双分子荧光互补技术(BiFC)(参考资料)

双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作用研究中的应用进展双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作用研究中的应用进展【摘要】双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）是指两个不发光的荧光蛋白互补片段在与其融合的蛋白质的相互作用驱动下重新组装形成荧光复合物，恢复荧光特性。

基于双分子荧光互补原理的相关技术在多种不同类型的蛋白质相互作用研究中得到越来越广泛的应用。

我们对双分子荧光互补技术的原理、特性、应用现状、面临的问题及应用前景进行了概述。

【关键词】双分子荧光互补（BiFC）；互补片段；荧光复合物；蛋白质相互作用AbstractBimolecular fluorescence complementation BiFC means two non-fluorescent complementary fragments of fluorescent protein can reassemble to form fluorescent complex and restore fluorescence when they are fused to two proteins that interact with each other. BiFC analysis has been used to study interactions among a wide range of proteins in many cell types. In this paper, the principle and characteristics of BiFC，the application advances, the limitation and future prospects of BiFC assays are described. Key wordsBimolecular fluorescence complementationBiFC；Complementary fragments；Fluorescent complex；Protein-protein interactions 1 引言蛋白质相互作用和翻译后修饰的研究使人们对生物调控机制的认识取得了巨大的进展，蛋白质相互作用的研究方法也备受重视，出现了许多具有不同原理和应用特点的相关技术和方法［1-2］。

双分子荧光互补技术-回复什么是双分子荧光互补技术？双分子荧光互补技术是一种用于研究生物体系中分子间相互作用的方法。

该技术基于两种分子相互作用引发的荧光信号互补，通过分析这些信号，可以了解分子间的相互作用方式、强度和动力学等关键信息。

双分子荧光互补技术已经被广泛应用于生物学、生物化学和药物研发等领域，为科学家们提供了一种强大的工具来研究生物分子的相互作用。

步骤一：选择适当的荧光标记物在使用双分子荧光互补技术之前，首先需要选择适当的荧光标记物。

荧光标记物通常是具有特定荧光发射光谱的物质，可以被激发并发出荧光。

在选择荧光标记物时，需要考虑其荧光特性、稳定性和细胞渗透性等因素。

步骤二：设计互补配对在进行双分子荧光互补实验之前，需要设计互补配对。

互补配对是指两种不同的分子，在特定条件下相互作用，从而引发荧光信号互补。

配对可以基于分子结构、性质或功能等进行设计。

步骤三：构建互补融合蛋白为了实现互补配对，需要构建互补融合蛋白。

互补融合蛋白是通过蛋白工程技术将两种不同的蛋白融合在一起而产生的蛋白。

融合蛋白的结构和功能可以根据需要进行调整，以实现双分子之间的相互作用和信号互补。

步骤四：表达和纯化互补融合蛋白在构建互补融合蛋白之后，需要进行表达和纯化的步骤。

表达是指将蛋白基因导入到适当的表达系统中，使其产生蛋白。

纯化是指将目标蛋白从其他杂质分离出来，以获得纯净的蛋白样品。

这些步骤需要使用合适的基因表达系统和蛋白纯化技术。

步骤五：进行双分子荧光互补实验在获得纯净的互补融合蛋白后，可以进行双分子荧光互补实验。

该实验通常通过激发一个标记物，并检测两个标记物之间的荧光互补信号来分析分子间的相互作用。

这可以通过荧光显微镜、光谱分析和图像处理等技术来实现。

步骤六：数据分析和解释数据分析是双分子荧光互补实验的一个重要步骤。

通过分析实验结果，可以获得有关分子间相互作用的信息，如结合亲和力、动力学参数和空间分布等。

这些数据可以进一步用于验证理论模型、优化药物设计和解析复杂生物过程等。

双分子荧光互补技术在蛋白质相互作用研究中的应用双分子荧光互补技术（BiFC）是基于两个不发光的荧光蛋白互补片段在借助其融合蛋白的驱动下重新形成活性荧光蛋白，直接作为报告基因的可视化关键性技术，在探究各种模式生物体内蛋白质与蛋白质间相互作用（PPI）技术中日益受到重视。

本文对BiFC技术原理、发展过程、应用现状、技术改进、及未来展望进行概述。

细胞内蛋白质通常需要与其他蛋白质或配体结合，形成瞬时或稳定的复合体来实现其特定的功能，这种蛋白质与蛋白质之间的相互作用（protein-protein interaction，PPI）在人类、酵母、植物、线虫等各种生物体的生命活动中起着十分重要的作用[1-4]。

