我们高中生物课本上学的：1.基因在染色体上直线排列，2.染色体会发生重组和交换。

基因组很大，几万个基因，我们很难直接找到影响某个表型的cause基因。

今天要讲的就是BSA。

先给大家讲一个故事假如我们有两个主角“金角大王”和“银角大王”。

金色还是银色，只有一个基因控制。

两位大王基因组上，除了我们目标基因不同造成颜色的差异，还有三个SNP，分别为SNP1、2、3（如图所示）。

注意：原来金色allele和A，G，C在一条染色体上，银色和T，C，G在同一条染色体上。

下面故事发生了：金角大王和银角大王结婚了，然后生了一群小大王，小大王自由婚配生了一群小小大王…….一群小妖，有金色的也有银色的。

有一天，我们抓了一群金色小妖，测个序，看了下每个位点上等位基因频率。

发现这个金色小妖群里SNP2上G的等位基因频率很高，SNP1上A 次之，SNP3上的C的最低（注意到：开始时候SNP2G，SNP1A，SNP3C都是和金色相随相伴的，即起始等位基因频率都是1）。

那么，如果我们只知道SNP1、2、3的等位基因频率，而不知道金色银色基因在哪的话，我们可以基本判断目标基因在SNP2附近，而不在SNP3附近。

为什么呢？因为越近、越连锁，关联性越强。

我们选择这些极端表型的时候，把这个控制表型目标基因的邻居顺便都捞出来了，然后我们可以通过邻居找到当家的。

就是这么简单粗暴的大道理。

也就是说，我们可以通过表型选择，把金角小妖混一块，银角小妖混一块，然后扫描全基因组所有位点等位基因频率差异，找到颜色基因所处的位置。

这就是BSA的基本原理：闲话少说，最近我崇拜的大神，冷泉港的lippman在Cell上灌了一篇封面，两个主要的基因都是通过BSA进行定位，然后用同源基因方法找到的，具体信息自己看文章。

bsa方法中的snp index什么是SNP Index？SNP（Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性）是在基因组中发现的最常见的遗传变异形式之一。

这种变异是指在同一个基因位点上，有两种或更多种不同的碱基存在。

SNP Index是一种基于SNP数据的分析方法，旨在研究特定基因组中与特定性状相关的SNP。

为什么要使用SNP Index？在分析复杂的性状和基因组选择时，SNP Index成为一种强有力的工具。

传统的遗传标记分析要么只能关注少数标记位点，要么需要许多位点进行联合分析。

而SNP Index可以同时关注大量的SNP位点，从而提供更全面的信息。

此外，SNP Index可以通过评估SNP 位点和性状之间的关联度来确定SNP位点的权重，为选择性状提供更大的准确性。

如何计算SNP Index？SNP Index的计算过程通常可以分为以下几个步骤：第一步：SNP位点选择选择与目标性状相关的SNP位点是计算SNP Index的首要任务。

通常可以通过相关分析、关联分析或基因组关联映射等方法来确定与性状相关的SNP位点。

这些SNP位点应该具有较高的遗传效应和统计学的显著性。

第二步：SNP位点加权在SNP Index的计算中，对不同的SNP位点赋予不同的权重是非常重要的。

这些权重通常基于SNP位点与特定性状之间的关联度或遗传效应来确定。

一般来说，与性状更强关联的SNP位点将具有更高的权重。

第三步：SNP Index计算将权重应用到相应的SNP位点上，通过加权的方式计算SNP Index。

计算方法可以根据研究者的具体需求而定，但常用的方法包括简单加权或回归加权等。

第四步：SNP Index排序将得到的SNP Index进行排序，确定具有最高SNP Index值的SNP位点。

这些SNP位点可以被视为对特定性状的最佳预测标记。

第五步：验证与验证由于计算的SNP Index是基于训练数据得出的，因此需要对其进行验证。

1BS A法在植物基因定位上的具体应用群体分离分析法(Bulke d Se gregant A nalysis,BSA)是Miche lmore等在莴苣的抗病性研究中提出的,简称BSA法。

BSA法是从近等基因系分析法演化而来的,它省去了费时费工的选育近等基因系过程,克服了许多作物没有或难以创建相应NIL的限制,在自交和异交物种中均有广泛的应用前景。

对于尚无连锁图或连锁图饱和程度较低的植物,利用BSA法也是进行快速获得与目标基因连锁的分子标记的有效方法。

同时,该方法使数量性状位点QTL效应的测定成为可能。

此法是根据性状在F2代的极端表现分成二组,用这二组提取的DNA 分别混合成DNA库,用此两个DNA库,筛选出与被测性状相关的分子标记,然后,用此标记在分析群体中进行标记与性状间的共分离分析,确定是否连锁及彼此间的遗传距离,进行基因定位。

1.1BSA法在植物育性基因标记筛选及基因定位上的应用迄今为止BS A法在植物育性基因标记筛选及基因定位上得到较广泛的应用。

Zhang等运用RFLP定位了水稻光敏核不育基因。

陈忠明等用BSA法筛选出与秋稻品种A us373广亲和基因连锁的RFL P标记。

李传友等通过A FLP和BSA法,筛选出了一批与水稻光敏核不育(PGMS)基因连锁的多态性AFL P产物,已完成了对4个多态性AFL P产物的克隆。

石永刚等、王泽立等分别采用BSA法-A FLP技术与BSA法-RA PD技术筛选到与玉米S组育性恢复基因(Rf3)连锁的分子标记,不仅为辅助育种奠定了基础,而且为克隆该基因提供了有益的信息。

梁业红等利用BSA和RFLP方法对玉米雄性不育基因(ms30)进行分子标记作图,进而为分子标记辅助育种打下基础。

关荣霞等通过RAPD和BS A分析,找到一个与小麦T型雄性不育恢复基因连锁的RAPD标记。

在油菜类细胞质雄性不育(CMS)研究中,涂金星等筛选到了与育性基因连锁的RAPD标记,而王俊霞等则通过BSA法筛选到了与甘蓝型油菜PolCMS育性恢复基因连锁的两个RA P D标记。

异硫氰酸荧光素标记bsa 方法以异硫氰酸荧光素标记BSA方法引言：异硫氰酸荧光素（Isocyanate Fluorescein，简称FITC）是一种常用的荧光标记剂，具有很高的荧光强度和灵敏度。

BSA（Bovine Serum Albumin）是一种常用的蛋白质载体，用于荧光染色和免疫检测。

本文将介绍一种以异硫氰酸荧光素标记BSA的方法，以及其应用领域。

一、实验材料和仪器：1. 异硫氰酸荧光素（FITC）2. BSA（Bovine Serum Albumin）3. 缓冲液（例如PBS）4. 溶剂（例如二甲基亚砜）5. 离心机6. 荧光显微镜二、实验步骤：1. 准备FITC溶液：将FITC溶解在溶剂中，制备适当浓度的FITC 溶液。

