RFect小核酸转染试剂说明(单核细胞 转染)

RFect siRNA淋巴细胞转染产品描述RFect siRNA转染试剂是专为将RNAi双链(siRNA)转染真核细胞而设计的新一代动物源性游离脂质转染试剂。

RFect由不同的脂质组成，在大多数细胞系中表现优异，但也存在一定的差异。

无论血清存在与否，SiRNA-RFect复合物可直接添加到培养基中的细胞中。

转染后无需去除复合物或改变/添加培养基，但复合物可在4-6小时后去除。

RFect siRNA转染试剂的优点转染效率高90%或更多的速度和明显的基因击倒效果(如。

在A549细胞中，Lamin A/C基因敲除效率达95%以上)。

最小的细胞毒性(少于10%的细胞转染后死亡率),以减少非特异性作用和细胞压力。

需要低浓度的siRNA获得高水平的可拆卸的。

广泛的转染细胞:我们可以获得理想的大多数附着细胞系转染结果。

储存、稳定、特殊处理RFect核转染试剂在室温下稳定运输和长期储存(12个月)在4°C。

RFect siRNA转染试剂仅供研究使用。

转染的重要指南转染过程中不要向培养基中添加抗生素，因为这可能导致细胞死亡。

以10nm siRNA为起始点，虽然siRNA浓度可以远低于10nm。

正向转染和反向转染协议可用于大多数细胞株。

协议:向前转染使用以下步骤将siRNA以24孔的形式转染到细胞中。

有关其他格式，请参见放大或缩小转染。

优化转染如优化转染中所述，特别是在首次转染细胞株时。

所有数量和体积均按每口井计算。

答:板细胞在转染前的一天,500μl板细胞生长介质没有抗生素,这样细胞将30 - 50%时汇合的转染。

B.准备siRNA-RFect复合物1. 稀释6 pmol siRNA 50μl没有血清的培养基。

2. 稀释2μl RFect 50μl没有血清的培养基。

轻轻搅拌，室温下孵育5分钟。

注意:在25分钟内进行第3步。

3.5分钟后孵化,结合稀释的稀释siRNA RFect(总量= 100μl)。

轻轻搅拌，室温下孵育20分钟。

RFect SP 悬浮细胞小核酸转染货 号：BIOG-11024: 0.5mlBIOG-11025: 1.0ml 储存条件：-20℃BIOG-11026: 1.5ml产品特点产品介绍RFect SP 悬浮细胞小核酸转染试剂是我公司研发团队在RFect PM 原代细胞小核酸转染试剂的基础上加以改进研发成功的专门用于悬浮细胞小核酸转染的试剂。

RFect SP 可用来转染siRNA 、antisense RNA 、microRNA 等200bp 以内的小分子RNA 和DNA ，可转染绝大多数悬浮细胞。

目前，无论国外还是国内，悬浮细胞的核酸转染都是个热点难题，市场还缺乏真正有效的商品化的悬浮细胞小核酸转染试剂。

RFect SP 能够高效转染绝大多数悬浮细胞，获得比较理想的基因敲除效果。

对于大多数悬浮细胞，RFect SP 的细胞转染阳性率都在75%以上，而转染细胞死亡率不到10%。

RFect SP 的使用也极其简便，先将sRNA 与RFect SP 室温混合，再将siRNA-RFect SP 混合物直接加入含培养基的细胞，血清对转染效果没有影响，不必刻意添加或更换培养液。

操作步骤：本说明书适用于24孔培养板的转染实验，其他规格的培养板的用量参照下面表格，表格给出的是每孔的用量与体积。

A. 细胞接种：转染前一天接种细胞，每孔 500 μl 培养基（不可加抗生素），使细胞在转染时密度在30-40% 。

B. siRNA-RFect SP混合物准备：1. 6pmol siRNA 用50μl 无血清培养基稀释。

2. 2μl RFect SP 用50μl 无血清培养基稀释。

轻轻混匀，室温孵育5min 。

注意：确保在25 min 内执行第三步操作，不要过于延迟。

3. 孵育5min 后，将siRNA 稀释液与RFect MN 稀释液混合（总体积100μl ）。

轻轻混匀，室温孵育20 min 。

C. 将混合物加到培养的细胞内（完全培养基培养）：转染实验优化: 为了提高转染效率，最好对转染条件进行优化，特别是首次使用。

Xfect 质粒DNA 转染试剂• 操作简便且兼容血清 • 转染效率高 • 细胞毒性极低 • 细胞类型广泛操作流程图：Xfect 质粒DNA 转染试剂操作步骤(6-孔板)：1. 转染前的准备贴壁细胞: 在转染的前1d ，接种1ml 合适密度的细胞于6-孔板的单孔中，使转染当天细胞融合度能够达到50–80%。

