双分子荧光互补技术(BiFC)

双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作用研究中的应用进展双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作用研究中的应用进展【摘要】双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）是指两个不发光的荧光蛋白互补片段在与其融合的蛋白质的相互作用驱动下重新组装形成荧光复合物，恢复荧光特性。

基于双分子荧光互补原理的相关技术在多种不同类型的蛋白质相互作用研究中得到越来越广泛的应用。

我们对双分子荧光互补技术的原理、特性、应用现状、面临的问题及应用前景进行了概述。

【关键词】双分子荧光互补（BiFC）；互补片段；荧光复合物；蛋白质相互作用AbstractBimolecular fluorescence complementation BiFC means two non-fluorescent complementary fragments of fluorescent protein can reassemble to form fluorescent complex and restore fluorescence when they are fused to two proteins that interact with each other. BiFC analysis has been used to study interactions among a wide range of proteins in many cell types. In this paper, the principle and characteristics of BiFC，the application advances, the limitation and future prospects of BiFC assays are described. Key wordsBimolecular fluorescence complementationBiFC；Complementary fragments；Fluorescent complex；Protein-protein interactions 1 引言蛋白质相互作用和翻译后修饰的研究使人们对生物调控机制的认识取得了巨大的进展，蛋白质相互作用的研究方法也备受重视，出现了许多具有不同原理和应用特点的相关技术和方法［1-2］。

双分子荧光互补技术-回复什么是双分子荧光互补技术？双分子荧光互补技术是一种用于研究生物体系中分子间相互作用的方法。

该技术基于两种分子相互作用引发的荧光信号互补，通过分析这些信号，可以了解分子间的相互作用方式、强度和动力学等关键信息。

双分子荧光互补技术已经被广泛应用于生物学、生物化学和药物研发等领域，为科学家们提供了一种强大的工具来研究生物分子的相互作用。

步骤一：选择适当的荧光标记物在使用双分子荧光互补技术之前，首先需要选择适当的荧光标记物。

荧光标记物通常是具有特定荧光发射光谱的物质，可以被激发并发出荧光。

在选择荧光标记物时，需要考虑其荧光特性、稳定性和细胞渗透性等因素。

步骤二：设计互补配对在进行双分子荧光互补实验之前，需要设计互补配对。

互补配对是指两种不同的分子，在特定条件下相互作用，从而引发荧光信号互补。

配对可以基于分子结构、性质或功能等进行设计。

步骤三：构建互补融合蛋白为了实现互补配对，需要构建互补融合蛋白。

互补融合蛋白是通过蛋白工程技术将两种不同的蛋白融合在一起而产生的蛋白。

融合蛋白的结构和功能可以根据需要进行调整，以实现双分子之间的相互作用和信号互补。

步骤四：表达和纯化互补融合蛋白在构建互补融合蛋白之后，需要进行表达和纯化的步骤。

表达是指将蛋白基因导入到适当的表达系统中，使其产生蛋白。

纯化是指将目标蛋白从其他杂质分离出来，以获得纯净的蛋白样品。

这些步骤需要使用合适的基因表达系统和蛋白纯化技术。

步骤五：进行双分子荧光互补实验在获得纯净的互补融合蛋白后，可以进行双分子荧光互补实验。

该实验通常通过激发一个标记物，并检测两个标记物之间的荧光互补信号来分析分子间的相互作用。

这可以通过荧光显微镜、光谱分析和图像处理等技术来实现。

步骤六：数据分析和解释数据分析是双分子荧光互补实验的一个重要步骤。

通过分析实验结果，可以获得有关分子间相互作用的信息，如结合亲和力、动力学参数和空间分布等。

这些数据可以进一步用于验证理论模型、优化药物设计和解析复杂生物过程等。

双分子荧光互补技术
双分子荧光互补技术的原理是基于蛋白质相互作用导致两个部
分的结合，从而激活荧光。

这种技术的优势在于可以实时监测蛋白
质相互作用的动态过程，而且不需要对样品进行破坏性处理。

因此，它在生物医学研究领域中得到了广泛的应用。

在实际应用中，双分子荧光互补技术可以用于研究细胞内蛋白
质的相互作用，例如信号转导途径中的蛋白质相互作用、药物靶点
的筛选和鉴定等。

此外，它还可以用于研究蛋白质在生物体内的定
位和交互情况，有助于深入理解生物学过程和疾病发生机制。

需要注意的是，双分子荧光互补技术也存在一些局限性，例如
对标记蛋白质的选择和标记位置的影响、背景荧光的干扰等。

因此，在使用该技术时需要综合考虑实验条件和样品特性，以确保获得准
确可靠的实验结果。

总的来说，双分子荧光互补技术是一种重要的生物化学技术，
对于研究蛋白质相互作用和生物学过程具有重要意义，同时也需要
在实际应用中注意技术的局限性和优化条件，以取得可靠的研究结果。

