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雷公藤甲素的含量检测分析雷公藤甲素的含量检测分析海棠合剂由雷公藤、竹茹、佛手、莱菔子、赤芍五种药味加工而成，具有清热解毒、祛风除湿、杀虫止痒的功效，适用于银屑病、湿疹、红斑狼疮等疾病[1].雷公藤为方中的君药，系卫矛科植物11.1AE-240Millipore1.21.3色谱条件色谱柱：DiamonsilC18色谱柱（250mm×4.6mm,5μm）;流动相：乙腈-水，梯度洗脱（0~20分钟，20%A→50%A;20~21分钟，50%A→20%A）,流速：1.0mL/min;进样量10μl;紫外检测波长220nm;柱温35℃;理论板数按雷公藤甲素峰计算，应不低于10000.1.4对照品溶液的制备精密称取雷公藤甲素对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.2mg对照品溶液。
1.5供试品溶液的制备根据相关报道[8-10],本实验采用，精密量取海棠合剂50ml,加中性氧化铝15g,水浴蒸干并混合均匀，用三氯甲烷作溶剂，湿法装入已有15g中性氧化铝层析柱中，再用三氯甲烷200ml洗脱，1.622.12.26μl、8μl、10μl及3号1μl、5μl注入液相色谱仪，测定峰面积。
结果表明，雷公藤甲素进样量在0.02096~0.2096μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程和相关系数：A=1586.937C+2.495342,r=0.999951（C为雷公藤甲素进样量，单位μg,A为峰面积）.2.2.2精密度试验取同一份雷公藤甲素对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积，结果RSD为1.32%2.3稳定性试验取同一批样品，在配制后0、4、8、16、24h进样10μl,按1.4项的色谱条件下测定雷公藤甲素峰面积。
以峰面积计算，RSD=0.59%.表明供试品在24h内稳定性良好。
2.2.4重复性试验取同一批样品，精密量取50ml,共6份，精密称定，按1.4项的色谱条件下进行分析，结果6性。
1.4平33.1测定方法能很好的分离海棠合剂中雷公藤甲素并能得到较好的色谱峰形，运用上述含量控制方法，考察了4批市售的海棠合剂，其中的雷公藤甲素含量每500ml在0.15~0.17mg间。
HPLC法测定彝药火把花根中雷公藤甲素的含量火把花根又名昆明山海棠[Tripterygium hypoglaucum（Levl.）Hutch.]是卫矛科（Celastraceae）雷公藤属[Tripterygium Wilfodii（Hook.）f.]落叶披散或蔓状灌木植物，又名雷公藤、断肠草、紫金皮、掉毛草、六方藤等。
生长于向阳山坡、路边或灌木丛中，通常作为药用的部位为根和皮，昆明山海棠为中国特有的植物，民间药用中草药。
主要分布于我国的西南地区，云南省境内尤为多见，主要集中分布于昆明、楚雄、红河、玉溪等地。
火把花根彝语为“一姑妹班”、“多争唯”意译为“开花像火把样通红的植物。
在西南地区彝族药用历史悠久。
主要用于治疗慢性肾炎、类风湿性关节炎、红斑狼疮等。
火把花一名始载于《本草纲目》，李时珍集解曰：“生滇南者花红，呼为火把花。
[1]昆明山海棠有效成分研究多有报道，但是其含量测定研究少见。
火把花根药材收载于《云南省药品标准》（1974年）、《云南省中药材标准》第二册?彝族药（2005年）。
现行《中国药典》收载的昆明山海棠片以重量法进行含量测定，且测定方法相对简单，检验灵敏度、重现性还有待提高[2]。
上述标准中均无火把花根药材的含量测定项目，有必要对此项目进行研究。
火把花的化学成分较为复杂，长期研究发现火把花中含有生物碱类雷公藤碱（wilfordie）、雷公藤次碱（wilfori）、雷公藤甲素（Triphonide）等，其中最主要的活性成分为雷公藤甲素。
[3]雷公藤甲素为环氧二萜类内脂化合物，其药理作用为：抗排斥作用、抗肿瘤作用、抗生育作用等。
[4]雷公藤甲素有较强的抗肿瘤活性，并具有广谱、高效等特点，可以用于类风湿性关节炎、强直性关节炎等多种自身免疫疾病和炎性疾病的治疗。
[5]目前，对于火把花根中的雷公藤甲素的含量测定方法已经有文献报道，但是由于研究的方法不够完善和统一，得出的结果差异性较大。
因此，本次研究在现有的火把花根中雷公藤甲素的含量测定的基础上，运用HPLC色谱法，对火把花根药材进行了一系列的试验，建立了一个对火把花根中雷公藤甲素进行含量测定的方法，为以后科学评价和有效控制雷公藤药材的质量提供了可靠的科学依据。