目前，PPI研究技术发展迅速，常用的有免疫共沉淀、GST-pull down、表面等离子共振（SPR）、蛋白质芯片等体外实验技术，以及酵母双杂交、蛋白质片段互补（PCA）、荧光共振能量转移（FRET）技术等。

近十余年兴起的双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）技术由于无需试剂检测，能够通过荧光显微镜在接近活细胞生理状态的条件下快速、直观地检测目标蛋白是否具有相互作用，在PPI研究中的应用正日益广泛。

1 BiFC技术的原理Regan（2000）和Kerppola（2002）两个研究小组最早发现和验证了活细胞内BiFC 现象。

他们首先将1个GFP的突变子增强型黄色荧光蛋白（EYFP）从不同位点切开，然后将一组相互作用、同向平行的亮氨酸拉链（bFos和bJun）分别融合到从Ala154-Asp155之间切开的增强型黄色荧光蛋白（EYFP）氨基（N）片段和羧基（C）片段，导入大肠杆菌中共表达。

结果发现，所构建的一对融合多肽能够在细菌细胞中产生YFP的荧光，他们将这个现象称之为BiFC[5-6]。

除EYFP外，目前BiFC技术涉及的荧光蛋白已扩展到绿色荧光蛋白（GFP）、青色荧光蛋白（CFP）、红色荧光蛋白（RFP）及其突变体等多种荧光蛋白，其原理都是将荧光蛋白在特定的位点切开，形成不发荧光的N和C端2个多肽，称为N 片段（N-fragment）和C片段（C-fragment）。

双分子荧光互补实验
双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)分析技术，是由Hu等在2002年最先报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术.该技术巧妙地将荧光蛋白分子的两个互补片段分别与目标蛋白融合表达，如果荧光蛋白活性恢复则表明两目标蛋白发生了相互作用.其后发展出的多色荧光互补技术(multicolor BiFC)，不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较.目前，该技术已用于转录因子，G蛋白βγ亚基的二聚体形式，不同蛋白质间产生相互作用强弱的比较以及蛋白质泛素化等方面的研究工作上.
该方法利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)及其突变体的特性作为报告基因，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接.如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光.在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白质复合体的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等，这些信息对研究蛋白质相互作用有一定意义.。

[技能分享]⼀⽂了解双分⼦荧光互补（BIFC），值得收藏！There is no royal road to learning.双分⼦荧光互补技术服务是信诺⾦达在⽣物⼤分⼦互作研究领域服务内容,本⽂介绍了双分⼦荧光互补的原理,优缺点,实验流程供⼤家参考。

(烟草体系）以及⼀些实验的注意事项,供⼤家参考BIFC原理在荧光蛋⽩（YFP、GFP、Luciferase等）的两个β⽚层间的环结构上有许多特异性位点可以插⼊外源蛋⽩⽽不影响荧光蛋⽩的荧光活性。

BIFC技术正是利⽤荧光蛋⽩家族的这⼀特性，将荧光蛋⽩分割成两个不具有荧光活性的分⼦⽚段，再分别与⽬标蛋⽩融合表达。

如果两个⽬标蛋⽩因物理相互作⽤⽽靠近，就使得荧光蛋⽩的两个分⼦⽚段在空间上相互靠近，重新形成有活性的荧光基因⽽发出荧光。

BIFC技术的优缺点与应⽤BIFC实验操作步骤以烟草体系3为例，在烟草植株活体细胞中检测蛋⽩质-蛋⽩质相互作⽤。

1.种植烟草。

在 14 h 光照/10 h ⿊暗，温度 25 C，相对湿度70%条件下培养⼤概4〜5周。

2.将含有⽬地基因的载体转⼊农杆菌中。

注意：GV3101、EHA105、LBA4404这三种农杆菌均有报道可以⽤于烟草瞬时转化。

在培养农杆菌时候除了除了添加载体所含有的抗⽣素外，不同农杆菌还需要添加其它种类抗⽣素，⽐如GV3101还需要添加50µg/ml的利福平。

培养基中，在28℃, 200rpm的条件下培养2d。

（新鲜转化的农杆3.挑取含有⽬的载体的农杆菌单克隆⾄含有相应抗⽣素的5ml LB培养基中菌单克隆在3mL培养基培养过夜⾄1d即可。

）4.转移1 ml培养的农杆菌菌液⾄20ml含有相应抗⽣素的LB培养基中扩⼤培养，该LB培养基含15µM⼄酰丁⾹酮。

在28℃，200rpm的条件下培养⾄农杆菌的⽣长对数期（OD600=0.5-0.6）.5.在室温，5000rpm离⼼10min以收集菌体，⽤浸染液（含10mM MgCl2，10mM MES, 150µM⼄酰丁⾹酮，pH = 5.6)悬浮农杆菌菌体⾄OD600 =1.0。

