DNA细胞转染试剂(Entranster)使用手册

英格恩entranster转染试剂说明书一、产品概述英格恩 Entanster 转染试剂是一种用于转染外源 DNA/RNA 到细胞内的试剂。

它是经过优化的化学试剂组合，可以将外源 DNA/RNA 高效地传递到各种细胞中，并促进其定向表达。

本试剂适用于体外转染实验和基因工程研究，具有高转染效率、低细胞毒性、简单易用等优点。

二、试剂成分英格恩 Entanster 转染试剂主要成分包括转染缓冲液和转染增强剂。

转染缓冲液中包含有机溶剂、非离子表面活性剂等，用于稳定 DNA/RNA与转染剂的结合。

转染增强剂含有具有阴离子表面活性剂、脂质、蛋白质等物质，可以提高细胞膜通透性和转染效率。

三、使用说明1.储存和稀释：试剂应储存于-20℃的冰箱中，保持干燥和避光。

使用前需要将试剂溶解在适当体积的转染缓冲液中，最佳稀释比例为1：9、溶液需充分混匀，离心并去除任何沉淀物。

2.样品准备：在转染前，将目标DNA/RNA溶解在适当的缓冲液中，浓度通常在0.1-1μg/μL最佳。

确保样品充分溶解并无明显沉淀。

3.转染操作：对于已经培养至适当倍数的细胞，将细胞用预先暖和的转染缓冲液洗涤一次，并去除缓冲液。

将转染缓冲液和溶解好的目标DNA/RNA混合，稍微搅拌均匀。

与此同时，将适量的转染增强剂加入到混合物中，充分混合。

然后将混合物直接滴加到细胞上，并轻轻摇晃培养板以确保混合物均匀分布。

4.培养和检测：将含有转染混合物的培养板放回恒温培养箱中，保持恒定的温度和CO2浓度。

培养时间和温度根据需要进行调整，通常在24-48小时后可以进行下一步实验或观察。

四、注意事项1.试剂需保存在干燥、阴凉、避光的环境中，避免结冰或暴露在高温环境中。

2.操作中需佩戴手套并遵循生物安全实验操作规范。

3.使用前需充分摇匀试剂瓶，确保所有试剂成分充分混合均匀。

4.转染缓冲液中的有机溶剂可能对一些细胞有毒性，因此在选择试剂时应参考相关文献或尝试不同的浓度和时间，以确定最佳条件。

PRODUCT INFORMATIONThermo ScientificTurboFect Transfection Reagent#R0531 1 mLfor _in vitro transfectionsLot XXXXXXXX Expiry Date MM.YYYYFFFFR0531FFFFXXXXXXXXwww. /onebioStorage: Upon receipt store at 4°C.Product shipped at ambient temperature.hMade in LithuaniaIntroductionThe Thermo Scientific™ TurboFect™ Transfection Reagent is a solution of cationic polymer in water. The polymers and deoxyribonucleic acid (DNA) form compact, stable, positively charged complexes, which protect DNA from degradation and facilitate gene delivery into eukaryotic cells. The transfection reagent is ideal for transfection of primary cells, difficult-to-transfect cells and other types of cells with transfection being possible in the presence or absence of serum. The transfection reagent demonstrates superior transfection efficiency and minimal toxicity when compared to lipid-based or other polymer-based transfection reagents.Rev.11 c Important Product Information• DNA quality is critical for successful transfection.For excitation/emission absorbance at 260/280nm, a ratio of 1.8 or higher is recommended.• Endotoxin-contaminated DNA results in inefficient transfection and can cause high cellular toxicity. • At the time of transfection, the optimal confluency for adherent cells is 70-90%.• Plate suspension cells at an optimal density to ensure logarithmic growth at the time of transfection. • Transient transgene expression occurs within 2-72 hours after transfection.• The optimal incubation time must be empirically determined and depends on the cell type, promoterstrength and expression product.• High transfection efficiency depends on thetransgene promoter and the cell line used.• Cytomegalovirus (CMV) promoter is commonly used for high gene expression in a variety of cell lines;however, other promoters such as simian virus(SV40) and Rous sarcoma virus (RSV) can also beused.• The volume of transfection reagent used depends on the amount of DNA, transgene and cells to betransfected. The ratios presented in the protocolsbelow are starting amounts and may be optimized. • Antibiotics do not interfere with transfectionreagent/DNA complex formation, cell transfection ortransfection efficiency.CERTIFICATE OF ANALYSISTransfection efficiency was tested on HeLa cells using1 µg of eGFP expressing plasmid and2 µL of TurboFect per 5 × 104 cells in 24-well plate. Transfection efficiency, i.e. the percentage of transfected cells, is90±10% as estimated by flow cytometry.Quality authorized by:Jurgita Zilinskiene Protocol for Transfection of CellsA. Material RequiredGrowth medium: Serum-free DMEM, RPMI orother growth mediumB. General