超高效液相色谱串联质谱同时测定雷公藤药材中5个有效成分该文建立了超高效液相色谱电喷雾串联三重四级杆质谱同时测定雷公藤药材中5种有效成分的方法，并比较了不同产地及来源的雷公藤药材中5种有效成分的含量差别。
以乙腈2%甲酸铵水为流动相洗脱，Waters ACQUITY UPLCCSHC18S柱（21 mm×100 mm，17 μm），以电喷雾离子源为接口，正离子模式扫描，质谱多反应监测（MRM）模式检测。
结果表明，5种有效成分在各自线性范围内线性关系良好（r>0997 8），加样回收率在9672%～1032%，RSD 为10%～24%。
该研究所建立的方法稳定性、精密度、重复性良好，适用于雷公藤中有效成分的含量测定；不同来源的雷公藤药材中成分含量差异显著，雷公藤药材的质量和安全性亟待提高，而对雷公藤药材实施多指标的含量控制是保证其临床药用安全可控的必要途径。
标签：超高效液相色谱电喷雾串联三重四级杆质谱；雷公藤；昆明山海棠；有效成分；含量测定[Abstracts]This paper is aimed to develop a method for the determination of five effective components in medicinal material of Tripterygium using ultra performance liquid chromalography coupled withelectrospray ionization tandem mass spectrometry（UPLCESIMS/MS），which then was used to study their contents in raw materials from different areas and different sourcesThe separation was performed on a Waters ACQUITY UPLCCSHC18S column（21 mm×100 mm，17 μm），usingacetonitrile02% ammonium formateaqueous solutionas mobile phase The target components were detected in multiplereactionmonitoring（MRM）mode by mass spectrometry with electrospray ionization （ESI）source operated in positive ionization mode The quantitative results showed that good linearity wasachievedin their respective linear ranges and fine determination coefficient （r>0997 8），and the overall recoveries ranged from 9672%1032% with the RSD ranging from 10%24%The methodissensitive and accurate，and suitable for the effective components quantification in medicinal material of Tripterygium；contents of five effective components from different sources vary significantly，so the quality and safety of medicinal material of Tripterygium needs to be improved It is very important to control the quality with multiindex for clinic safety[Key words]UPLCESIMS/MS；Tripterygium wilfordii；Tripterygium hypoglaucum；effective components；content determinationdoi：10.4268/cjcmm20160817雷公藤属植物是重要的药用植物，民间多做杀虫剂使用，20世纪60年代因试用其治疗麻风反应效果显著，引起广泛关注，并相继开展了系统的研究，发现其有强大的抗炎、免疫抑制、抗肿瘤、抗生育等多种药理作用，目前被广泛在应用于难治的类风湿关节炎、肾病综合症、红斑狼疮、皮肌炎、大疱性皮肤病等，同样对各型银屑病也有显著的疗效[13]。
