双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作用研究中的应用进展.doc

双分子荧光互补试验研究水稻NH1家族蛋白之间相互作用白薇;孙海莲;Mawsheng Chern;Randy Ruan;Pam Ronald;樊明寿【摘要】NPR1 (Non-expresser of pathogenesis related genes 1 ) is the master regulator of salicylic acid-mediated systemic acquired resistance. Over-expression of Arabidopsis NPR1 and rice NH1 (NPR1homologl )/OsNPR1 in rice results in enhanced resistance. There are four rice NPR1-paralogs in the rice genome,they are family members of NH1. Protein-protein interaction between members of NH1 family were studied in vivo by bimolecular fluorescence eomplementation assay( BiFC ,or split YFP). NH1, NH3, NH4, and NH5 all can interact with itself to generate fluorescence signals. They can also interact with other members in the family. But NH2 has no interaction with anyone.%NPR1(Non-expresser of pathogenesis related genes 1)是水杨酸(Salicilic acid,SA)介导的系统获得抗性(Systemic aquired resistance,SAR)的关键调控因子,在水稻中过量表达拟南芥NPR1和水稻NH1/OsNPR1(NPR1 homo1ogue 1)(NPR1的同源物)可增强抗病性.水稻基因组中还有4个NPR1旁系同源物(Paralog),为NH1的家族蛋白.本试验利用双分子荧光互补技术(Bimolecular Fluorescence Complementation,BiFC,or split YFP)研究了水稻NH1家族蛋白之间在活体内的相互作用,发现除NH2外,NH1、NH3、NH4和NH5都会和自身的蛋白互作,产生荧光信号,并且它们还会和家族成员的其他蛋白相互结合产生荧光信号.【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2011(026)002【总页数】5页(P30-34)【关键词】水稻;NH1家族蛋白;双分子荧光互补试验;蛋白互作【作者】白薇;孙海莲;Mawsheng Chern;Randy Ruan;Pam Ronald;樊明寿【作者单位】内蒙古农业大学生命科学学院,内蒙古呼和浩特010018;中国科学院内蒙古草业研究中心,内蒙古呼和浩特010031;Department of Plant Pathology,University of California,Davis,CA,A;Department of Plant Pathology,University of California,Davis,CA,A;Department of Plant Pathology,University of California,Davis,CA,A;内蒙古农业大学农学院,内蒙古呼和浩特010018【正文语种】中文【中图分类】S511自然界中，植物在其生命周期的绝大部分时间里都暴露在微生物中，植物在进化过程中发展出很多策略来对付微生物的侵染。

双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作用研究中的应用进展双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作用研究中的应用进展【摘要】双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）是指两个不发光的荧光蛋白互补片段在与其融合的蛋白质的相互作用驱动下重新组装形成荧光复合物，恢复荧光特性。

基于双分子荧光互补原理的相关技术在多种不同类型的蛋白质相互作用研究中得到越来越广泛的应用。

我们对双分子荧光互补技术的原理、特性、应用现状、面临的问题及应用前景进行了概述。

【关键词】双分子荧光互补（BiFC）；互补片段；荧光复合物；蛋白质相互作用AbstractBimolecular fluorescence complementation BiFC means two non-fluorescent complementary fragments of fluorescent protein can reassemble to form fluorescent complex and restore fluorescence when they are fused to two proteins that interact with each other. BiFC analysis has been used to study interactions among a wide range of proteins in many cell types. In this paper, the principle and characteristics of BiFC，the application advances, the limitation and future prospects of BiFC assays are described. Key wordsBimolecular fluorescence complementationBiFC；Complementary fragments；Fluorescent complex；Protein-protein interactions 1 引言蛋白质相互作用和翻译后修饰的研究使人们对生物调控机制的认识取得了巨大的进展，蛋白质相互作用的研究方法也备受重视，出现了许多具有不同原理和应用特点的相关技术和方法［1-2］。

双分子荧光互补技术在蛋白质相互作用研究中的应用双分子荧光互补技术（BiFC）是基于两个不发光的荧光蛋白互补片段在借助其融合蛋白的驱动下重新形成活性荧光蛋白，直接作为报告基因的可视化关键性技术，在探究各种模式生物体内蛋白质与蛋白质间相互作用（PPI）技术中日益受到重视。

本文对BiFC技术原理、发展过程、应用现状、技术改进、及未来展望进行概述。

细胞内蛋白质通常需要与其他蛋白质或配体结合，形成瞬时或稳定的复合体来实现其特定的功能，这种蛋白质与蛋白质之间的相互作用（protein-protein interaction，PPI）在人类、酵母、植物、线虫等各种生物体的生命活动中起着十分重要的作用[1-4]。

目前，PPI研究技术发展迅速，常用的有免疫共沉淀、GST-pull down、表面等离子共振（SPR）、蛋白质芯片等体外实验技术，以及酵母双杂交、蛋白质片段互补（PCA）、荧光共振能量转移（FRET）技术等。