Protocol for Transfection of Adherentand Suspension Cells in a 24-well PlateNote: The protocol is optimized for transfection in a24-well plate format. At the time of transfection, theoptimal confluency for adherent cells is 70-90%.Suspension cells should be in logarithmic growth phaseat the time of transfection. For best results, start with 1µgof DNA and 2µL of transfection reagent per well in a24-well plate (See Table 1). Subsequent optimization canfurther increase transfection efficiency, depending on thecell line and transgene used.1. In each well, seed ~5 × 104 adherent cells or~5 × 105 suspension cells in 1mL of growth medium24 hours before transfection.Note: Prepare transfection reagent immediatelybefore transfection.2. Dilute 1µg of DNA in 100µL of serum-free DMEM orother serum-free growth medium.3. Briefly vortex the transfection reagent and add 2µLto the diluted DNA. Mix immediately by pipetting orvortexing.4. Incubate 15-20 minutes at room temperature.5. Add 100µL of the transfection reagent/DNA mixturedrop-wise to each well. Do not remove the growthmedium from the cells before adding thetransfection reagent/DNA mixture.6. Gently rock the plate to achieve even distribution ofthe complexes immediately after adding thetransfection reagent.7. Incubate at 37°C in a CO2 incubator.8. Analyze transgene expression after 24-48 hours.For stable transfection, grow cells in selectivemedium for 10-15 days.C. Protocol for Reverse Transfection of Adherentand Suspension Cells in a 24-well PlateNote: The protocol is optimized for transfection in a24-well plate format. Scale-up quantities and volumesaccording to the number of cells/wells to be transfected(See Table 1). For best results, start with 1µg of DNAand 2µL of transfection reagent per well in a 24-wellplate. Subsequent optimization can further increasetransfection efficiency, depending on the cell line andtransgene used.Note: Prepare transfection reagent immediately beforetransfection.1. Dilute 1µg of DNA in 100µL of serum-free DMEMor other serum-free growth medium.2. Briefly vortex the transfection reagent and add 2µLto the diluted DNA. Mix immediately by pipetting orvortexing.3. Incubate 15-20 minutes at room temperature.4. Evenly distribute 100µL of the transfection reagent/DNA mixture at the bottom of the well of a 24-wellplate.5. Gently layer 1mL of ~105 adherent cells or ~106suspension cells per well on top of the transfectionreagent/DNA mixture.6. Incubate at 37°C in a CO2 incubator.7. Analyze transgene expression after 24-48 hours.Note: Plates can be centrifuged for 2-5 minutesat 200 × g to collect cells at the bottom of the plate.Table 1. Scale-up ratios for transfection of adherent and suspension cells using TurboFect Transfection Reagent.Tissue cultureplate Growth area(cm2/well)Volume ofmedium (mL)No. of adherent(suspension) cells toseed the day beforetransfection*Amount of DNAVolume of TurboFectTransfection Reagent (µL)(µg) (µL)** Recommended Range96-well plate 0.3 0.2 0.5-1.2 × 104(2.0 × 104)0.2 20 0.4 0.3-0.648-well plate 0.7 0.5 1.0-3.0 × 104(5.0 × 104)0.5 50 1.0 0.5-1.424-well plate 2.0 1.0 2.0-6.0 × 104(1.0 × 105)1.0 1002.0 1.0-2.812-well plate 4.0 2.0 0.4-1.2 × 105(2.0 × 105)2.0 200 4.0 2.6-6.06-well plate 9.5 4.0 0.8-2.4 × 105(4.0 × 105)4.0 400 6.0 4.0-8.060mm plate20 6.0 2.0-6.3 × 105(1.0 × 106)6.0 600 12.0 8.0-16.0*Values for suspension cells are in parentheses.