2. 准备BSA溶液：将BSA溶解在PBS缓冲液中，制备适当浓度的BSA溶液。

3. 添加FITC到BSA溶液中：将适量的FITC溶液滴加到BSA溶液中，充分混合。

4. 反应：将FITC和BSA在室温下反应一段时间，通常需要30分钟至1小时。

5. 停止反应：加入适量的抑制剂（例如甲醛）停止反应。

6. 离心：将反应液离心，以去除未反应的FITC和BSA。

7. 洗涤：用PBS缓冲液洗涤沉淀，以去除残留的FITC和抑制剂。

8. 重悬：将洗涤后的沉淀用PBS缓冲液重悬，得到标记好的BSA 溶液。

三、应用领域：1. 免疫荧光染色：标记了FITC的BSA可以用于细胞或组织的免疫荧光染色。

将标记好的BSA溶液加入样品中，充分混合后，使用荧光显微镜观察样品中的荧光信号，以获得目标分子的定位和分布信息。

2. 蛋白质检测：标记了FITC的BSA可以用于蛋白质的定量和检测。

将标记好的BSA溶液与待测蛋白质样品反应，通过测量荧光信号的强度来确定蛋白质的含量。

3. 免疫检测：标记了FITC的BSA可以用于免疫检测中的二抗。

将标记好的BSA溶液加入待检测样品中，充分混合后，通过荧光信号的强度来判断目标分子的存在与否。

江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２４ꎬ４０(１):１６５￣１７３ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ张朝阳ꎬ程㊀瑞ꎬ徐兵划ꎬ等.ＢＳＡ联合转录组分析发掘西瓜叶片黄化候选基因[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２４ꎬ４０(１):１６５￣１７３.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２４.０１.０１８ＢＳＡ联合转录组分析发掘西瓜叶片黄化候选基因张朝阳ꎬ㊀程㊀瑞ꎬ㊀徐兵划ꎬ㊀顾㊀妍ꎬ㊀黄大跃ꎬ㊀孙玉东(江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所/淮安市设施蔬菜重点实验室ꎬ江苏淮安２２３００１)收稿日期:２０２２￣１１￣２８基金项目:淮安市农业科学研究院发展基金项目(ＨＡＮ２０１７１４)ꎻ淮安市自然科学研究技术专项(ＨＡＢ２０２０７９)ꎻ国家西甜瓜产业技术体系淮安综合试验站项目(ＣＡＲＳ￣２５)作者简介:张朝阳(１９８２－)ꎬ男ꎬ江苏连云港人ꎬ硕士ꎬ副研究员ꎬ从事西甜瓜遗传育种研究ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)２８７３６２７０３＠ｑｑ.ｃｏｍꎮ程瑞为共同第一作者ꎮ通讯作者:孙玉东ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｓｕｎｙｕｄｏｎｇ＠ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ㊀㊀摘要:㊀叶片是植物重要的功能器官之一ꎬ不仅是植株进行光合作用的主要场所ꎬ也可作为重要的形态标记ꎬ应用于育种中ꎮ叶片颜色作为形态标记ꎬ不仅可用于苗期杂种的清除ꎬ亦可用于种子纯度的测定ꎮ以西瓜全生育期叶片黄化突变体纯合自交系ｌｙ１０４为母本(Ｐ１)㊁绿叶自交系ｗ３为父本(Ｐ２)ꎬ通过杂交创制Ｆ１代㊁Ｆ２代㊁ＢＣ１代群体ꎮ遗传分析结果表明ꎬ该突变体的叶片黄化由单隐性基因控制ꎮ采用混合分组分析(ＢＳＡ)进行初定位ꎬ通过简化基因组测序(ＲＡＤ)开发全基因组单核苷酸多态性(ＳＮＰ)标记构建西瓜高密度遗传图谱ꎬ将西瓜叶片黄化基因定位于２号染色体１３９５０３０６~１５５１７５９１ｂｐ(大小约为１ ５７Ｍｂ)ꎮ以西瓜９７１０３ｖ２为参考基因组ꎬ该区间包含２４个注释基因ꎮ对Ｐ１(Ｐ１Ｙ)㊁Ｐ２(Ｐ２Ｇ)和Ｆ２代群体中黄叶(Ｆ２Ｙ)㊁绿叶(Ｆ２Ｇ)株系进行转录组水平分析ꎬ结果表明ꎬ目标区间内基因Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３５９５０㊁Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０１０㊁Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０２０㊁Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０６０在黄化叶片与正常绿叶材料中的表达量差异显著ꎬ可能是西瓜叶片的黄化候选基因ꎮ研究结果可为进一步解析西瓜叶片黄化基因功能和生物学特性奠定重要基础ꎮ关键词:㊀西瓜ꎻ黄化ꎻＢＳＡꎻ遗传图谱ꎻ基因定位中图分类号:㊀Ｓ６５１.０１㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２４)０１￣０１６５￣０９ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃａｎｄｉｄａｔｅｇｅｎｅｓｆｏｒｗａｔｅｒｍｅｌｏｎｌｅａｆｙｅｌｌｏｗｉｎｇｂａｓｅｄｏｎＢＳＡａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅａｎａｌｙｓｉｓＺＨＡＮＧＣｈａｏ￣ｙａｎｇꎬ㊀ＣＨＥＮＧＲｕｉꎬ㊀ＸＵＢｉｎｇ￣ｈｕａꎬ㊀ＧＵＹａｎꎬ㊀ＨＵＡＮＧＤａ￣ｙｕｅꎬ㊀ＳＵＮＹｕ￣ｄｏｎｇ(ＨｕａｉｙｉｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＸｕｈｕａｉＤｉｓｔｒｉｃｔｏｆＪｉａｎｇｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅ/ＨｕａｉａｎＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＦａｃｉｌｉｔｙＶｅｇｅｔａｂｌｅｓꎬＨｕａｉａｎ２２３００１ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀Ｔｈｅｌｅａｆｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｏｒｇａｎｓｏｆｐｌａｎｔｓ.Ｉｔｉｓｎｏｔｏｎｌｙｔｈｅｍａｉｎｐｌａｃｅｆｏｒｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｐｌａｎｔｓꎬｂｕｔａｌｓｏｃａｎｂｅｕｓｅｄａｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｍａｒｋｅｒｉｎｂｒｅｅｄｉｎｇ.Ａｓａｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｍａｒｋｅｒꎬｌｅａｆｃｏｌｏｒｃａｎｂｅｕｓｅｄｎｏｔｏｎｌｙｆｏｒｒｅｍｏｖｉｎｇｈｙｂｒｉｄｓａｔｔｈｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓｔａｇｅꎬｂｕｔａｌｓｏｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｓｅｅｄｐｕｒｉｔｙ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬＦ１ꎬＦ２ꎬａｎｄＢＣ１ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｗｅｒｅｃｒｅａｔｅｄｂｙｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎꎬａｎｄｔｈｅｍｕｔａｎｔｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓｉｎｂｒｅｄｌｉｎｅｌｙ１０４ｉｎｔｈｅｗｈｏｌｅｇｒｏｗｔｈｐｅｒｉｏｄｏｆｗａｔｅｒｍｅｌｏｎｗａｓｕｓｅｄａｓｔｈｅｆｅｍａｌｅｐａｒｅｎｔ(Ｐ１)ꎬａｎｄｔｈｅｇｒｅｅｎｌｅａｆｉｎｂｒｅｄｌｉｎｅｗ３ｗａｓｕｓｅｄａｓｔｈｅｍａｌｅｐａｒｅｎｔ(Ｐ２).Ｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｌｅａｆｙｅｌｌｏｗｉｎｇｗａｓｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｂｙａｓｉｎｇｌｅｒｅｃｅｓｓｉｖｅｇｅｎｅ.Ｔｈｅｂｕｌｋｅｄｓｅｇｒｅｇａｎｔａｎａｌｙｓｉｓ(ＢＳＡ)ｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｐｒｉｍａｒｙｍａｐｐｉｎｇꎬａｎｄｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ(ＳＮＰ)ｍａｒｋｅｒｓｗｅｒｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄｂｙｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ￣ｓｉｔｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄＤＮＡ￣ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ(ＲＡＤ)ｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｈｉｇｈ￣ｄｅｎｓｉｔｙｇｅｎｅｔｉｃｍａｐｏｆｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ.Ｔｈｅｗａｔｅｒｍｅｌｏｎｌｅａｆｙｅｌｌｏｗｉｎｇｇｅｎｅｗａｓｌｏｃａｌｉｚｅｄｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ２ａｔ１３９５０３０６￣１５５１７５９１ｂｐ(ａｂｏｕｔ１.５７Ｍｂ).Ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ９７１０３ｖ２ｗａｓｕｓｅｄａｓｔｈｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｇｅｎｏｍｅａｎｄｔｈｅｉｎ￣ｔｅｒｖａｌｃｏｎｔａｉｎｅｄ２４ａｎｎｏｔａｔｅｄｇｅｎｅｓ.ＴｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｌｅｖｅｌｓｏｆＰ１(Ｐ１Ｙ)ꎬＰ２(Ｐ２Ｇ)ａｎｄｙｅｌｌｏｗｌｅａｆ(Ｆ２Ｙ)ａｎｄｇｒｅｅｎｌｅａｆ(Ｆ２Ｇ)ｌｉｎｅｓｉｎＦ２ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＣｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３５９５０ꎬＣｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０１０ꎬＣｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０２０ａｎｄＣｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０６０ｉｎｔｈｅｔａｒｇｅｔｉｎｔｅｒｖａｌｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｂｅｔｗｅｅｎｅｔｉｏ￣ｌａｔｅｄｌｅａｖｅｓａｎｄｎｏｒｍａｌｇｒｅｅｎｌｅａｖｅｓ.Ｔｈｅｓｅｇｅｎｅｓｍｉｇｈｔｂｅｃａｎｄｉｄａｔｅｇｅｎｅｓｆｏｒｅｔｉｏｌａｔｉｏｎｏｆｗａｔｅｒｍｅｌｏｎｌｅａｖｅｓ.Ｔｈｅｒｅ￣５６１ｓｕｌｔｓｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｃａｎｌａｙａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｗａｔｅｒｍｅｌｏｎｌｅａｆｙｅｌｌｏｗｉｎｇｇｅｎｅｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎꎻｅｔｉｏｌａｔｉｏｎꎻＢＳＡꎻｇｅｎｅｔｉｃｍａｐꎻｇｅｎｅｌｏｃａｔｉｏｎ㊀㊀叶片是植物进行光合作用最主要的器官ꎬ对植物的生存具有重要意义ꎬ叶片颜色在很大程度上决定了植物的光合效率[１]ꎮ植物叶色突变不仅是研究叶绿素相关基因功能及植物发育的重要材料[２]ꎬ也是优良的形态标记性状ꎬ在实际生产中常被用来进行品种纯度鉴定[３]ꎮ关于水稻㊁大麦㊁小麦㊁玉米㊁棉花㊁大豆㊁蚕豆㊁番茄㊁拟南芥等多种植物叶色突变的研究已有报道[４]ꎬ叶色突变类型丰富多样ꎬ包括白化㊁黄化㊁黄绿化等[５￣６]ꎮ植株叶色的形成不仅受到叶绿体生物合成途径㊁叶绿素降解途径㊁血红素代谢途径㊁类胡萝卜素代谢途径等与光合色素代谢途径相关基因的影响ꎬ受到与叶绿体发育相关基因的调控ꎬ还与光㊁温度㊁植物激素㊁矿物元素和金属离子等外界环境因素息息相关[６￣９]ꎮ目前ꎬ关于水稻㊁玉米㊁拟南芥等模式植物中叶色的研究较为深入ꎬ水稻㊁玉米中已报道的叶色突变体均超２００个[１０￣１３]ꎬ对拟南芥的研究发现ꎬ叶色突变以隐性遗传为主ꎬ目前已经发现２７个编码１５种叶绿素生物合成酶的核基因ꎬ它们的任何异常突变都会导致叶绿素缺乏ꎬ从而产生黄色突变[１４]ꎮ近年来ꎬ随着高通量测序技术的应用ꎬ关于辣椒㊁甜瓜和黄瓜等一些重要经济作物的叶色突变研究也逐渐展开[１５￣１９]ꎮ西瓜是全球十大水果之一ꎬ中国西瓜栽培面积和消费量均居世界首位ꎮ随着杂交育种的发展ꎬ西瓜育种已基本实现杂种一代化ꎬ对制种纯度提出了更大挑战ꎬ叶形㊁叶色虽是重要的形态标记性状ꎬ但尚未应用于育种中ꎮ西瓜的遗传基础狭窄ꎬ自然突变率低ꎬ目前有关西瓜叶色突变的报道有斑驳突变类型[２０]㊁白化突变类型[２１￣２２]㊁不完全显性黄叶突变类型[２２]㊁后绿突变类型[２３]㊁黄化突变类型[２４￣２５]等ꎬ但研究主要集中于遗传规律㊁生理特性[２１￣２５]ꎮ西瓜基因组的公布和测序技术的快速发展为西瓜重要性状定位㊁关键基因功能研究奠定了重要生物学基础[２６￣２９]ꎮＫｉｄａｎｅｍａｒｉａｍ[３０]发现ꎬ西瓜后绿突变体Ｈｏｕｌｖ中的ＣｌＣＧ０３Ｇ０１００３０基因存在１个单核苷酸多态性(ＳＮＰ)变异ꎬ导致该基因编码的ＦｔｓＨ胞外蛋白酶序列中精氨酸突变为赖氨酸ꎬＦｔｓＨ蛋白主要参与叶绿体早期发育ꎬ进而影响西瓜叶片颜色ꎮＺｈｕ等[２５]对叶片黄化突变西瓜材料ｗ￣ｙｌ进行精细定位ꎬ认为基因Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０４０㊁Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０５０和Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０６０可能是导致西瓜叶片黄化的主要基因ꎮ探索叶片颜色变异机制可为遗传改良提供理论依据ꎬ满足人们在生产㊁选种和育种等方面的需求ꎻ开发叶色形态标记ꎬ能够有效缩短育种周期ꎬ提高育种效率与制种纯度ꎮ本研究拟以全生育期叶片黄化西瓜材料ｌｙ１０４和绿叶西瓜材料ｗ３为试验材料ꎬ通过混合分组分析(ＢＳＡ)测序初步定位叶片黄化基因在染色体中的位置ꎬ进一步利用简化基因组(ＲＡＤ)测序开发全基因组ＳＮＰ分子标记ꎬ利用Ｆ２代群体构建高密度遗传图谱进行西瓜叶片黄化基因定位ꎬ结合转录组测序及基因功能注释锁定关键候选基因ꎮ本研究结果可为进一步全面解析西瓜叶片黄化基因及其生物学功能奠定重要基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料２０１４年ꎬ利用甲基磺酸乙酯(ＥＭＳ)诱变获得的稳定遗传的叶片黄化西瓜材料ꎬ经５代连续自交获得相对纯合的叶片黄化突变材料ｌｙ１０４ꎮ本研究以ｌｙ１０４为母本(Ｐ１)ꎬ以正常绿叶西瓜材料ｗ３为父本(Ｐ２)构建Ｆ１代㊁Ｆ２代㊁ＢＣ１代群体ꎬ群体的构建与表型调查试验均于淮安市农业科学研究院科研创新基地进行ꎬ群体配制过程严格自交㊁杂交ꎬ整个生育期采取商品化管理ꎮ１.２㊀形态观察与遗传规律分析以第１张完全展开的真叶进行表型统计与分析ꎬ采用人工观察和便携式色差仪ＲＭ２００ＱＣ(爱色丽Ｘ￣Ｒｉｔｅꎬ美国)对叶片颜色指数进行测定ꎬ测定指标为亮度值(Ｌ∗)㊁红绿值(ａ∗)和黄蓝值(ｂ∗)３个颜色参数ꎮ对Ｆ１代㊁Ｆ２代㊁ＢＣ１代群体分离表型进行统计ꎬ分析西瓜叶片黄化遗传规律ꎬ并进行卡方检验ꎮ１.