近十余年兴起的双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）技术由于无需试剂检测，能够通过荧光显微镜在接近活细胞生理状态的条件下快速、直观地检测目标蛋白是否具有相互作用，在PPI研究中的应用正日益广泛。

1 BiFC技术的原理Regan（2000）和Kerppola（2002）两个研究小组最早发现和验证了活细胞内BiFC 现象。

他们首先将1个GFP的突变子增强型黄色荧光蛋白（EYFP）从不同位点切开，然后将一组相互作用、同向平行的亮氨酸拉链（bFos和bJun）分别融合到从Ala154-Asp155之间切开的增强型黄色荧光蛋白（EYFP）氨基（N）片段和羧基（C）片段，导入大肠杆菌中共表达。

结果发现，所构建的一对融合多肽能够在细菌细胞中产生YFP的荧光，他们将这个现象称之为BiFC[5-6]。

除EYFP外，目前BiFC技术涉及的荧光蛋白已扩展到绿色荧光蛋白（GFP）、青色荧光蛋白（CFP）、红色荧光蛋白（RFP）及其突变体等多种荧光蛋白，其原理都是将荧光蛋白在特定的位点切开，形成不发荧光的N和C端2个多肽，称为N 片段（N-fragment）和C片段（C-fragment）。

双分⼦荧光互补技术及其在蛋⽩质相互作⽤研究中的应⽤双分⼦荧光互补技术及其在蛋⽩质相互作⽤研究中的应⽤摘要双分⼦荧光互补技术是近年发展起来的⽤于体或体外检测蛋⽩质相互作⽤的⼀项新技术。

该技术是将荧光蛋⽩在合适的位点切开形成不发荧光的2个⽚段，这2个⽚段借助融合于其上的⽬标蛋⽩的相互作⽤，彼此靠近，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋⽩分⼦，从⽽产⽣荧光。

BiFC⽅法简单直观，具有可视性的特点，对温度敏感，荧光⽚段种类较多，被⼴泛地应⽤到不同的细胞中，既可以检测蛋⽩之间的相互作⽤，也可以定位蛋⽩质相互作⽤的位点。

此外，BiFC还能在蛋⽩构型的确定以及RNA 的检测⽅⾯发挥作⽤。

经过若⼲年的发展，双⾊荧光互补技术已经发展成包括多⾊荧光互补技术，BiFC和FRET联⽤技术以及BiFC和YTH联⽤技术在的多种技术，拓宽了BiFC的应⽤。

关键词：双分⼦荧光互补技术；蛋⽩质⽚段互补；荧光蛋⽩；蛋⽩质相互作⽤蛋⽩质之间的相互作⽤(Protein-protein interactions，PPIs)形成了细胞中的调节⽹络，⽤来调控细胞的许多功能。

因此，研究蛋⽩之间的相互作⽤对于深⼊了解许多⽣命过程具有⾮常重要的意义。

迄今为⽌，已经建⽴了多种技术和⽅法⽤于研究蛋⽩与蛋⽩之间的相互作⽤，如酵母双杂交技术(Yeast two-hybrid, YTH)，荧光共振能量迁移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)和蛋⽩⽚段互补技术(Protein fragment complementations, PFCs)等⽅法(表1)。

在蛋⽩⽚段互补技术中，双分⼦荧光互补技术(Bimolecular fluorescence complementation, BiFC)由于观察直观，检测⽅便以及能实现在活细胞中对相互作⽤蛋⽩可视化等诸多优点，⾃从其被开发出来后，便得到了⼴泛地应⽤。

1 双分⼦荧光互补技术的提出及理论依据BiFC技术本质上是⼀种蛋⽩质⽚段互补技术，是指将荧光蛋⽩多肽链在某些不保守的氨基酸处切开，形成不发荧光的N-和C-末端2个多肽⽚段。

双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作用研究中的应用双分子荧光互补技术（BiFC）是一种基于荧光蛋白质碎片重组互补的方法，用于研究蛋白质的相互作用。

该技术可以在活细胞中直接观察和定位蛋白质相互作用的动态过程，因此在细胞信号转导、蛋白质复合物形成和细胞功能调控等领域具有广泛的应用价值。

本文将重点介绍双分子荧光互补技术的原理和在蛋白质相互作用研究中的应用。

双分子荧光互补技术基于荧光蛋白质的碎片重组互补原理。

荧光蛋白质（如绿色荧光蛋白，GFP）通常由一个N端荧光蛋白质片段（GFP-N）和一个C端片段（GFP-C）组成。

当两个蛋白质相互作用时，将GFP-N和GFP-C的片段连接到它们的互作结构域上，形成一个重组的荧光蛋白质。

当这两个蛋白质相互作用时，它们的互作结构域靠近，使得GFP-N和GFP-C的片段重新组装成完整的荧光蛋白质，从而产生绿色荧光信号。

通过观察和定位这种荧光信号，可以确定蛋白质相互作用的位置和强度。

双分子荧光互补技术在蛋白质相互作用研究中的应用非常广泛。

首先，它可以用于筛选蛋白质相互作用伙伴。

通过将GFP-N和GFP-C片段连接到待筛选蛋白质的互作结构域上，当这些蛋白质与其他互作蛋白质相互作用时，GFP-N和GFP-C片段的重组组装将产生荧光信号，从而可以通过荧光显微镜观察和筛选具有相互作用的蛋白质。

