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一、实验目的1. 掌握双荧光素酶实验报告系统的基本原理和操作方法。
2. 学习利用双荧光素酶报告系统检测基因表达和调控。
3. 理解双报告基因在实验中的作用及其对实验结果的影响。
二、实验原理双荧光素酶实验报告系统是一种常用的分子生物学实验方法，用于检测基因表达和调控。
该系统利用两种荧光素酶——萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase, FLUC）和海肾荧光素酶（Renilla Luciferase, Rluc）——作为报告基因。
FLUC在生物发光反应中具有较高的光强度和较宽的线性范围，而Rluc则具有较长的发射波长，可以作为内对照，确保实验结果的准确性和可比性。
在双荧光素酶实验中，通常将带有实验报告基因的载体共转染带有Rluc的载体到细胞中。
通过检测两种荧光素酶的活性，可以评估实验组与对照组之间基因表达和调控的差异。
三、实验材料1. 细胞系：HEK293细胞2. 载体：带有实验报告基因的载体和带有Rluc的载体3. 转染试剂：脂质体转染试剂4. 检测试剂：荧光素酶底物和荧光素酶检测仪器四、实验步骤1. 细胞培养：将HEK293细胞接种于6孔板，培养至对数生长期。
2. 载体构建：将实验报告基因克隆到带有荧光素酶报告基因的载体中，构建双荧光素酶报告基因载体。
3. 转染：按照脂质体转染试剂说明书进行细胞转染，将双荧光素酶报告基因载体和带有Rluc的载体共转染到细胞中。
4. 细胞培养：转染后继续培养细胞，收集细胞样品。
5. 荧光素酶活性检测：按照荧光素酶底物说明书进行荧光素酶活性检测，分别检测FLUC和Rluc的活性。
6. 数据分析：将FLUC和Rluc的活性进行比较，分析实验组与对照组之间基因表达和调控的差异。
五、实验结果1. 荧光素酶活性检测：通过荧光素酶底物检测，成功检测到FLUC和Rluc的活性。
2. 数据分析：实验组与对照组相比，FLUC活性显著提高，而Rluc活性无明显变化。
六、实验讨论1. 双荧光素酶实验报告系统是一种有效的基因表达和调控检测方法，可以用于研究基因功能、信号通路和细胞反应。
双分⼦荧光互补技术及其在蛋⽩质相互作⽤研究中的应⽤双分⼦荧光互补技术及其在蛋⽩质相互作⽤研究中的应⽤摘要双分⼦荧光互补技术是近年发展起来的⽤于体或体外检测蛋⽩质相互作⽤的⼀项新技术。
该技术是将荧光蛋⽩在合适的位点切开形成不发荧光的2个⽚段，这2个⽚段借助融合于其上的⽬标蛋⽩的相互作⽤，彼此靠近，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋⽩分⼦，从⽽产⽣荧光。
BiFC⽅法简单直观，具有可视性的特点，对温度敏感，荧光⽚段种类较多，被⼴泛地应⽤到不同的细胞中，既可以检测蛋⽩之间的相互作⽤，也可以定位蛋⽩质相互作⽤的位点。
此外，BiFC还能在蛋⽩构型的确定以及RNA 的检测⽅⾯发挥作⽤。
经过若⼲年的发展，双⾊荧光互补技术已经发展成包括多⾊荧光互补技术，BiFC和FRET联⽤技术以及BiFC和YTH联⽤技术在的多种技术，拓宽了BiFC的应⽤。
关键词：双分⼦荧光互补技术；蛋⽩质⽚段互补；荧光蛋⽩；蛋⽩质相互作⽤蛋⽩质之间的相互作⽤(Protein-protein interactions，PPIs)形成了细胞中的调节⽹络，⽤来调控细胞的许多功能。
因此，研究蛋⽩之间的相互作⽤对于深⼊了解许多⽣命过程具有⾮常重要的意义。
迄今为⽌，已经建⽴了多种技术和⽅法⽤于研究蛋⽩与蛋⽩之间的相互作⽤，如酵母双杂交技术(Yeast two-hybrid, YTH)，荧光共振能量迁移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)和蛋⽩⽚段互补技术(Protein fragment complementations, PFCs)等⽅法(表1)。
在蛋⽩⽚段互补技术中，双分⼦荧光互补技术(Bimolecular fluorescence complementation, BiFC)由于观察直观，检测⽅便以及能实现在活细胞中对相互作⽤蛋⽩可视化等诸多优点，⾃从其被开发出来后，便得到了⼴泛地应⽤。
1 双分⼦荧光互补技术的提出及理论依据BiFC技术本质上是⼀种蛋⽩质⽚段互补技术，是指将荧光蛋⽩多肽链在某些不保守的氨基酸处切开，形成不发荧光的N-和C-末端2个多肽⽚段。
双荧光素酶报告基因实验步骤引言。
双荧光素酶（Dual-Luciferase）报告基因实验是一种常用的分子生物学实验方法，用于研究基因表达调控、信号转导通路等生物学过程。
该实验利用双荧光素酶系统，通过测定荧光素酶和荧光素酶的活性，来研究目标基因的转录水平和调控机制。
本文将介绍双荧光素酶报告基因实验的步骤及相关注意事项，以供科研工作者参考。
实验步骤。
1. 选取适当的载体。
在进行双荧光素酶报告基因实验之前，首先需要选择适当的表达载体。
常用的载体包括pGL3基因表达载体和pRL-TK基因表达载体。
pGL3基因表达载体含有火萤酶（Firefly luciferase）报告基因，用于检测目标基因的转录水平；pRL-TK基因表达载体含有海洋光明蛋白（Renilla luciferase）报告基因，用作内参对照。
将目标基因的启动子区域克隆至pGL3载体中，构建双荧光素酶报告基因实验所需的表达载体。
2. 细胞培养和转染。
选取适当的细胞系进行实验，如HEK293、HeLa等常用的哺乳动物细胞系。
将细胞进行培养，待细胞生长至80%～90%的密度时，进行转染。
将构建好的双荧光素酶报告基因载体与转染试剂混合，加入到细胞培养基中，进行细胞转染。