双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作用研究中的应用进展双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作用研究中的应用进展【摘要】双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）是指两个不发光的荧光蛋白互补片段在与其融合的蛋白质的相互作用驱动下重新组装形成荧光复合物，恢复荧光特性。

基于双分子荧光互补原理的相关技术在多种不同类型的蛋白质相互作用研究中得到越来越广泛的应用。

我们对双分子荧光互补技术的原理、特性、应用现状、面临的问题及应用前景进行了概述。

【关键词】双分子荧光互补（BiFC）；互补片段；荧光复合物；蛋白质相互作用AbstractBimolecular fluorescence complementation BiFC means two non-fluorescent complementary fragments of fluorescent protein can reassemble to form fluorescent complex and restore fluorescence when they are fused to two proteins that interact with each other. BiFC analysis has been used to study interactions among a wide range of proteins in many cell types. In this paper, the principle and characteristics of BiFC，the application advances, the limitation and future prospects of BiFC assays are described. Key wordsBimolecular fluorescence complementationBiFC；Complementary fragments；Fluorescent complex；Protein-protein interactions 1 引言蛋白质相互作用和翻译后修饰的研究使人们对生物调控机制的认识取得了巨大的进展，蛋白质相互作用的研究方法也备受重视，出现了许多具有不同原理和应用特点的相关技术和方法［1-2］。

双分子荧光互补技术在蛋白质相互作用研究中的应用双分子荧光互补技术（BiFC）是基于两个不发光的荧光蛋白互补片段在借助其融合蛋白的驱动下重新形成活性荧光蛋白，直接作为报告基因的可视化关键性技术，在探究各种模式生物体内蛋白质与蛋白质间相互作用（PPI）技术中日益受到重视。

本文对BiFC技术原理、发展过程、应用现状、技术改进、及未来展望进行概述。

细胞内蛋白质通常需要与其他蛋白质或配体结合，形成瞬时或稳定的复合体来实现其特定的功能，这种蛋白质与蛋白质之间的相互作用（protein-protein interaction，PPI）在人类、酵母、植物、线虫等各种生物体的生命活动中起着十分重要的作用[1-4]。

目前，PPI研究技术发展迅速，常用的有免疫共沉淀、GST-pull down、表面等离子共振（SPR）、蛋白质芯片等体外实验技术，以及酵母双杂交、蛋白质片段互补（PCA）、荧光共振能量转移（FRET）技术等。

近十余年兴起的双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）技术由于无需试剂检测，能够通过荧光显微镜在接近活细胞生理状态的条件下快速、直观地检测目标蛋白是否具有相互作用，在PPI研究中的应用正日益广泛。

1 BiFC技术的原理Regan（2000）和Kerppola（2002）两个研究小组最早发现和验证了活细胞内BiFC 现象。

他们首先将1个GFP的突变子增强型黄色荧光蛋白（EYFP）从不同位点切开，然后将一组相互作用、同向平行的亮氨酸拉链（bFos和bJun）分别融合到从Ala154-Asp155之间切开的增强型黄色荧光蛋白（EYFP）氨基（N）片段和羧基（C）片段，导入大肠杆菌中共表达。

结果发现，所构建的一对融合多肽能够在细菌细胞中产生YFP的荧光，他们将这个现象称之为BiFC[5-6]。

除EYFP外，目前BiFC技术涉及的荧光蛋白已扩展到绿色荧光蛋白（GFP）、青色荧光蛋白（CFP）、红色荧光蛋白（RFP）及其突变体等多种荧光蛋白，其原理都是将荧光蛋白在特定的位点切开，形成不发荧光的N和C端2个多肽，称为N 片段（N-fragment）和C片段（C-fragment）。

双分子荧光互补开放分类：生物技术科学编辑词条分享• 1 BiFC技术原理• 2 BiFC技术缘起• 3 BiFC技术研究进展• 4 BiFC技术的优缺点• 5 BiFC技术的应用将荧光蛋白在某些特定的位点切开，形成不发荧光的N和C端2个多肽，称为N片段(N-fragment)和C片段(C-fragment)。

这2个片段在细胞内共表达或体外混合时，不能自发地组装成完整的荧光蛋白，在该荧光蛋白的激发光激发时不能产生荧光。

但是，当这2个荧光蛋白的片段分别连接到1组有相互作用的目标蛋白上，在细胞内共表达或体外混合这2个融合蛋白时，由于目标蛋白质的相互作用，荧光蛋白的2个片段在空间上互相靠近互补，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，并在该荧光蛋白的激发光激发下，发射荧光。