其次，双分子荧光互补技术可以用于研究蛋白质相互作用的动态过程。

通过实时监测荧光信号的变化，可以观察蛋白质相互作用的时空特征。

例如，可以研究蛋白质相互作用的起始时间、持续时间和动态变化。

通过该技术可以深入了解蛋白质相互作用的相关机制和调控过程。

另外，双分子荧光互补技术还可以用于研究蛋白质复合物的组成和稳定性。

通过将荧光蛋白质片段与复合物中的不同亚基连接，可以确定复合物的组成，并通过观察荧光信号的强度和稳定性来评估复合物的稳定性。

需要注意的是，双分子荧光互补技术虽然在活细胞中可以直接观察蛋白质相互作用的动态过程，但其分辨率较低，无法提供高分辨的空间信息。

双分子荧光互补开放分类：生物技术科学编辑词条分享• 1 BiFC技术原理• 2 BiFC技术缘起• 3 BiFC技术研究进展• 4 BiFC技术的优缺点• 5 BiFC技术的应用将荧光蛋白在某些特定的位点切开，形成不发荧光的N和C端2个多肽，称为N片段(N-fragment)和C片段(C-fragment)。

这2个片段在细胞内共表达或体外混合时，不能自发地组装成完整的荧光蛋白，在该荧光蛋白的激发光激发时不能产生荧光。

但是，当这2个荧光蛋白的片段分别连接到1组有相互作用的目标蛋白上，在细胞内共表达或体外混合这2个融合蛋白时，由于目标蛋白质的相互作用，荧光蛋白的2个片段在空间上互相靠近互补，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，并在该荧光蛋白的激发光激发下，发射荧光。

简言之，如果目标蛋白质之间有相互作用，则在激发光的激发下，产生该荧光蛋白的荧光。

反之，若蛋白质之间没有相互作用，则不能被激发产生荧光。

蛋白质片段互补技术蛋白质片段互补BiFC起源于蛋白质片段互补技术。

所谓蛋白质片段互补技术(protein fragment complementation)是将某个功能蛋白切成2段，分别与另外2种目标蛋白相连，形成2个融合蛋白。

在1个反应体系中，2个目标蛋白的相互作用使得2个功能蛋白质片段靠近、互补，并重建功能蛋白质的活性，通过检测功能蛋白质的活性来判断目标蛋白质的相互作用。

已经尝试用于该目的的功能蛋白包括泛素蛋白(ubiquitin)，β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)，二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase)，β-内酰胺酶(β-lactamase)，以及几种荧光素酶，如萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)，海肾萤光素酶(renilla luciferase)，甲虫荧光素酶(beetle luciferase)和长腹水蚤荧光素酶(gaussia luciferase)。

双分子荧光互补技术（BiFC）一、技术简介BiFC是由Hu 等在2002 年最先报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术[1]. 有报道在GFP 的两个β片层之间的环结构（loop）上有许多特异位点可以插入外源蛋白而不影响GFP的荧光活性，BiFC技术正是利用该荧光蛋白家族的这一特性，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接。

如果两个目标蛋白因为有相互作用而接近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基因而发出荧光。

在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白复合物的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等，这些信息对研究蛋白质相互作用有重要意义。

其后发展出的多色荧光互补技(multicolor BiFC)，不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较.这项技术不需要特殊的设备，相互作用的蛋白也不需要特别的理论配比。

因此，BiFC 技术已被国际上众多实验室采用，在活细胞内证明蛋白质的相互作用。

本实验室成功应用该技术研究转录因子c-Jun、ATF2和c-Fos在原代神经元中的竞争性相互作用[2]。

BiFC技术以下几个特点使其对于研究蛋白质相互作用具有独特的优势：1、能在显微镜下直接观察到蛋白相互作用而且不依赖于其它次级效应；2、该相互作用可以在活细胞中进行观察，排除了由于细胞裂解或固定可能带来的假阳性结果；3、蛋白质在近似生理条件的环境下表达，表达水平及特性如翻译后修饰极大地接近于内源蛋白；4、不需要蛋白质有特别的理论配比，能检测到不同亚群蛋白质间的相互作用；5、多色BiFC技术不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较；6、BiFC技术除了荧光倒置显微镜外，不要求特殊的设备。