雷公藤甲素的含量检测分析雷公藤甲素的含量检测分析海棠合剂由雷公藤、竹茹、佛手、莱菔子、赤芍五种药味加工而成，具有清热解毒、祛风除湿、杀虫止痒的功效，适用于银屑病、湿疹、红斑狼疮等疾病[1].雷公藤为方中的君药，系卫矛科植物11.1AE-240Millipore1.21.3色谱条件色谱柱：DiamonsilC18色谱柱（250mm×4.6mm,5μm）;流动相：乙腈-水，梯度洗脱（0~20分钟，20%A→50%A;20~21分钟，50%A→20%A）,流速：1.0mL/min;进样量10μl;紫外检测波长220nm;柱温35℃;理论板数按雷公藤甲素峰计算，应不低于10000.1.4对照品溶液的制备精密称取雷公藤甲素对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.2mg对照品溶液。
1.5供试品溶液的制备根据相关报道[8-10],本实验采用，精密量取海棠合剂50ml,加中性氧化铝15g,水浴蒸干并混合均匀，用三氯甲烷作溶剂，湿法装入已有15g中性氧化铝层析柱中，再用三氯甲烷200ml洗脱，1.622.12.26μl、8μl、10μl及3号1μl、5μl注入液相色谱仪，测定峰面积。
结果表明，雷公藤甲素进样量在0.02096~0.2096μg范围内与峰面积呈良好的线性关系，回归方程和相关系数：A=1586.937C+2.495342,r=0.999951（C为雷公藤甲素进样量，单位μg,A为峰面积）.2.2.2精密度试验取同一份雷公藤甲素对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积，结果RSD为1.32%2.3稳定性试验取同一批样品，在配制后0、4、8、16、24h进样10μl,按1.4项的色谱条件下测定雷公藤甲素峰面积。
以峰面积计算，RSD=0.59%.表明供试品在24h内稳定性良好。
2.2.4重复性试验取同一批样品，精密量取50ml,共6份，精密称定，按1.4项的色谱条件下进行分析，结果6性。
1.4平33.1测定方法能很好的分离海棠合剂中雷公藤甲素并能得到较好的色谱峰形，运用上述含量控制方法，考察了4批市售的海棠合剂，其中的雷公藤甲素含量每500ml在0.15~0.17mg间。
雷公藤和昆明山海棠化学成分相似性分析黄耀峰,沈雪松,顾生玖,朱开梅,李芳耀 (桂林医学院,广西桂林541004)摘要 [目的]研究雷公藤和昆明山海棠化学成分的相似性。
[方法]采用乙醚、氯仿和乙酸乙酯等有机溶剂对雷公藤和昆明山海棠植物根茎进行顺序热提取。
其提取液经浓缩后对相对应部位进行薄层层析检查、化学成分的预测和熔点的测定来判别2种植物的差异。
[结果]结果表明,2种植物含有很多相似的化学成分。
其薄层层析法的检查结果可作为雷公藤和昆明山海棠植物的生药鉴定,以及判断质量的指标。
[结论]该研究结果对进一步分离、提纯雷公藤及昆明山海棠所含的化学成分及研究各化学成分的结构有一定的参考作用。
关键词 雷公藤;昆明山海棠;化学成分鉴别;薄层层析法中图分类号 S661.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2009)13-05961-03A nalysis on Similarity of Chemical Compositions of betw een T ripterygium wilfordii H ook.f.and T ripterygium hypoglaucum (L évl.)H utchinsHUANG Yao 2feng et al (G uilin M edical University ,G uilin ,G uangxi 541004)Abstract [Objective]T he purpose of this research was to study the sim ilarity of chem ical com position of T ripterygium wilfordii H ook.f.and T riptery 2gium hypoglaucum (L évl.)Hutchins.