３㊀通过ＢＳＡ测序进行叶片黄化初定位ＢＳＡ测序即混合分组分析法ꎬ是一种简单快速的目标性状定位方法ꎬ已被广泛应用于多种园艺作物重要性状的基因定位[３１]ꎮ本研究从Ｆ２代西瓜群体中选取黄叶㊁绿叶极端表型植株各２０株ꎬ采用十六烷基三甲基溴化铵(ＣＴＡＢ)法[３２]提取植株幼叶基６６１江苏农业学报㊀２０２４年第４０卷第１期因组ＤＮＡ并检测其浓度ꎬ通过等量混匀构建２个极端混池ꎬ利用亲本ＤＮＡ构建亲本池进行测序分析ꎬ送至上海凌恩生物科技有限公司ꎬ利用ＩｌｌｕｎｉｍａＨｉＳｅｑ４０００进行测序ꎬ亲本测序深度为１０ˑꎬ混池测序深度为２０ˑꎬ测序读长为１５０ｂｐꎮ对原始序列(Ｒｅａｄ)进行过滤ꎬ去除接头ꎬ过滤掉包含未确定碱基(Ｎ)>１５％和低质量的ｒｅａｄ(质量值ɤ２０的碱基数占整个Ｒｅａｄ的１０％以上)ꎬ将获得的干净序列(Ｃｌｅａｎｒｅａｄ)用于后续分析ꎮ使用ＢＷＡ软件[３３]将高质量的Ｃｌｅａｎｒｅａｄ映射到西瓜基因组９７１０３ｖ２(ｈｔ￣ｔｐ://ｃｕｃｕｒｂｉｔｇｅｎｏｍｉｃｓ.ｏｒｇ/ｏｒｇａｎｉｓｍ/２１)上ꎮ然后用ＧＡＴＫ[３４]㊁ＳｎｐＥｆｆ[３５]软件对突变位点进行检测和注释ꎬ用ＳＮＰ￣ｉｎｄｅｘ算法进行关联分析ꎬ阈值为０ ５ꎮ１.４㊀西瓜高密度遗传图谱的构建为了更精确地定位获得西瓜叶片黄化突变位点ꎬ本研究根据Ｆ２代群体中黄叶㊁绿叶分离比选取共１００份单株ꎬ分别提取基因组ＤＮＡꎬ采用ＲＡＤ建库方式构建长度范围在３００~５００ｂｐ的双端文库ꎮ将产物送至上海凌恩生物科技有限公司ꎬ利用ＩｌｌｕｎｉｍａＨｉＳｅｑ进行测序ꎬ测序读长为１５０ｂｐꎮ对原始Ｒｅａｄ采用以下标准进行质控:(１)去除Ｒｅａｄ中的接头序列ꎻ(２)修剪测序质量较低的Ｒｅａｄ末端(测序质量值小于Ｑ２０)ꎻ(３)去除含Ｎ比例达到１０％的Ｒｅａｄꎻ(４)舍弃接头及质量修剪后长度小于１００ｂｐ的小片段ꎮ用ＢＷＡ软件将Ｃｌｅａｎｒｅａｄ比对至参考基因组９７１０３ｖ２ꎬ并对映射结果进行统计分析ꎮ用ＧＡＴＫ软件进行变异位点检测获得ＳＮＰꎮ对获得的ＳＮＰ按以下标准进行过滤:(１)去除比对Ｒｅａｄ质量值小于２０的位点ꎬ同时过滤掉缺失率大于５０％的ＳＮＰꎻ(２)删除无义ＳＮＰ位点ꎻ(３)用ｊｏｉｎｍａｐ４.０软件[３６]对过滤后的ＳＮＰ进行卡方测验ꎬ先后过滤掉Ｐ<０ ０１和缺失率３０％以上的标记ꎬ对于最终获得的ＳＮＰꎬ采用ｊｏｉｎｍａｐ４.０软件进行西瓜遗传图谱构建ꎬ选用Ｋｏｓａｍｂ ｓ参数ꎮ１.５㊀转录组分析从亲本及其Ｆ２代群体中取ｌｙ０４和ｗ３单株各３份ꎬ当第１张真叶完全展开后取样进行转录组分析ꎮ用ＰｌａｎｔＲＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ试剂盒(购自上海凌恩生物科技有限公司)提取植物总ＲＮＡꎬ并构建转录组测序文库ꎮ送至上海凌恩生物科技有限公司采用ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ进行测序ꎬＲｅａｄ长度为１５０ｂｐꎮ测序数据经质控过滤获得Ｃｌｅａｎｒｅａｄꎬ用Ｈｉｓａｔ２软件[３７]将其映射到西瓜基因组９７１０３ｖ２上ꎮ用每个基因在一个样本中所对应的基因转录本数(ＦＰＫＭ)计算基因表达水平ꎮ基于ＫＥＧＧ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｇｅ￣ｎｏｍｅ.ｊｐ/ｋｅｇｇ/)和ＧＯ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ.ｏｒｇ/)数据库进行基因注释和功能分析ꎮ差异表达基因以差异倍数(Ｆｏｌｄｃｈａｎｇｅ)ȡ１ ５㊁Ｐɤ０ ００５为标准ꎮ１.６㊀候选区域功能注释与候选基因筛选结合遗传规律分析及ＢＳＡꎬ利用ＲＡＤ测序开发全基因组ＳＮＰ标记ꎬ加入叶色表型标记进行西瓜２号染色体图谱的构建ꎬ对西瓜叶片黄化基因进行定位ꎮ以９７１０３ｖ２为参考基因组对定位区间基因进行注释ꎬ通过基因序列分析及转录组测序差异表达情况分析进一步筛选并确定候选基因ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀西瓜叶片黄化特性及遗传规律分析经ＥＭＳ诱变获得叶片黄化的西瓜材料ꎬ经５代连续自交后ꎬ获得遗传稳定的叶片黄化材料ｌｙ１０４ꎬ该材料从子叶期至果实收获时的叶片均保持黄化状态(图１Ａ)ꎮ通过对ｌｙ１０４㊁ｗ３的叶片颜色指标进行测定ꎬ发现叶片黄化西瓜材料与绿叶西瓜材料在叶片颜色指标上存在极显著差异(图１Ｂ)ꎮ㊀㊀分析结果显示ꎬｌｙ１０４和ｗ３的杂交Ｆ１代所有植株叶片均呈绿色ꎬ表明控制黄色和绿色的基因是等位基因ꎬ黄色的突变基因为隐性遗传ꎮＦ２代群体中有１７４个单株为绿叶ꎬ６３个单株为黄叶(表１)ꎮ在Ｆ１代与叶片黄化亲本(Ｐ１)回交群体后代中ꎬ有７３个单株为绿叶ꎬ６３个单株为黄叶ꎮ卡方检验发现ꎬＦ２代群体的分离比符合３ʒ１的孟德尔分离比[χ２(１ꎬｎ＝２３７)＝０.３１６４６ꎬＰ＝０.５７３７>０ ０５００ꎬｎ为群体样本数量]ꎬＢＣ１群体的分离模式符合１ʒ１的孟德尔分离比[χ２(１ꎬｎ＝１３６)＝０.７３５２９ꎬＰ＝０.３９１２>０ ０５００](表１)ꎬ说明西瓜叶片的黄色突变符合单基因控制的隐性遗传规律ꎬ叶片绿叶对黄色表现为显性遗传ꎮ表１㊀Ｆ２代和ＢＣ群体中叶片黄化突变型与野生型的分离比Ｔａｂｌｅ１㊀Ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎｒａｔｉｏｏｆｙｅｌｌｏｗ￣ｌｅａｆｍｕｔａｎｔａｎｄｗｉｌｄｔｙｐｅｉｎＦ２ａｎｄＢＣｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ群体类型群体数量绿叶植株数量黄叶植株数量期望分离比卡方检验值(χ２)ＢＣ１１３６７３６３１ʒ１０.７４Ｆ２２３７１７４６３３ʒ１０.３２χ２检验采用０.０５水平ꎮ７６１张朝阳等:ＢＳＡ联合转录组分析发掘西瓜叶片黄化候选基因Ａ:表型ꎻＢ:颜色指数ꎮＬ∗:亮度(阈值０~１００)ꎻａ∗:红绿色范围(阈值－１２８~＋１２７)ꎻｂ∗:黄蓝色范围(阈值－１２８~＋１２７)ꎻＭＴ:突变体叶片黄化材料ꎻＷＴ:野生型材料ꎮ∗∗表示不同材料间差异极显著(Ｐ<０ ０１)ꎮ图１㊀西瓜绿叶和黄叶突变体的表型及颜色指数Ｆｉｇ.１㊀Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅａｎｄｃｏｌｏｒｉｎｄｅｘｏｆｗａｔｅｒｍｅｌｏｎｇｒｅｅｎ￣ｌｅａｆｍｕｔａｎｔａｎｄｙｅｌｌｏｗ￣ｌｅａｆｍｕｔａｎｔ２.２㊀西瓜叶片黄化基因的ＢＳＡ初定位原始Ｒｅａｄ经质控过滤ꎬ２个混池共获得１２.４Ｇｂ高质量ＣｌｅａｎｒｅａｄꎬＱ３０在９３ ０％以上ꎬ与参考基因组９７１０３ｖ２的平均比对率在９８ ０％以上ꎮ使用ＧＡＴＫ软件进行变异检测ꎬ共获得５２３３０３个ＳＮＰꎬ经过滤后用ＳＮＰ￣Ｉｎｄｅｘ算法对性状相关侯选区域进行选择ꎬ作图窗口大小为１Ｍｂꎬ作图步移为１０ｋｂꎬ阈值为０ ５ꎬ结果表明ꎬ西瓜叶色黄化基因定位于２号染色体８４９０００１~２６４１００００ｂｐ(大小约为１７ ９２Ｍｂ)(图２Ａ)ꎮ２.３㊀高密度西瓜遗传图谱的构建与叶片黄化基因的定位㊀㊀根据分离比ꎬ从Ｆ２代群体中选取７６株绿叶㊁２４株黄叶西瓜单株进行ＲＡＤ测序ꎬ共获得６９ １７Ｇｂ高质量ＣｌｅａｎｒｅａｄꎬＱ３０在９１ ３％以上ꎬ与参考基因组的平均比对率在９７ ６％以上ꎮ使用ＧＡＴＫ软件进行变异检测ꎬ共获得２２９７０４个ＳＮＰꎬ经过滤筛选ꎬ最终确定４２７３个ＳＮＰ用于西瓜高密度遗传图谱的构建ꎮ西瓜遗传图谱总长度为１６０２.４４ｃＭꎬ平均遗传距离为０ ３９ｃＭꎬ最大间隔为７ ３８ｃＭ(表２)ꎮ㊀㊀为了进一步精确定位西瓜叶片黄化基因ꎬ用ＲＡＤ测序结果对西瓜２号染色体上的ＳＮＰ标记进行过滤筛选ꎬ剔除检测率低于４０％的样品单株和标记ꎬ最终用９１份单株(６８份绿叶ꎬ２３份黄叶)㊁２８６个ＳＮＰ标记进行叶片黄化基因定位ꎬ叶片颜色标记(Ｌｅａｆｃｏｌｏｒ)用绿叶(Ｄ)㊁黄叶(Ｂ)表示ꎬ用ｊｏｉｎｍａｐ４进行西瓜叶片黄化基因的定位ꎮ结果显示ꎬＬｅａｆｃｏｌ￣ｏｒ定位于Ｃｌａｓ９７Ｃｈｒ０２￣１３９５０３０６与Ｃｌａｓ９７Ｃｈｒ０２￣１５５１７５９１标记之间(大小约为１ ５６７Ｍｂ)(图２Ｂ)ꎬ以西瓜９７１０３ｖ２为参考基因组ꎬ该区间包含２４个注释基因(图２Ｃ㊁表３)ꎮ表２㊀西瓜高密度遗传图谱构建结果Ｔａｂｌｅ２㊀Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈｄｅｎｓｉｔｙｇｅｎｅｔｉｃｍａｐｏｆｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ基因组位置标记数量遗传长度(ｃＭ)平均遗传距离(ｃＭ)标记最大间隔(ｃＭ)Ｌｇ０１４３７１６１.