**The volume of DNA should be 1/10 the volume of the culture medium used for dilution of the DNA.Note: These numbers were determined using HeLa and Jurkat cells. Actual values depend on the cell type. The amount of DNA and TurboFect Transfection Reagent used may require optimization.Additional InformationA. Cells successfully transfected with TurboFect Transfection Reagent.Permanently growing cell lines Primary cell culturesCos-7 African green monkey kidney cellsHeLa Human cervix adenocarcinoma cellsCHO Chinese hamster ovary cellsHEK293 Human embryonic kidney cellsB50 Rat nervous tissue neuronal cellsCalu1 Human lung epidermoid carcinoma cells RAW264 Mouse leukaemic monocyte-macrophage cells WEHI Mouse B cell lymphoma cellsMDCK Madin Darby Canine Kidney cellsRaji Human Burkitt’s lymphoma cellsCOLO Human colon adenocarcinoma cellsJurkat Human leukaemic T cellsSp2/Ag14 Mouse myeloma cellsHeLa S3 Human cervix carcinoma cellsHep2C Human larynx carcinoma cellsL929 Mouse connective tissue fibroblastsNIH3T3 Mouse embryo fibroblasts Rat fibroblastsMouse bone marrow-deriveddendritic cellsMouse bone marrow-derivedmacrophagesHuman lung fibroblasts (HLF)TroubleshootingProblem Possible Cause SolutionLow transfectionefficiencySuboptimal transfection reagent/DNAratioOptimize the amount of transfection reagent added tothe fixed amount of DNASuboptimal quantity of DNAOptimize the amount of DNA used for transfectionKeep the amount of transfection reagent constantPoor DNA qualityUse high-quality DNA with an absorbance ratio greaterthan 1.8 at 260/280nmSuboptimal cell confluencyOptimize cell plating conditionsEnsure adhered cells are 70-90% confluent at the timeof transfectionEnsure that suspension cells are in logarithmic growthphase at the time of transfectionMycoplasma contamination Regularly check cells for mycoplasma infectionHigh cellulartoxicityToxic transgene Verify if the expressed transgene is toxicSuboptimal incubation conditionsReduce incubation time of the polyplexes with the cellsReplace the transfection mixture 3-4 hours later withnew growth mediumExcess amount of DNA Reduce the quantity of DNA used for transfectionCell density was too lowIncrease the plating density of cells used fortransfectionEndotoxin or other toxic materials werepresent with transgeneEnsure transgene is free of toxic substancesRepeat insertion of gene into new toxin-free plasmidpreparationRelated Thermo Scientific Products16146-89Pierce® Luciferase Assay Kits and Reagents88273 High Capacity Endotoxin Removal Spin Columns, 0.1mL, 5/pkgNote:This product or the use of this product is covered by US patent application US20100041739A1 and corresponding counterparts. The purchase of thisproduct includes a non-transferable license to use this product for the purchaser's internal research. All other commercial uses of this product, includingwithout limitation product use for diagnostic purposes, resale of product in the original or any modified form or product use in providing commercial servicesrequire a separate license. For further information on obtaining licenses please contact @PRODUCT USE LIMITATIONThis product is developed, designed and sold exclusively for research purposes and in vitro use only. The product was not tested for use in diagnostics orfor drug development, nor is it suitable for administration to humans. Please refer to /onebio for Material Safety Data Sheet of theproduct.Current product instructions are available at /onebio.© 2012 Thermo Fisher Scientific, Inc. All rights reserved. Unless otherwise indicated, all trademarks are property of Thermo Fisher Scientific Inc. and itssubsidiaries. Printed in the Lithuania.。