[M eth od]T he chloroform ,ethyl acetate and other organic s olvents were used for root extraction under heat sequence in this essay.A fter concerntration of the extract ,T LC exam ination ,prediction of chem ical com position and m elting point determ ination were applied for judgem ent between the tw o plants ’differences.[Result ]T he results sh owed that the tw o species contained a lot of sim ilar chem ical com position.T he ex 2perim ental results of T LC exam ination could be regarded as pharm acogn ostic identification ,quality standard of tripterygium and THH.[C onclusion]T his research w ill give s om e references in the further separation ,purification ,com positions and chem ical structure study of T ripterygium wilfordii H ook.f.and T ripterygium hypoglaucum (L évl.)Hutchins.K ey w ords T ripterygium wilfordii H ook.f.;T ripterygium hypoglaucum (L évl.)Hutchins ;Identification of chem ical com position ;T hin layer chrom atog 2raphy基金项目 广西教育厅课题(200809MS179)。
作者简介 黄耀峰(1954-),男,广西百色人,副教授,从事天然药物的研究。
收稿日期 2009202216 雷公藤[T riptergium wilfordii H ook.f.]和昆明山海棠[T.hypoglaucum (Levi.)Hutchins.]属于卫茅科、雷公藤属植物,在植物分类学上定为2个品种[1]。
其药用部位为根,临床作用有:清热解毒、活血化瘀、祛风通络和消坚消肿,原是民间治疗“风湿”的草药。
据文献报道,雷公藤根中含有生物碱、卫茅醇、二萜内酯和三萜类化合物等[2]。
从昆明山海棠中可以测得生物碱、萜甾类、卫茅醇、鞣质、不饱和化合物、醛酮化合物、酚类和糖类等,两者从植物的种源、临床的用途以及副作用等方面有许多相似点[3-9]。
针对雷公藤和昆明山海棠植物在临床疗效上具有相似性的特性,笔者采用乙醚、氯仿和乙酸乙酯等有机溶剂对雷公藤和昆明山海棠植物根茎进行顺序热提取,其提取液经浓缩后对相对应部位进行薄层层析检查、化学成分的预测和熔点的测定来判别两种植物的差异,为雷公藤及昆明山海棠在临床上的合理应用提供科学依据。
1 材料与方法1.1 材料 雷公藤根由桂林市药材站提供,昆明山海棠根由桂林市药检所提供。
2种药品均按照文献方法做生药学鉴定。
乙醚为广州化学试剂二厂生产,批号081014;氯仿由上海试剂一厂生产,规格G B 2682265,批号081216;乙酸乙酯由上海试剂一厂生产,批号080916。
高速粉碎机:上海中药机械厂,型号SF 21703;烘箱:上海市实验仪器厂,型号10122型;干燥器:上海玻璃仪器一厂生产。
1.2 方法1.2.1 薄层层析板的制备。
取E.meick 硅胶27.5g ,加0.5%(W/V )羧甲基纤维素钠的上清液80m l ,充分拌匀,加数滴乙醇,倒入清洁的2块3mm 厚的玻璃中间,另取一块边缘光滑的玻片,从一端刮向另一端而成,室温空气干燥后,置105℃烘箱活化30m in ,然后放入干燥器中备用。
1.2.2 试验样品的制备。
取雷公藤根粉(或昆明山海棠根粉)分别置于连续提取器中,顺次以乙醚、氯仿、乙酸乙酯连续提取,每种溶剂在更换之前,使提取液呈无色透明为止。
提取液过滤浓缩,浸膏干燥除去溶剂,分别得到相应的乙醚、氯仿、乙酸乙酯等3个提取部分,供分离、鉴别。