简言之，如果目标蛋白质之间有相互作用，则在激发光的激发下，产生该荧光蛋白的荧光。

反之，若蛋白质之间没有相互作用，则不能被激发产生荧光。

蛋白质片段互补技术蛋白质片段互补BiFC起源于蛋白质片段互补技术。

所谓蛋白质片段互补技术(protein fragment complementation)是将某个功能蛋白切成2段，分别与另外2种目标蛋白相连，形成2个融合蛋白。

在1个反应体系中，2个目标蛋白的相互作用使得2个功能蛋白质片段靠近、互补，并重建功能蛋白质的活性，通过检测功能蛋白质的活性来判断目标蛋白质的相互作用。

已经尝试用于该目的的功能蛋白包括泛素蛋白(ubiquitin)，β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)，二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase)，β-内酰胺酶(β-lactamase)，以及几种荧光素酶，如萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)，海肾萤光素酶(renilla luciferase)，甲虫荧光素酶(beetle luciferase)和长腹水蚤荧光素酶(gaussia luciferase)。

一、技术简介BiFC是由Hu 等在2002 年最先报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术[1]. 有报道在GFP 的两个β片层之间的环结构（loop）上有许多特异位点可以插入外源蛋白而不影响GFP的荧光活性，BiFC技术正是利用该荧光蛋白家族的这一特性，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接。

如果两个目标蛋白因为有相互作用而接近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基因而发出荧光。

在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白复合物的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等，这些信息对研究蛋白质相互作用有重要意义。

其后发展出的多色荧光互补技(multicolor BiFC)，不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较.这项技术不需要特殊的设备，相互作用的蛋白也不需要特别的理论配比。

因此，BiFC 技术已被国际上众多实验室采用，在活细胞内证明蛋白质的相互作用。

BiFC技术以下几个特点使其对于研究蛋白质相互作用具有独特的优势：1、能在显微镜下直接观察到蛋白相互作用而且不依赖于其它次级效应；2、该相互作用可以在活细胞中进行观察，排除了由于细胞裂解或固定可能带来的假阳性结果；3、蛋白质在近似生理条件的环境下表达，表达水平及特性如翻译后修饰极大地接近于内源蛋白；4、不需要蛋白质有特别的理论配比，能检测到不同亚群蛋白质间的相互作用；5、多色BiFC技术不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较；6、BiFC技术除了荧光倒置显微镜外，不要求特殊的设备。

实验简单、快捷、直观，并适用于原核、真菌、植物、动物等多种组织、细胞. 该技术的完善与发展必然会为蛋白质组学、蛋白质相互作用连锁图的建立带来福音. 但是，该技术与大多检测蛋白质相互作用的技术一样，也存在着假阴性和假阳性的问题，需要在实验中仔细验证。

内部对照也是必要的，可以标准化转染效率和蛋白在不同细胞中表达的差异。

这个对照的完成是由，编码含目的蛋白的融合蛋白和完整的非片段蛋白（这个完整的蛋白里的荧光报告蛋白在不同的波长下发荧光）的质粒共转染细胞。

在可视化过程中，one（其中一个蛋白，融合或完整）来确定BiFC复合体的荧光强度，和在消除背景信号后内部对照变成一个比值。

这个比值代表了，BiFC效率，并可以与其他比值对比以确定其他形式的不同复合物的相对效率。

注意：细胞和质粒都是复数形式，意思是用多个相同质粒转染多个相同细胞，这样可以标准化转染效率！在其他文献上看到一个图，就不翻译了这个可能好懂很多。

见下页：Figure 4. Two key elements of a BiFC experiment: fusionorientation(融合方向) and controls. (A) Each of the two YFP halves (YFP N and YFP C) can be fused at either its N- or C-terminus, with the protein of interest. Likewise, the protein of interest can also be fused to the YFP half via its N- or C-terminus. This creates four possible YFP-protein combinations for each protein of interest and eight combinations that should be tested for each interaction pair; (B) In addition to the protein-protein interaction to be tested, (i) appropriate negative controls should be incorporated in a BiFC experiment; These negative controls include substitution for one of the protein of interest by (ii) a mutated protein (mP1); (iii) a related protein (PX) that does not interact; and (iv) an unrelated protein (PY) with the same subcellular localization. The stars indicate YFP fluorescence due to self-assembly (one star) and expression due to a bona fide（一概而论）interaction between the test proteins (three stars).上述Cited from A Cautionary Note on the Use of Split-YFP/BiFC in Plant Protein-Protein Interaction Studies。