100488 4 0GenJet In Vitro DNA Transfection Reagent for Hela Cells (Ver. II)-----A Protocol for Transfection ofHela Cells100 µl 500 µl 1000 µl15875 Gaither Drive Gaithersburg, MD 20877FAX. 301-560-4919TEL. 301-330-5966Toll Free. 1-(866)-918-6812Email: *********************Web: Introduction:GenJet™In Vitro DNA Tranfection Reagent (Ver. II) is upgraded version of GenJet™In Vitro DNA Tranfection Reagent. With a new chemistry, more DNA condensing groups were released in the new version compared with old version GenJet™, leading to 3~4 times more efficient in DNA delivery. GenJet™(Ver. II) for transfection of Hela cells was formulated for tanasfection of Hela cells.Procedures for Transfecting Hela Cells:Step A. Cell Seeding (see Table 1):Cells should be plated 18 to 24 hours prior to transfection so that the monolayer cell density reaches to the optimal ~90% confluency at the time of transfection. Complete culture medium with serum and anti-biotics is freshly added to each well ~60 minutes before transfection.Table 1. A Guideline for Seeding Adherent Cells Prior to Transfection inDifferent Culture Formats This product is for laboratory research ONLY and not for diagnostic use2008 S i g n a G e n L a b o r a t o r i e sStep B. Preparation of GenJet™-DNA Complex and Transfection ProceduresFor Hela cells, the optimal ratio of GenJet™(µL):DNA (µg) is 3:1. We recommend the GenJet™(µL):DNA (µg) ratio of 3:1 as a starting point which usually gives satisfactory transfection efficiency with invisible cytotoxicity. To ensure the optimal size of complexparticles, we recommend using serum-free DMEMwith High Glucose to dilute DNA and GenJet™Reagent.The following protocol is given for transfectionin 24-well plates, refer to Table 2for transfection in other culture formats. The optimal transfection conditions for Hela cells are given in the standard protocol described below.-For each well, add 0.5 ml of complete medium with serum and antibiotics freshly ~60 minutes before transfection.-For each well, dilute 1 µg of DNA into 50 µl ofserum-free DMEM with High Glucose. Vortex gently and spin down briefly to bring drops to bottom of the tube .-For each well, dilute 3 µl of GenJet™reagent (Ver. II) into 50 µl of serum-free DMEM with High Glucose.Vortex gently and spin down briefly.-Add the diluted GenJet™Reagent immediatelyto the diluted DNA solution all at once. (Important: do not mix the solutions in the reverse order !)-Vortex-mix the solution immediately and spin down briefly to bring drops to bottom of the tube followed by incubation of 15~20 minutes at room tempera-ture to allow GenJet™-DNA complexes to form.Note:Never keep the DNA/GenJet™complex longerthan 20 minutes-Add the 100 µl GenJet™/ DNA complex drop-wise onto the medium in each well and homogenize the mixture by gently swirling the plate.-Remove DNA/GenJet™complex-containing medium and replace with fresh complete serum/antibiotics containing medium 12~18 hours post transfection. -Check transfection efficiency 24 to 48 hours post transfection.Storage:GenJet™DNA In Vitro TransfectionReagent is stable for up to 12 months at +4 0C. This item shipped at ambient temperature1.2 –2.4 x 1040.396-well Plate4.0 –8.0 x 1041.048-well Plate 0.8 –1.6 x 1051.924-well Plate 1.5 –3.0 x 1053.512-well Plate 4.0 –8.0 x 1059.66-well Plate 3.5 –7.0 x 1059.635 mm Dish 0.9 –1.8 x 1062160 mm Dish 2.2 –4.4 x 10658100 mm Dish 3.0 –6.0 x 10675T75 Flask Number of Cells to Seed Surface Area (cm2)Culture Dishes 0.62 x 0.010.20.296-well32 x 0.051.00.524-well 12 x 0.020.50.348-well 150 -3002 x 1.2550 -10020250 ml flask54 -1082 x 0.7518 -3610T75 flask 21 -242 x 0.57 -8610 cm dish 152 x 0.255360 mm dish 62 x 0.121.535 mm dish 62 x 0.121.26-well GenJet™Reagent (µL)DiluentVolume (mL)Plasmid DNA (µg)Transfection Volume (ml)Culture Dish Table 2. Recommended Amounts for Different Culture Vessel Formats。