１５０.３７２.６２Ｌｇ０２５０４１８５.４９０.３７２.３２Ｌｇ０３１０９６０.１３０.５５３.１６Ｌｇ０４６２８２７８.３２０.４４３.８７Ｌｇ０５３１４１１４.８１０.３７２.８７Ｌｇ０６３８０９５.０８０.２５２.７５Ｌｇ０７４８１１８６.９００.３９２.８２Ｌｇ０８２０５７２.０３０.３５２.１７Ｌｇ０９４３７１４７.５２０.３４２.２１Ｌｇ１０４５９１２１.６００.２６２.４０Ｌｇ１１３１９１７９.４１０.５６７.３８合计４２７３１６０２.４４０.３９－８６１江苏农业学报㊀２０２４年第４０卷第１期２.４㊀西瓜黄化叶片转录组分析及候选基因的筛选ＲＮＡ￣ｓｅｑ共检测１２个样本ꎬ其中Ｐ１㊁Ｐ２分别选取３个样本ꎬＦ２代群体中叶片黄化类型㊁绿叶类型分别选取３个样本ꎬ每个样本平均获得６ ４Ｇｂ高质量Ｃｌｅａｎｒｅａｄ数据ꎬＱ３０在９２ ０％以上ꎬ平均基因组比对率为９１ ４％ꎮ分别以Ｐ２Ｇ(亲本绿叶)与Ｐ１Ｙ(亲本黄叶)和Ｆ２Ｇ(Ｆ２代绿叶)与Ｆ２Ｙ(Ｆ２代黄叶)为对比组进行独立分析ꎬ其中Ｐ２Ｇ与Ｐ１Ｙ对比组中共检测到１３５６个差异表达基因ꎬ其中上调表达的基因５２９个ꎬ下调表达的基因８２７个ꎻＦ２Ｇ与Ｆ２Ｙ对比组中共检测到４１８０个差异表达基因ꎬ其中上调表达的基因１３７８个ꎬ下调表达的基因２８０２个(图３Ａꎬ图３Ｂ)ꎮＰ２Ｇ与Ｐ１Ｙ对比组和Ｆ２Ｇ与Ｆ２Ｙ对比组中均显著下调表达的基因共有３２７个㊁均显著上调表达的基因共有１３２个(图３Ａ)ꎮ以上结果表明ꎬ亲本中黄叶和绿叶差异表达基因数量显著小于Ｆ２代群体ꎬ说明Ｐ１和Ｐ２已相对纯合ꎻＧＯ和ＫＥＧＧ富集分析结果表明ꎬ差异表达基因富集通路多与光合㊁应激反应等有关ꎬ说明黄叶和绿叶西瓜植株在光合作用等方面存在较大差异ꎮ表３㊀候选区间注释基因Ｔａｂｌｅ３㊀Ｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｎｏｔａｔｉｏｎｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｃａｎｄｉｄａｔｅｉｎｔｅｒｖａｌ基因㊀㊀染色体起始位置(ｂｐ)终止位置(ｂｐ)基因方向基因功能注释㊀㊀㊀㊀㊀Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３５８９０染色体２１３９５６４１７１３９５７３２７－ａｃａｎｔｈｏｓｃｕｒｒｉｎ￣１￣ｌｉｋｅＣｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３５９００染色体２１４０２９９６８１４０３１１１０－未知的蛋白质Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３５９１０染色体２１４０３１２０２１４０３２２６５－ａｃａｎｔｈｏｓｃｕｒｒｉｎ￣１￣ｌｉｋｅＣｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３５９２０染色体２１４０３３５８０１４０３７３７９－未知的蛋白质Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３５９３０染色体２１４０５５６７６１４０５７３７８－含ＢＰＴＩ/Ｋｕｎｉｔｚ结构域的蛋白质２亚型Ｘ２Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３５９４０染色体２１４１５７１２２１４１５８３１０＋未知的蛋白质Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３５９５０染色体２１４２０１３７３１４２０２３７５－与ＴＭＡ７相关的翻译机制蛋白质Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３５９６０染色体２１４２６７３１０１４２７０８０９－Ｂ类锌指蛋白质转录因子ꎬ包含ＤＵＦ１６６４结构域Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３５９７０染色体２１４２７０９０６１４２７４８４７＋脂质结合血清糖蛋白质Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３５９８０染色体２１４２７７６８６１４２７８９０４－蛋白质核融合缺陷６ꎬ叶绿体/线粒体样亚型Ｘ１Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３５９９０染色体２１４２８３０４７１４２８３３２９＋未知的蛋白质Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０００染色体２１４３７００８６１４３７２００２＋抗坏血酸氧化酶同源物Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０１０染色体２１４３７６４３９１４３７６７８２＋未知的蛋白质Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０２０染色体２１４４６１３７６１４４６４３０７－双组分反应调节蛋白质Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０３０染色体２１４４９４６０７１４４９７１１４＋双组分反应调节蛋白质Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０４０染色体２１４５４９７６５１４５５０４２５＋包含ＤＵＦ６７９结构域的蛋白质Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０５０染色体２１４５５０６２６１４５５１９３５－ＤＮＡＪ同源亚家族Ｂ成员１３Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０６０染色体２１４６７０６９３１４６７１７０７＋蛋白质Ｙｃｆ２Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０７０染色体２１４８３７２１９１４８７５２７７－Ｕ１１/Ｕ１２小核核糖核蛋白(相对分子质量６５０００)蛋白质亚型Ｘ２Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０８０染色体２１４９９０５２０１４９９０７１９－未知的蛋白质Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０９０染色体２１５０５９８９９１５０６３２０９＋环型Ｅ３泛素转移酶Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６１００染色体２１５１５５２０９１５１５７４５６＋含五肽重复的家族蛋白质Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６１１０染色体２１５１６５１４２１５２２６９８６＋尼曼￣匹克Ｃ１蛋白样亚型Ｘ２Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６１２０染色体２１５２３１４６０１５２３１９７６－锌指家族蛋白质＋ 表示基因注释在染色体正链ꎻ － 表示基因注释在染色体负链ꎮ㊀㊀对西瓜２号染色体１３９５０３０６~１５５１７５９１ｂｐ(大小约为１ ５６Ｍｂ)内的２４个注释基因进行功能分析和转录组表达差异分析ꎬ结果显示ꎬ２４个注释基因中有１７个在植株叶片中表达ꎬ仅有基因Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０６０㊁９６１张朝阳等:ＢＳＡ联合转录组分析发掘西瓜叶片黄化候选基因Ａ:ＢＳＡ定位结果ꎮＢ:西瓜２号染色体遗传图谱及叶色黄化标记定位ꎮＣ:根据西瓜参考基因组９７１０３ｖ２注释候选区域的基因ꎮＳＮＰｉｎｄｅｘ:单核苷酸多态性指数ꎮ图２㊀西瓜叶片黄化基因精细定位Ｆｉｇ.２㊀ＦｉｎｅｍａｐｐｉｎｇｏｆｌｅａｆｙｅｌｌｏｗｉｎｇｇｅｎｅｓｉｎｗａｔｅｒｍｅｌｏｎＡ:Ｐ２Ｇ与Ｐ１Ｙ对比组及Ｆ２Ｇ与Ｆ２Ｙ对比组上调和下调基因数量Ｖｅｎｎ图ꎻＢ:Ｐ２Ｇ与Ｐ１Ｙ对比组及Ｆ２Ｇ与Ｆ２Ｙ对比组上调和下调基因数量柱形图ꎻＣ:Ｆ２Ｇ与Ｆ２Ｙ对比组差异基因火山图ꎬ标注基因为候选区间基因ꎮＰ１Ｙ:亲本黄叶ꎻＰ２Ｇ:亲本绿叶ꎻＦ２Ｇ:Ｆ２代绿叶ꎻＦ２Ｙ:Ｆ２代黄叶ꎮ图３㊀西瓜黄叶与绿叶转录组差异表达基因分析Ｆｉｇ.３㊀Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｏｆｗａｔｅｒｍｅｌｏｎｙｅｌｌｏｗｌｅａｆａｎｄｇｒｅｅｎｌｅａｆ０７１江苏农业学报㊀２０２４年第４０卷第１期Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３５９５０㊁Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０１０㊁Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０２０在叶片黄化植株与绿叶植株中的表达存在显著差异ꎬＣｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０６０在Ｐ２Ｇ和Ｆ２Ｇ中均显著上调表达(图３Ｃ)ꎬ其注释功能为Ｙｃｆ２蛋白编码基因ꎬ该编码基因为被子植物中最重要的质体基因ꎬ与植物光合作用有关ꎮ３㊀讨论与结论化学ＥＭＳ诱变是人工创造突变体最常用的处理方式之一ꎬ叶片黄化是最常见的诱变表型[２２]ꎮ笔者所在课题组前期通过ＥＭＳ诱变西瓜种子ꎬ获得稳定遗传的西瓜叶片黄化材料ꎬ其整个生育期均可保持黄化状态ꎮ植物叶片黄化突变ꎬ又称叶绿素缺乏突变ꎬ通常是由叶绿素合成或降解途径被破坏所致[３８]ꎮ目前ꎬ研究者已经在水稻[３９]㊁番茄[４０]㊁黄瓜[１９]㊁拟南芥[４１]等植物中发现了黄化突变体ꎮ有研究发现ꎬ不同类型的叶色突变的遗传规律差异较大ꎬ有些叶色突变可能是核遗传ꎬ也可能是细胞质遗传ꎬ水稻[４２]㊁玉米[４３]㊁小麦[４４]㊁黄瓜[４５]㊁番茄[４６]等都由１对或２对隐性核基因控制ꎮＺｈａｎｇ等[２１]研究证实ꎬ西瓜叶片白化突变是由１对隐性等位基因(ｊａｊａ)控制的ꎮＰｒｏｖｖｉｄｅｎｔｉ[２０]发现ꎬ西瓜叶色斑驳突变由１对隐性基因(ｓｌｖ)控制ꎮＫｉｄａｎｅｍａｒｉａｍ等[３０ꎬ４７]发现ꎬ西瓜叶色后绿突变是由１个隐性基因(ｄｇｄｇ)控制的ꎮＺｈｕ等[２５]研究发现ꎬ西瓜黄化突变体ｗ￣ｙｌ由１对隐性核基因控制ꎬ与本研究结果一致ꎮ西瓜作为重要的园艺经济作物[４８￣５１]ꎬ在中国的栽培面积和产量均居世界首位ꎮ经长期人工选择ꎬ栽培西瓜遗传背景狭窄ꎬ多态性分子标记开发受限ꎬ致使西瓜分子标记辅助育种及品种改良进展缓慢ꎮ高密度遗传图谱的构建不仅是开发西瓜重要农艺性状遗传基因/ＱＴＬ紧密连锁分子标记的重要手段ꎬ亦是深入挖掘和解析西瓜重要农艺性状基因的基础ꎬ通过遗传图谱构建进行基因/ＱＴＬ定位研究已经在西瓜多种性状研究中得到成熟应用[５２￣５３]ꎮ本研究基于ＢＳＡ定位ꎬ将西瓜叶片黄化基因定位于２号染色上ꎬ为了进一步获得可靠定位基因ꎬ本研究开发了ＳＮＰ标记ꎬ用于构建高密度西瓜遗传图谱ꎬ并将西瓜叶片黄化基因定位到２号染色体１３９５０３０６~１５５１７５９１ｂｐ(大小约为１ ５６Ｍｂ)ꎬ比对西瓜参考基因组９７１０３ｖ２发现ꎬ在候选区段内包含２４个注释基因ꎬ１７个基因在叶片中表达ꎬ４个基因在黄叶与绿叶转录组分析中存在显著差异表达ꎬ其中基因Ｃｌａ９７Ｃ０２Ｇ０３６０６０是Ｙｃｆ２蛋白的编码基因ꎬＹｃｆ２/ＦｔｓＨ调控的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸￣苹果酸脱氢酶是叶绿体或非光合质体在黑暗中产生腺嘌呤核苷三磷酸的关键酶[５４]ꎬ是光合生长必需的酶[５５]ꎮ目前ꎬＹｃｆ２基因已被证实是被子植物中最重要的质体基因[５６]ꎬ它在高等植物中发挥着重要功能[５７]ꎮ在本研究中ꎬ由于双亲重测序深度不高ꎬ候选区间注释基因编码区中未发现可靠突变ꎬ但转录组结果显示ꎬＹｃｆ２在叶片黄化西瓜材料中的表达量显著下调ꎬ说明叶片黄化西瓜材料的光合作用系统可能与正常绿叶植株光合系统存在显著差异ꎬ相关机制需要进一步研究ꎮ本研究结果可为进一步挖掘叶片黄化植株光合作用机制奠定一定科学基础ꎮ参考文献:[１]㊀陈婷婷ꎬ符卫蒙ꎬ余㊀景ꎬ等.彩色稻叶片光合特征及其与抗氧化酶活性㊁花青素含量的关系[Ｊ].中国农业科学ꎬ２０２２ꎬ５５(３):４６７￣４７８. 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[２６]ＧＵＯＳＧꎬＺＨＡＮＧＪＧꎬＳＵＮＨＨꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｄｒａｆｔｇｅｎｏｍｅｏｆｗａ￣ｔｅｒｍｅｌｏｎ(Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓｌａｎａｔｕｓ)ａｎｄｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆ２０ｄｉｖｅｒｓｅａｃｃｅｓ￣ｓｉｏｎｓ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓꎬ２０１３ꎬ４５:５１￣５８.[２７]ＧＵＯＳＧꎬＺＨＡＯＳＪꎬＳＵＮＨＨꎬｅｔａｌ.Ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｏｆ４１４ｃｕｌ￣ｔｉｖａｔｅｄａｎｄｗｉｌｄｗａｔｅｒｍｅｌｏｎａｃｃｅｓｓｉｏｎｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓｓｅｌｅｃｔｉｏｎｆｏｒｆｒｕｉｔｑｕａｌｉｔｙｔｒａｉｔｓ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓꎬ２０１９ꎬ５１(１１):１６１６￣１６２３. [２８]ＷＵＳꎬＷＡＮＧＸꎬＲＥＤＤＹＵꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｏｍｅｏｆ ＣｈａｒｌｅｓｔｏｎＧｒａｙ ꎬｔｈｅｐｒｉｎｃｉｐａｌＡｍｅｒｉｃａｎｗａｔｅｒｍｅｌｏｎｃｕｌｔｉｖａｒꎬａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ１３６５ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓｉｎｔｈｅＵ.Ｓ.ＮａｔｉｏｎａｌＰｌａｎｔＧｅｒｍｐｌａｓｍＳｙｓｔｅｍｗａｔｅｒｍｅｌｏｎｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌꎬ２０１９ꎬ１７(１２):２２４６￣２２５８.[２９]ＬＩＬＩＭꎬＱＩＮＧＷꎬＹＡＮＹＡＮＺꎬｅｔａｌ.Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅｇｅｎｏｍｅｅｖｏ￣ｌｕｔｉｏｎꎬｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎꎬａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｒｅｅｄｉｎｇ[Ｊ].ＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０２２ꎬ９:ｕｈａｂ０５７.[３０]ＫＩＤＡＮＥＭＡＲＩＡＭＨＧ.西瓜叶色后绿和植株短蔓性状的遗传与分子机制研究[Ｄ].北京:中国农业科学院ꎬ２０２０. 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重测序bsa技术原理重测序BSA技术原理是现代遗传学中最重要的技术之一。