双分子荧光互补技术(BiFC)分析玉米SSⅠ与PPDK1之间的蛋白互作崔喜艳;张继晓;窦瑶;孙小杰;尹悦佳;刘相国【摘要】[目的]分析玉米胚乳可溶性淀粉合成酶(SSⅠ)与质体型糖酵解途径关键催化酶丙酮酸磷酸双激酶(PPDK1)的蛋白互作关系,揭示可能发生互作的亚细胞位置.[方法]采用酶切连接的方法构建326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1双分子荧光互补表达载体,转化农杆菌EHA105,瞬时浸染烟草叶片组织,激光共聚焦显微镜下观察SSⅠ和PPDK1相互作用产生的荧光信号.[结果]双酶切试验鉴定表明,326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1重组载体构建正确；PCR结果证实,植物表达载体成功转化到农杆菌EHA105中；双分子荧光互补试验中,可观测到SSⅠ和ppDK1相互结合而产生的黄色荧光信号.[结论]证实SSⅠ和PPDK1能够在植物活体细胞内发生真实的蛋白互作.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(041)007【总页数】6页(P49-53,59)【关键词】SSⅠ;PPDK1;双分子荧光互补技术(BiFC);瞬时转化;蛋白质互作【作者】崔喜艳;张继晓;窦瑶;孙小杰;尹悦佳;刘相国【作者单位】吉林农业大学生命科学学院,吉林长春130118;吉林省农业科学院农业生物技术研究所,吉林长春130124;吉林农业大学生命科学学院,吉林长春130118;吉林大学生命科学学院,吉林长春130012;吉林农业大学生命科学学院,吉林长春130118;吉林省农业科学院农业生物技术研究所,吉林长春130124;吉林省农业科学院农业生物技术研究所,吉林长春130124【正文语种】中文【中图分类】Q753淀粉是玉米籽粒贮藏的主要物质，玉米淀粉的生物合成是一个复杂的代谢过程，主要发生在胚乳造粉质体内，其合成的数量多少直接影响玉米的产量[1]。

淀粉合成过程是蔗糖合成酶首先分解蔗糖为果糖和UDP-葡萄糖，进而形成1-磷酸葡萄糖(G-1-P)[2]。

蛋白互作技术介绍简介：蛋白质间的相互作用是细胞生命活动的基础。

基因只是通过转录翻译指导蛋白质的合成，基因本身不具生物活性，蛋白质才是发挥作用的主体。

通常蛋白质功能的发挥不是依靠单个蛋白质独立起作用，而是与其他蛋白质相互作用才能发挥特定的功能。

1.免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是以抗体与抗原之间的专一性结合作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的方法。

Co-IP 的原理基于活细胞内存在复杂的蛋白互作网络，生理的条件下裂解细胞保留原有蛋白质与蛋白质之间的互作，通过抗体特异性识别目标蛋白，同时沉淀目标蛋白的互作蛋白。

2.双分子荧光互补技术双分子荧光互补（Biomolecular fluorescence complementation，BiFC）技术是将一个完整的荧光蛋白切割成两段不发荧光的片段，N 端和 C 端。

这两个片段在细胞内共表达或体外混合时，不能结合成一个完整的蛋白，从而不会产生荧光。

但把这两个片段融合到一对相互作用的蛋白上时，由于蛋白间的相互作用，两个片段在空间上能互相靠近，从而产生荧光[100]。

BiFC 技术不仅可以直观地检测到一对蛋白质在体内或体外的相互作用，也可以检测在同一个细胞内多种蛋白质的相互作用，通过不同颜色的荧光蛋白共用实现同时检测。

3.酵母双杂交使用酵母双杂交系统（Yeast-two-hybrid，Y2H）筛选蛋白质-蛋白质相互作用长期以来一直是一种有效的工具，但其使用主要限于发现高亲和力的相互作用因子，这些相互万方数据广西大学硕士学位论文桑树中与桑脉带相关病毒 N 蛋白互作的蛋白筛选、鉴定及其表达分析 13 作用因子在相互作用的候选物库中高度富集。

该系统通过携带诱饵蛋白的酵母细胞与携带猎物蛋白的酵母细胞融合而形成一个完整的转录激活因子，从而激活报告基因的表达，通过在营养缺陷培养基上生长或呈色反应来检测系统的功能[106]。