FuGENE6（Roche）转染步骤:转染前一天将细胞分至培养板，转染当天细胞应50-80％融合。

将细胞以1-3×105/2ml接种于6孔板后孵育过夜将达到如此密度。

将FuGENE6 Reagent在室温孵育10-15分钟。

使用之前将FuGENE6颠倒混匀一下。

1.在PCR管中加入不含血清和双抗的营养液以稀释FuGENE6，直至总体积到100ul。

2.将3-6ul FuGENE6 Reagent直接加入营养液，轻弹管壁混合。

3.加入1-2ug的DNA溶液（0.02－2.0ug/ul），轻弹管壁混合。

4.室温孵育20分钟。

5.将6孔板中的旧营养液吸出，加入约1ml不含血清和双抗的营养液洗涤一次，再加入2ml不含血清和双抗的营养液。

6.将转染复合物加入细胞，混匀使之均匀分布。

7.3-8小时后，加入血清或换成含血清的营养液。

Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂转染步骤（6孔板）：1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90-95％。

细胞铺板在2ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。

2.对于每孔细胞，使用250ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释4.0ugDNA，轻轻混匀。

3.使用前将Lipofectamine 2000转染试剂轻轻混匀，用250ul无血清培养基（如OPTI-MEM I培养基）稀释10ul Lipofectamine 2000转染试剂，轻轻混匀。

Lipofectamine 2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合（<30分钟）。

NOTE：若使用DMEM培养基，则需在5分钟内同稀释的DNA混合。

4.混合稀释的DNA（第二步）和稀释的Lipofectamine 2000（第三步）。

室温放置20分钟。

5.（optional）将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。

加入2ml无血清配养基。

细胞转染注意事项
1.如为贴壁生长细胞，一般要求在转染前一日，必须应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，转染当日的细胞密度以70-90%（贴壁细胞）或
2×106-4×106细胞/ml（悬浮细胞）为宜，最好在转染前4h换一次新鲜培养液。

2.用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其他化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。

3.培养基中的血清
在开始准备DNA和阳离子脂质体试剂稀释液时要使用无血清的培养基，因为血清会影响复合物的形成。

其实，只要在DNA-阳离子脂质体复合物形成时不含血清，在转染过程中是可以使用血清的。

4.培养基中的抗生素
抗生素是影响转染的培养基添加物。

这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。

这降低了细胞的活性，导致转染效率降低。

这时候可以选择英格恩生物的Entranster转染试剂，非脂质体试剂，培养基可加抗生素，避免了细胞染菌。

5.设置阳性对照和阴性对照。

6.一般在转染24-48h，靶基因即在细胞内表达。

根据不同的实验目的，24-48h 后即可进行靶基因表达的检测实验。

7.如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，常用的真核表达基因载体的标志物有潮霉素和新霉素等。

转染试剂使用注意事项1.细胞密度：转染DNA（质粒）时，细胞密度为80-100%，转染RNA(siRNA或miRNA)时，细胞密度为60-80%，具体细胞密度必须结合考虑核酸种类、转染试剂种类和细胞生长密度极限；2.DNA用量：0.5-1ug/孔（以24孔板为例），具体用量根据转染效率检测实验确定；3.RNA用量：10-30 pmol/孔（以24孔板为例），具体用量根据转染效率检测实验确定；4.转染试剂的用量：转染试剂说明书推荐了一个使用范围，具体用量根据转染效率检测实验确定；5.根据转染效率检测实验确定核酸的用量及转染试剂的用量（核酸与转染试剂的比例关系），转染效率检测实验一般在24孔板中进行，其他格式的培养器皿请根据底面积的比例（表1）进行计算；6.转染试剂使用前才从4℃中取出，取用前，先短暂离心（转速达到3000RPM时即可停止），然后放在涡旋振荡器上点动混匀三次，每次持续1秒，混匀后短暂离心（转速达到3000RPM时即可停止），上述措施是为了混匀转染试剂，保证使用效果，使用后立即放回4℃保存；7.核酸和转染试剂分别用Opti-MEM（这是专用的转染稀释培养基，如果没有Opti-MEM，可以用细胞对应的基础培养基代替）稀释，稀释的核酸可以通过弹匀，吹打均匀，颠倒混匀或涡旋点动混匀（三次，每次持续1秒），稀释的转染试剂可以通过弹匀，颠倒混匀或涡旋点动混匀（三次，每次持续1秒），不可使用吹打均匀；混匀后均需短暂离心；8.把稀释的核酸和稀释的转染试剂复合混匀时，应该把稀释的核酸加入稀释的转染试剂中（顺序不可调转）；加入后立即进行（不要耽搁）弹匀或颠倒混匀（稀释的核酸和稀释的转染试剂一旦复合，转染复合物的形成立即启动，如果不及时混匀，所形成的转染复合物的效率就会很低），先不进行短暂离心，待所有的管子复合完毕后，在一起进行涡旋点动混匀三次，每次持续1秒，然后短暂离心；9.转染复合物孵育形成时尽量避光室温或37℃放置；10.如果进行RNA转染时，尽量使用无酶及灭菌处理的耗材；11.Opti-MEM用量参照转染说明书建议的用量；表1：资料仅供参考!!!。

vivo（动物体内转染试剂）使用手册Entranster TM-in vivo（动物体内转染试剂）使用手册Cat. No. 18668-11 Size:1ml常温运输，储存于4℃。