它是一种通过环状PCR扩增技术和测序高通量技术检测基因变异的方法。

本文将从技术原理、方法流程、优缺点等方面详细阐述。

首先，BSA技术原理基于遗传位点在杂交种群中的分离，通过PCR扩增、库建立、测序等一系列操作，筛选出突变位点。

具体步骤如下：第一步，制备DNA样品。

需要从不同菌株或植株样本中提取DNA 样品，纯化后合并成同等质量的混合DNA样品。

第二步，BSA过滤。

将混合DNA样品进行PCR扩增，得到一条长约300-500bp的PCR产物。

然后进行BSA过滤，筛选出对应位点的PCR 条带，进行回收。

第三步，建立DNA文库。

回收的PCR产物首先要进行文库建立。

文库的建立方法有很多种，最常用的是同时使用T4 DNA聚合酶和多个ATP酰化酶，将PCR产物扩增并文库化。

建立好的文库可以用于后续测序分析。

第四步，高通量测序。

测序可以使用目前流行的Illumina测序平台。

测序结果会生成一系列序列片段，我们可以利用这些片段进行序列比对和SNP鉴定等分析。

第五步，SNP鉴定。

利用比对软件将测序片段与原来基因组数据进行比对，鉴定出SNP突变位点，进一步进行验证和鉴定。

通过以上一系列操作，我们可以在遗传群体内筛选出突变位点，并判断是否遗传贡献存在，从而进一步研究与分析这种遗传变异的功能和鉴定路径等问题。

BSA技术相对于其他遗传分析方法有着明显的优点。

首先，它可以针对各种生物材料，不分样品来源与类型；其次，它具有很高的分辨率。

在物种较少的情况下，BSA技术可以直接对突变位点进行鉴定并验证，从而保证了分析的准确性；同时，BSA技术的重点在于检测遗传双一体性，比起散点分析等其他分析手段更加容易分析遗传变异。