悬浮细胞: 在混匀Xfect Polymer 前，将细胞以5 x10e5–1.25 x10e6/1ml 接种于6-孔板中培养。

2. 漩涡混匀Xfect Polymer 。

3. 对于单孔转染，分别在2个离心管中混匀以下试剂： Tube 1 (质粒DNA)---μl (5 μg) 质粒DNA---μl Xfect 反应缓冲液 100 μl 总体积T ube 2 (Polymer) 1.5 μl Xfect Polymer (100μg /μl ) 98.5 μl Xfect 反应缓冲液 100 μl 总体积注意:• 上述为6-孔板单孔转染所需的量。

• 每1μg 质粒DNA 加0.3 μl Xfect Polymer 。

• 对于大多细胞来说，5 μg 的质粒DNA 是最佳使用量。

若您是首次使用Xfect 转染细胞，需要按照2.5 μg ，5 μg 和7.5 μg 的质粒DNA 的量进行梯度实验，确定质粒DNA 的最优使用量。

实验证明，质粒DNA 的量不能少于2.5 μg ，不然会造成转染效率低（经转染Hela 细胞实验验证）。

• Xfect Polymer 预混液室温放置不要超过30min 。

4. 漩涡混匀每管混合物。

5. 将Xfect Polymer 预混液和DNA 预混液混合，再将混合液以适中的速度漩涡10sec 。

6. 室温孵育10 min ，形成Xfect/DNA 复合物。

7. 将200μl 纳米复合物逐滴加入细胞培养基中，轻柔地前后摇晃混匀。

注意:无需去除培养基中的血清，当纳米复合物加入培养基后，培养基的颜色会有些改变，这是正常的。

RFect SP 悬浮细胞小核酸转染试剂说明货 号：BIOG-11024: 0.5mlBIOG-11025: 1.0ml 储存条件：-20℃BIOG-11026: 1.5ml 产品特点产品介绍RFect SP 悬浮细胞小核酸转染试剂是我公司研发团队在RFect PM 原代细胞小核酸转染试剂的基础上加以改进研发成功的专门用于悬浮细胞小核酸转染的试剂。

RFect SP 可用来转染siRNA 、antisense RNA 、microRNA 等200bp 以内的小分子RNA 和DNA ，可转染绝大多数悬浮细胞。

目前，无论国外还是国内，悬浮细胞的核酸转染都是个热点难题，市场还缺乏真正有效的商品化的悬浮细胞小核酸转染试剂。

RFect SP 能够高效转染绝大多数悬浮细胞，获得比较理想的基因敲除效果。

对于大多数悬浮细胞，RFect SP 的细胞转染阳性率都在75%以上，而转染细胞死亡率不到10%。

RFect SP 的使用也极其简便，先将sRNA 与RFect SP 室温混合，再将siRNA-RFect SP 混合物直接加入含培养基的细胞，血清对转染效果没有影响，不必刻意添加或更换培养液。

有关RFect SP 悬浮细胞小核酸转染试剂的材料合成和试剂配制我们已申请了国际专利，并通过PCT 覆盖国际上多个国家和地区。

操作步骤：本说明书适用于24孔培养板的转染实验，其他规格的培养板的用量参照下面表格，表格给出的是每孔的用量与体积。

A. 细胞接种：转染前一天接种细胞，每孔 500 μl 培养基（不可加抗生素），使细胞在转染时密度在30-40% 。

B. siRNA-RFect SP混合物准备：1. 6pmol siRNA 用50μl 无血清培养基稀释。

2. 2μl RFect SP 用50μl 无血清培养基稀释。

轻轻混匀，室温孵育5min 。

注意：确保在25 min 内执行第三步操作，不要过于延迟。

3. 孵育5min 后，将siRNA 稀释液与RFect MN 稀释液混合（总体积100μl ）。

FuGENE6（Roche）转染步骤:转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80％融合。

将细胞以1-3×105/2ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。

将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。

使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。

1.在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总体积到100ul。

2.将3-6ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液，轻弹管壁混合。

3.加入1-2ug的DNA溶液（0.02－2.0ug/ul），轻弹管壁混合。

4.室温孵育20分钟。

5.将6孔板中的旧营养液吸出，加入约1ml不含血清和双抗的营养液洗涤一次，再加入2ml不含血清和双抗的营养液。

6.将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。

7.3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。

Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）：1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。

细胞铺板在2ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。

2.对于每孔细胞，使用250ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释4.0ugDNA，轻轻混匀。

3.使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释10ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。

Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。

NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。

4.混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。

室温放置20分钟。

5.（optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。

加入2ml无血清配养基。

软骨细胞 siRNA转染原理及转染试剂的选择RNA干扰（RNA interference，RNAi）是近年来生命科学领域最为重大的发现之一。

它是指小分子双链RNA可以特异性地降解同源mRNA,从而抑制或关闭特定基因表达的现象。

人们只要知道了某种疾病的致病基因，就可以设计出针对该基因mRNA的小分子干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA），抑制或封闭该致病基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。

siRNA是目前最为热门的生命科学研究领域，也是未来最有发展前途的新药开发领域。

除此之外，siRNA技术还可以广泛应用于农业、林业、畜牧业和渔业等多种领域，进行良种培育、良种筛选和疾病治疗等。

siRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。

其中，化学转染技术是目前最为常用的方法，由于电转的方法对细胞损伤比较大，一般不建议选择电转。

化学转染能否成功的关键在于转染试剂的选择，目前常用的转染试剂有RFect系列转染试剂、Lipo2000、RNAiMAX等。

如何选择合适的转染试剂，一般可从以下几个方面考虑：一、对siRNA有较高的转染效率。

转染效率的确定，常用的是使用荧光定量PCR、荧光显微镜和流式细胞仪检测的方法。

金标准无疑是检测目标基因的mRNA 水平，因为转染试剂不仅要把siRNA转染进入细胞，还应及时把转入细胞的siRNA 释放出来，发挥抑制基因表达的作用。

通过荧光显微镜判断转染效率至少存在两方面的问题：1、荧光显微镜看到的荧光点可能是非特异吸附的结果；2、有些转染试剂能够将siRNA转染入细胞，但不能充分释放，导致基因抑制效率并不高。

因而，判断转染试剂转染效率的金标准应该是荧光定量检测mRNA水平，仅靠观察荧光显微镜判断转染效率、选择转染试剂往往会导致误判，影响实验的进展。

目前国内应用最广的转染试剂有RFect系列转染试剂、Lipo2000、RNAiMAX等，其中，Lipo2000、RNAiMAX为国外知名品牌，RFect转染试剂虽在国内生产，但实际上是在美国研发成功，拥有国际发明专利。

RFect 小核酸转染试剂货 号：11011: 0.5ml11012: 1.0ml 储存条件：-20℃11013: 1.5ml产品特点 应 用产品介绍RFect 小核酸转染试剂是国际知名科学家崔坤元博士领导我公司研发团队在美国西雅图实验室研发成功的一种新型的小核酸转染试剂。

RFect 可用来转染siRNA 、antisense RNA 、microRNA 等200bp 以内的小分子RNA 和DNA ，转染细胞包括绝大多数贴壁生长的细胞，如一般细胞株、肿瘤细胞株等。

目前，无论国外还是国内，转染试剂的主要成分均为脂质体或聚乙烯亚胺(Polyethylenimine, PEI)，这两种成分都具有很大的细胞毒性，并且转染效果不好。

RFect 采用新型的动物源性的纳米材料，毒性很低并且拥有非常卓越的转染性能。

与其它品牌的小核酸转染试剂相比，RFect 的细胞转染阳性率一般在90%以上，Lamin A/C 基因抑制效率在95%以上，而其它品牌转染试剂的细胞转染阳性率一般不超过70%，Lamin A/C 基因抑制效率不超过75%。

RFect 细胞毒性很低，转染细胞死亡率不到10%，而其它品牌试剂的转染细胞死亡率一般在30%以上。

血清对转染效果没有影响，不必刻意添加或更换培养液。

有关RFect 小核酸转染试剂的材料合成和试剂配制我们已申请了国际专利，并通过PCT 覆盖国际上多个国家和地区。

操作步骤：本说明书适用于24孔培养板的转染实验，其他规格的培养板的用量参照下面表格，表格给出的是每孔的用量与体积。

A. 细胞接种：转染前一天接种细胞，每孔 500 μl 培养基（不可加抗生素），使细胞在转染时密度在30-50% 。

B. siRNA-RFect 混合物准备：1. 6pmol siRNA 用50μl 无血清培养基稀释。

2. 2μl RFect 用50μl 无血清培养基稀释。

轻轻混匀，室温孵育5min 。

注意：确保在25 min 内执行第三步操作，不要过于延迟。

FuGENE6（Roche）转染步骤:转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80％融合。

将细胞以1-3×105/2ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。

将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。

使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。

1.在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总体积到100ul。

2.将3-6ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液，轻弹管壁混合。

3.加入1-2ug的DNA溶液（0.02－2.0ug/ul），轻弹管壁混合。

4.室温孵育20分钟。

5.将6孔板中的旧营养液吸出，加入约1ml不含血清和双抗的营养液洗涤一次，再加入2ml不含血清和双抗的营养液。

6.将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。

7.3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。

Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）：1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。

细胞铺板在2ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。

2.对于每孔细胞，使用250ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释4.0ugDNA，轻轻混匀。

3.使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释10ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。

Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。

NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。

4.混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。

室温放置20分钟。

5.（optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。

加入2ml无血清配养基。