一产品介绍英格恩生物公司（Engreen Biosystem Co, Ltd.）是专业的转染试剂研发生产厂商。

Entranster TM是英格恩生物公司研发合成的纳米聚合物转染试剂，该试剂采用纳米技术合成，是最新一代非病毒转染试剂。

由于纳米技术的应用，Entranster TM-in vivo在细胞转染过程中，表现了卓越的低毒、高效的性能。

本品可用于转染DNA，也可以转染RNA(如siRNA、miRNA、mimic和inhibitor)，可用于如下研究：●基因治疗研究●RNA干扰研究●蛋白功能研究本品显著的特点是方法简单、快捷，价格低廉，对动物没有明显的炎性反应，对操作者安全。

二使用前注意一般情况下，核酸(ug)和Entranster TM-in vivo (ul)按照1:2的比例使用。

也可调整比例从1:1.5到1:4自行优化使用。

核酸的具体用量和注射用量须根据靶器官大小、动物大小、给药途径决定，具体可参考下表(核酸的用量换算成μg计算)。

表1 给药途径与核酸用量给药途径建议的核酸用量最大给药体积尾静脉50μg 200μl-400μl脑室 2.5-1μg 5μl成年小鼠腹膜100μg 0.6ml-1ml皮下肿瘤 10-50μg 100μl脑室 2-5μg 20μl成年大鼠静脉 150-300μg 1-1.5ml 一些器官比如皮下肿瘤的用量，也可以通过先确定最终的注射量，然后根据表2推算出核酸的用量和转染试剂的用量。

比如最终的注射量是100ul，那么核酸用量一般为12.5ug，Entranster TM-in vivo的用量为25ul。

表2 100ul 转染复合物的组成25μl 纯水25μl 核酸溶液12.5μg 核酸核酸稀释液25μl 的10%葡萄糖溶液25μl 转染试剂100μl 转染复合物转染试剂稀释液25μl 的10%葡萄糖溶液三操作步骤下面以50μg 的核酸与100μl 转染试剂，总注射体积400ul ，成年小鼠尾静脉注射为例说明。

下面以Entranster-H4000，DNA转染试剂为例，简要说明DNA细胞转染实验步骤
1.提前一天细胞铺板
提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞密度在60％左右为宜。

2.转染过程
⑴将0.8μg的DNA用25μl无血清稀释液稀释，充分混匀，制成DNA稀释液。

注意：无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。

⑵将2μl的EntransterTM-H4000用25μl无血清稀释液体稀释，充分混匀，制成EntransterTM-H4000稀释液。

室温静置5分钟。

⑶将EntransterTM-H4000稀释液分别加入到DNA稀释液中，充分混匀（可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上），室温静置15分钟。

转染复合物制备完成。

⑷将转染复合物加入到含细胞和完全培养基的培养容器上，轻柔混匀。

注意：①对本试剂，采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。

②完全培养基可加抗生素。

⑸培养4-6小时后更换培养基，继续培养24-48小时。

注意：①如细胞没有毒性等不良情况，转染后4-6小时可不必更换培养基。

重要提示
1.本品在转染过程中可以添加抗生素，抗生素的添加与否不影响转染效率和毒性。

2.如转染后需要用Trizol提取RNA，建议转染后6小时换液。

EndoFectin™-Lenti 转染试剂■ 产品概述：EndoFectin™ Lenti 转染试剂是一种具有专利的阳离子聚合物试剂，它能与核酸形成复合物，并使该复合物进入哺乳动物细胞。

EndoFectin™ Lenti 转染试剂专为转染HEK293T ，并包装慢病毒颗粒而设计。

即使在有血清存在的情况下，它仍然能高效的将核酸导入细胞。

GeneCopoeia 公司提供的 EndoFectin™ Plus 转染试剂有如下优点：• 优越的转染效率• 重组蛋白的高表达水平• 与含血清的培养基相兼容• 低细胞毒性• 易于操作■ 成分及储存条件：• 每管含有经过滤除菌的EndoFectin™ Lenti 转染试剂• EndoFectin™ Lenti 转染试剂 可于常温下运输。

4-8℃密闭保存。

该试剂在4-8℃的条件下，可保持稳定至少12个月。

■ 质量控制：每批EndoFectin™ Lenti 均经过转染测试。

我们将eGFP 表达质粒(GeneCopoeia Catalog No. EX-EGFP-Lv01)用EndoFectin™ Lenti 转染试剂转入subconfluent HEK-293 细胞。