但是，BSA方法也有一些缺点。

首先，BSA技术在筛选突变位点方面存在一定的局限性。

如果突变在杂交种群中的频率过低、过高或存在不同的等位基因则会干扰筛选的准确性。

bsa牛血清白蛋白氨基酸序列概述及解释说明1. 引言1.1 概述在生物学领域中，蛋白质是生命活动的基本组成部分。

牛血清白蛋白（BSA）作为一种重要的血浆蛋白，在许多研究领域中扮演着至关重要的角色。

BSA是由585个氨基酸残基组成的大分子蛋白质，它主要存在于牛血液中并且具有多种功能和特点。

其结构包含多个不同的功能域，使得BSA在运输营养物质、调节渗透压、维持酸碱平衡等方面发挥着重要作用。

1.2 文章结构本文将围绕BSA牛血清白蛋白的氨基酸序列展开解释说明，并介绍相关研究进展。

文章从引言开始，依次包括概述、文章结构和目的等部分。

接下来，我们将对BSA牛血清白蛋白进行详细介绍并阐明其特点。

随后，描述了常用的氨基酸序列分析方法，并解读了BSA氨基酸序列与功能之间的关系。

在第三部分中，我们将介绍与BSA氨基酸序列相关的研究进展。

这包括了其他物种血清中类似蛋白的发现、BSA在生物学和医学领域中的应用研究以及遗传变异对BSA氨基酸序列的影响等内容。

随后，我们将提供结果与讨论部分，包括对BSA氨基酸序列的组成和特征分析结果，并对其可能功能进行初步探讨。

最后，在结论部分，我们将总结文章的主要内容，并强调BSA牛血清白蛋白氨基酸序列在生物学领域中的重要性和潜在应用价值。

1.3 目的本文旨在全面了解和解释BSA牛血清白蛋白的氨基酸序列。

通过分析BSA的氨基酸组成、特点和功能，提高对这一重要蛋白质的认识。

同时，介绍相关研究进展可以帮助我们更好地理解BSA在生物学和医学领域中的应用潜力，并为未来进一步深入研究提供基础。

2. BSA牛血清白蛋白氨基酸序列解释说明：2.1 BSA牛血清白蛋白简介及特点：BSA，全称为Bovine Serum Albumin，是一种在牛的血浆中广泛存在的蛋白质。

它是一种单链结构的球状蛋白质，具有多种生物学功能。

BSA在解决生化实验中的很多问题上都发挥着重要作用，如稀释试剂、载体蛋白或是控制反应条件等方面。

BSA开场介绍以及引入正题：老师您好，我是上海美吉生物的XXX，我们公司主要从事高通量测序业务，包括基因组、转录组、蛋白代谢组和宏基因组和宏转录组等，之前了解到您这边有一个关于利用混池分析进行番茄抗病性状的基因定位的项目，这里是我们公司推出的基于高通量测序，开发高密度分子标记利用BSA进行性状定位的产品介绍，您这边也可以看一下，像我们公司在性状定位这方面经验还是比较丰富的，老师我给您介绍下我们这个产品。

介绍BSA资料和案例：（递给老师资料：介绍BSA）您看，这是我们公司的两个成功案例，利用BSA方法，成功的定位到目标性状的关联基因，而且候选基因个数非常少，老师也非常满意，当时就又加做了几个BSA的项目，现在在线的BSA项目也比较多，分析经验非常丰富，我给您介绍下BSA的做法：介绍BSA的做法：BSA是一种利用混池测序的方法进行性状定位，其做法是，选择表型差异显著的亲本构建出分离群体，再从分离群体中选取目标性状表型极端差异的个体进行混合测序（例如抗病和不抗病，株高的和株矮的，当然在mutmap做法时可以单个混池），去构建两个DNA混池（DNA pools），简单来说，其基本原理就是两个混池间的DNA差异片段的区域即为目标基因候选区域。

后续，对目标区域内的候选基因通过GO、KEGG等数据库注释进行筛选。

得到目标基因之后，可以进行验证分析，例如SNP的验证，qPCR验证基因表达量，或者通过过表达，基因沉默等进行验证。

（具体Mutmap，QTL-seq混池个数和测序策略一定要熟悉，老师肯定会问。

）BSA实际应用：像2015年，日本科学家利用BSA的方法，成功定位了水稻耐盐的基因，在日本发生大海啸之后，仅仅用了两年就成功培育了水稻耐盐新品种。

而且BSA采用的混池测序，大大降低了测序成本。

所以BSA最大的优势在于节约时间、精力和经费，而且BSA的方法已经广泛应用在不同的物种中，已经成功的定位出黄瓜早花基因，水稻抗稻瘟病基因等。

bsa基因定位方法BSA(BulkedSegregantAnalysis)基因定位方法是一种利用分离群体中的极端单株组成的混合池进行快速基因定位的方法。

这种方法首先从一对具有目标基因表型差异的亲本所产生的分离群体中，根据目标基因的表型分别选取一定数量的植株，构成两个亚群或集团。

然后将每群的DNA等量混合，形成两个相对性状的“基因池”，用合适的分子标记对这两个基因池进行分析，找出在两群间表现多态性的分子标记，这些分子标记与目标性状基因座位相连锁。

最后，利用某一作图群体进行分析，进一步检测所得分子标记与目标性状基因的连锁程度，以及其在某已知分子图谱中或染色体上的位置，从而完成真正意义上的对基因的标记定位。

BSA基因定位方法的优点在于其高效、经济和易于操作。

与其他基因定位方法相比，BSA方法可以在较短的时间内获得较为准确的结果。

此外，该方法对实验材料的要求较低,适用于各种植物和动物物种的研究。

然而，BSA方法也存在一定的局限性，例如对于多基因性状的定位准确性较低，以及可能出现的遗传拖尾现象。

在实际应用中，BSA基因定位方法已被广泛应用于植物、动物和微生物等领域。

例如，在农作物育种中，通过BSA方法可以快速定位具有重要经济性状的基因，为分子育种提供了重要依据。

在医学研究中，BSA方法也被用于定位遗传疾病的致病基因，为遗传病的诊断和治疗提供了关键信息。

此外，BSA方法还在法医学、动物遗传育种等领域发挥着重要作用。

随着分子生物学技术的不断发展，BSA基因定位方法也在不断改进。

例如，通过采用更为先进的分子标记技术和数据分析方法，可以提高BSA方法的定位准确性，降低遗传拖尾现象θ同时，结合其他基因定位方法，如RFLP （限制性片段长度多态性）、AFLP（扩增片段长度多态性）等，可以进一步提高BSA方法的有效性。

此外，基于BSA方法的基因定位平台也在不断拓展，以满足不同研究领域和应用场景的需求。

在我国，BSA基因定位方法得到了广泛的应用和研究。