根据实验需求，可以选择不同的转染试剂和转染时间。
3. 荧光素酶检测。
待细胞转染后，根据实验设计的需要，进行不同处理，如给予药物刺激、转染siRNA等。
处理后，收集细胞，用相应的细胞裂解液溶解细胞，离心收集上清液。
分别取一部分上清液进行火萤酶和海洋光明蛋白的活性检测。
使用荧光素酶检测试剂盒，按照说明书进行操作，测定两种荧光素酶的活性。
4. 数据分析。
将测得的荧光素酶活性数据进行比较和分析。
通常情况下，将火萤酶的活性作为目标基因的表达水平，而海洋光明蛋白的活性作为内参对照。
通过比较不同处理组和对照组的荧光素酶活性，可以得出目标基因的表达水平及其受到的调控。
注意事项。
1. 实验操作要严格遵守无菌操作规范，避免细菌和真菌的污染。
双荧光素酶实验原理
聚合酶链反应是一种借助特定的酶催化的连续的多步骤反应，使原位DNA上的特定核
苷酸序列做置换，它是一种常用的实验技术，由于他的高灵敏度，通常用来检测体内病原
体的DNA片段，以及用来检测正常DNA与特定病理基因的互补序列，它还可用来检测特定
的外源DNA。
双荧光PCR（双荧光实时聚合酶链反应）是一种非常有效的实时PCR技术，
可以用来检测目标片段的量，也可以用来检测mRNA的表达水平。
双荧光素酶实验是与双荧光PCR相关的实验，双荧光素酶实验是一种利用特定素酶反
应特定底物的灵敏性诊断方法。
通常，聚合酶链反应后，一个双链DNA片段会被另一个特
定酶切割，产生一个双链双酶标记分子，这种二酶双标记分子由两个不同的荧光素酶（HEX和TAMRA）所标记，每个荧光素酶都会吸收一种不同波长的光，而且发出与它们吸
收的不同光谱。
通过使用双荧光素酶实验，可以同时检测和定量释放的双标签分子的含量，所以双荧光素酶实验也被称为实时聚合酶链反应或实时PCR。
双荧光素酶实验和双荧光PCR实验的原理基本相同，但有一个关键的区别，那就是双
荧光素酶实验不需要使用任何重复扩增步骤，而双荧光PCR实验需要重复步骤。
在双荧光
素酶实验中，在反应物溶液中添加特定素酶，在构建反应物温度时，素酶会在酶催化反应
中对其进行切割，当这些双链分子发生置换时，它们将受到素酶切割，然后将荧光标记物
结合到这些小片段上，这就可以识别出精确位点的突变，以及特定核苷酸序列。
有了双荧
光素酶实验的结果，可以更准确地检测出病原体DNA，更准确地鉴定DNA的种型，并可以
用于更精准地识别病理基因的突变。
双荧光素酶报告实验是一种重要的生物技术手段，主要用于基因表达调控研究。
其详细原理如下：
双荧光素酶报告实验主要利用萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）和海洋腔肠荧光素酶（如Renilla luciferase）这两种具有不同底物和发光颜色的酶。
在实验中，Firefly luciferase和Renilla luciferase被用作报告基因，通过检测它们产生的荧光信号，可以监控和证实微观层面上的分子间相互作用。
实验开始时，将靶基因的转录调控元件或5’启动子区克隆在Firefly luciferase基因的上游，或把3’-UTR区或lncRNA结合序列克隆在Firefly luciferase基因的下游。
这样，Firefly luciferase的表达就会受到靶基因转录调控元件的调控，从而反映靶基因的表达情况。
同时，为了消除实验中的误差，如细胞转染效率的差异等，通常会引入包含Renilla luciferase基因的TK载体作为内参。
Renilla luciferase的表达不受靶基因的影响，因此其荧光信号可以作为实验的基准，用于校正其他因素引起的变化。
在实验过程中，给予细胞不同的处理后，裂解细胞并加入底物荧光素（luciferin）。
Firefly luciferase和Renilla luciferase能催化荧光素发出荧光，其发光强度与酶的表达量成正比。
通过检测两种荧光信号的强度，可以判断不同处理组对靶基因转录调控元件的影响。
综上，双荧光素酶报告实验通过结合萤火虫荧光素酶和海洋腔肠荧光素酶的特性，提供了一种高灵敏度和高特异性的方法，用于研究基因表达调控的微观机制。
双分子荧光互补实验
双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)分析技术，是由Hu等在2002年最先报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术.该技术巧妙地将荧光蛋白分子的两个互补片段分别与目标蛋白融合表达，如果荧光蛋白活性恢复则表明两目标蛋白发生了相互作用.其后发展出的多色荧光互补技术(multicolor BiFC)，不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较.目前，该技术已用于转录因子，G蛋白βγ亚基的二聚体形式，不同蛋白质间产生相互作用强弱的比较以及蛋白质泛素化等方面的研究工作上.
该方法利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)及其突变体的特性作为报告基因，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接.如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光.在荧光显微镜下，就能直接观察到两目标蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白质复合体的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等，这些信息对研究蛋白质相互作用有一定意义.。