2 结果与分析2.1 乙醚提取液的薄层对照 雷公藤根(或昆明山海棠根)粉经乙醚连续提取后,乙醚液过滤,浓缩至浆状物,分别称取0.1g 加入乙醚至10m l ,用血色素管点样30μl ,薄层对照,点好样的薄层板①置于盛有石油醚∶乙酸乙酯=8∶2的展开缸内饱和1h ,然后展开,展距14cm ,展毕除去展开剂,于紫外灯下观察萤光(图1)。
由图1可知,采用乙醚提取液,石油醚和乙酸乙酯为展开剂的薄层对照,雷公藤有8个斑点,昆明山海棠有10个斑点,表明雷公藤从1～8的斑点与昆明山海棠的1～8斑点相同,这说明含有相同的化学成分。
②置于盛有环己烷∶乙酸乙酯∶冰醋酸=20.0∶2.5∶0.7的展开缸内直接展开,展距14cm ,展毕除去展开剂后于紫外灯下观察萤光,(图2)。
由图2可知,采用乙醚为提取液,环己烷、乙酸乙酯及冰醋酸为展开剂的薄层对照,雷公藤及昆明山海棠均有11个斑点,说明化学成分相同。
2.2 氯仿提取液的薄层对照 雷公藤根(或昆明山海棠根)经乙醚提取后的根粉继续用氯仿连续提取,提取液过滤,浓缩呈浆状物,分别称取0.1g 加入氯仿至10m l ,用血色素管点样20μl ,薄层对照,点好样的薄层板①置于盛石油醚∶乙酸乙酯=8∶2的展开缸内饱和1h ,然后展开,展距14cm ,展毕除去展开剂后于紫外灯光下观察萤光(图3)。
由图3可知,采用氯仿提取液,石油醚和乙酸乙酯为展开剂的薄层对照,雷公藤含有8个斑点,昆明山海棠含有6个斑点,表明雷公藤1～6的斑点与昆明山海棠1～6的斑点相同,这说明含化学安徽农业科学,Journal of Anhui Agri.Sci.2009,37(13):5961-5963 责任编辑 李玮 责任校对 况玲玲成分相同。
②置于盛环己烷∶乙酸乙酯∶冰醋酸=20.0∶2.5∶0.7的展开缸内直接展开,展距14cm ,展毕除去展开剂后于紫外灯下观察萤光(图4)。
由图4可知,采用氯仿为提取液,环己烷、乙酸乙酯及冰醋酸为展开剂的薄层对照,雷公藤和昆明山海棠均含有8个斑点,说明化学成分相同。
氯仿浓缩的浆状物加入石油醚(60～90℃),反复洗涤分得石油醚部分和不溶的黄色固体物。
黄色固体物的熔点为92～112℃。
对三氯化铁、铁氰化钾、重氮化试剂、42氨基安替匹林-铁氰化钾,酸酐-浓硫酸,氯仿-浓硫酸呈阳性反应,表明雷公藤根(昆明山海棠根)内含酚性化合物和萜甾类。
图1 雷公藤和昆明山海棠乙醚提取液的薄层对照(展开剂∶石油醚和乙酸乙酯)Fig.1 The thin layer chrom atography comp arison o f aether extractfrom T ripterygium wilfordii and T ripterygium hypoglaucum hutch(developer :petroleum ether and ethylacetate)图2 雷公藤和昆明山海棠乙醚提取液的薄层对照(展开剂∶环己烷、乙酸乙酯及冰醋酸)Fig.2 The thin layer chrom atography comp arison o f aether extractfrom T.wilfordii and T.hypoglaucum (developer :cyclohex 2ane ,ethyl acetate and glacial acetic acid)2.3 乙酸乙酯提取液的薄层鉴别和薄层对照 雷公藤根图3 雷公藤和昆明山海棠氯仿提取液的薄层对照(展开剂∶石油醚和乙酸乙酯)Fig.3 The thin layer chrom atography comp arison o f ch loro form ex 2tract from T.wilfordii and T.hypoglaucum (developer :petroleum ether and ethylacetate)图4 雷公藤和昆明山海棠氯仿提取液的薄层对照(展开剂∶环己烷、乙酸乙酯及冰醋酸)Fig.4 The thin layer chrom atography comp arison o f ch loro form ex 2tract from T.wilfordii and T.hypoglaucum (developer :cy 2clohexane ,ethyl acetate and glacial acetic acid)(或昆明山海棠根)经乙醚、氯仿连续提取后,继以乙酸乙酯连续提取,过滤浓缩至小体积,放置析出沉淀物,过滤,滤饼洗涤干燥得(A )样品,母液连续浓缩至干呈浆状物,加入乙醚可得乙醚可溶部分(B )和乙醚不溶部分(C )。