转染16小时后，超过95%的细胞表达eGFP 。

■ 实验开始前的注意事项：质粒的质量：请务必使用高质量转染级无内毒素的质粒。

通过260nm 光吸收测定DNA 浓度，260nm/280nm 比值确定DNA 纯度（比值应该在1.8~2.0的范围之内）。

如有可能，请通过琼脂糖凝胶电泳检测质粒的完整性。

细胞的条件：使用适当保存和经常传代的健康细胞。

确保培养基没有被细菌，真菌或支原体污染。

如果细胞是近期复苏的液氮冻存细胞，请在转染前至少传代两次。

■ 瞬时转染方法：1. 接种细胞1转染前一天，用胰酶消化细胞并计数。

调整细胞浓度，将细胞铺入细胞培养的器皿，总体积如表1所示。

每个孔置入的细胞量应能使转染时细胞汇合度达到70~80%。

DNA转染细胞的操作方法及步骤脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层，又称为人工生物膜。

阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹入内，形成DNA—脂复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用，偶尔也通过直接渗透作用，DNA传递进入细胞，形成包涵体或进入溶酶体。

其中一小部分DNA能从包涵体内释放，并进入细胞质中，再进一步进入核内转录表达。

Lipo2000是最常见的广谱脂质体转染试剂，以其操作简单、转染效率高、对细胞毒性较低等优点，在各大高校实验室、研究所等都得到广泛的使用。

下面将以24孔板对应用量为例，简单介绍DNA转染哺乳动物细胞的操作方法。

1. 实验用品1.1 主要试剂：Lipofectamine™ 2000 Transfection Reagent （Invitrogen 11668019）Opti-MEM® I Reduced Serum Medium（Gibco 31985-062）1.2 主要耗材：无菌枪头，一次性移液管，1.5mL EP管，15 mL离心管，细胞计数板，24孔板2.实验操作2.1 细胞准备1) 贴壁细胞：转染前一天，在500μL无抗生素的培养基中接种细胞，约0.5-2×105个/孔。

2) 悬浮细胞：转染前一天，在500μL无抗生素的培养基中接种细胞，约4-8×105个/孔。

2.2 DNA—脂复合体配制1) 准备两支1.5mL EP管（标记管1和管2），加入50μL Opti-MEM® I 低血清培养基（如无，可使用其他无血清培养基代替）。

2) 取1 μg目的质粒（DNA），加入管1稀释，轻轻混匀。

3) 充分吹打混匀Lipofectamine™ 2000原液管，按照DNA（μg）与Lipo（μL）添加比例1:2-1:3，取2-3μL Lipo悬液加入管2稀释混匀，室温下静置5min。

Entranster转染试剂的成分和原理
Entranster TM系列转染试剂由纳米高分子聚合物组成，分子内含有许多氨基，在生理PH下会发生质子化，这些质子化的氨基可以中和DNA质粒表面的负电荷，使DNA 分子由伸展结构压缩为体积相对较小的DNA粒子，并包裹在其中，使DNA免受核酸酶的降解。

转染复合物主要是通过细胞内吞作用将DNA 转移进入细胞，形成内含体(endosome)，DNA从内含体释放，进入细胞质中，再进一步进入核内转录、表达。

通过纳米技术生产出的转染试剂在纳米尺度表现出结合保护DNA能力强、毒性低的独特性能。

轻松进行动物体内基因过表达实验(Entranster-in vivo)动物体内DNA转染试剂Entranster-in vivo DNA，轻松进行DNA体内转染，实现基因过表达，蛋白功能检测等的实验，3天可得出结果，下面以12.5μg的核酸与25μl转染试剂，总注射体积100μl，20g小鼠尾静脉注射为例说明。

局部注射不用稀释，直接根据需要把核酸和转染试剂混合即可使用。

1. 核酸的稀释。

将12.5μg核酸用适量无内毒素纯水稀释成1μg/μl(如核酸原液浓度小，注射体积会增大)，加入12.5ul的水，再加入10%葡萄糖溶液(w/v)25μl，终体积50μl，充分混匀。

2. 转染试剂的稀释。

取25μl的EntransterTM-in vivo试剂用25μl 的10%葡萄糖溶液稀释，终体积为50μl，充分混匀。

3. 转染复合物形成。

立即将稀释后的转染试剂加入到稀释后的核酸溶液中，充分混匀。

4. 室温静置15分钟。

配制好的转染复合物请即配即用，不宜长期存放。

5. 动物注射。

说明：1).尾静脉注射时请掌握注射技巧，一般选用远端1/3处静脉注射，如感觉到较强阻力，请停止注射，重新寻找静脉进行操作，不要强力推注，否则容易将药液注射在尾部，导致尾部溃烂。

注射完成后移去针头，按压针孔10秒以上，防止药液流出。

2).0.625mg/kg的给药剂量是起始给药剂量，如果动物可以耐受，可以按比例增加剂量；如果动物不能耐受，可以适当同比例减少剂量。

3).局部注射，尽可能多注射药液，有利于提高转染效果。

6. 基因表达检测。

一般来说，根据注射方法和靶器官的差异，12-48小时后基因表达效果较好。

7. 长期给药。

一次给药检测的最佳时间是注射后12-48小时。

如果需要维持长期效果，可以采用多次注射的方法，注射频度一般为每间隔2-3天一次，也可以根据实验情况适当延长至每7天一次。

感谢您的阅读，祝您生活愉快。

GenEscort TMⅡ操作步骤贴壁细胞转染(以24孔板转染为例)• 1 μg DNA质粒稀释于50 μl 不含血清和抗生素的培养基中，轻轻混匀。

注: PBS (pH 7.4) 缓冲液，即前述细胞培养室常用的PBS 以及opti MEM (Invitrogen) 也能用于稀释DNA和转染试剂。

• 2 μl GenEscort TMⅡ稀释于50 μl 不含血清和抗生素的培养基中，轻轻混匀。

注: PBS (pH 7.4) 缓冲液，即前述细胞培养室常用的PBS 以及opti MEM (Invitrogen) 也能用于稀释转染试剂和DNA。

• 50μl GenEscort TMⅡ稀释液滴加到50 μl DNA稀释液中，轻轻混匀, 室温孵育10-15 分钟，从而获得100 μl GenEscort TMⅡ/DNA 复合物。

为简化操作，在充分注意及时混匀的前提下，前面几步可以合并为一步完成：将1 μg DNA 质粒稀释于100 μl 不含血清和抗生素的培养基或PBS中，轻轻混匀，然后加入2μl GenEscort TMⅡ后立刻混匀，室温放置10-15 min，获得100μl 转染复合物。

注意！: 两种溶液的混合顺序对转染结果非常重要，切勿颠倒顺序。

同时室温孵育时间最好不超过20分钟，然后立即加入到培养基中。

通常将孵育10-15 分钟后GenEscort TMⅡ/DNA 复合物与培养基在EP管中混合后再加入每孔中转染效果更好。

• 100μl GenEscort TMⅡ/DNA复合物滴加到每孔中并轻轻摇动使其与新鲜的培养基均匀混合。

注: 接种细胞的0.5 ml - 1 ml 的培养基，在进行转染时已经24小时了，如果已经发黄，最好在转染时更换为新鲜的培养基。

•把细胞放置在37℃，CO2孵育箱孵育24-48小时后，分析报告基因转染效率。

悬浮细胞转染为了提高转染效率可以首先使用低细胞培养液总体积（见表 1细胞培养液总体积的下限或更低一些），转染2-3 h 小时后补加一倍的含血清细胞培液。

GenEscort TMⅠ使用说明一．产品介绍GenEscort TM I是针对一些常用贴壁细胞设计的经济型产品，该试剂由一种不可降解的分枝状PEI衍生物与其它组分复合而成。

对绝大多数贴壁细胞系具有较高的转染效率，特别适用于各种常规细胞如 293，CHO，COS，A549，LLC，B16F10等细胞的转染。

可进行寡核苷酸和siRNA 运送。

也能用于体内的动物实验。

GenEscort TM I与传统的脂质体相比无论在转染效果和实验操作上都有明显的优势，主要表现为：●经济实惠，适用于大多数常用的贴壁细胞系。

●转染效率高，细胞毒性低。

●使用较少的DNA量即可获得高的转染效率。

●培养基可含或不含血清，可以用PBS或不含血清的培养基稀释DNA进行转染，转染过程中不需换液。

●转染方法操作简单，转染过程快速。

●转染的重复性好，可进行寡核苷酸和siRNA运送。

●需要较少的转染条件优化二．运输与储存运输：常温储存：2－8℃一年；－15℃至―20℃二年以上三．转染前的准备与注意事项1．细胞接种为了取得较高的转染效率，推荐使用在50代以内的细胞进行转染实验。

要求在转染前24小时对细胞再次传代，在培养基中加入抗生素对转染效果没有影响。

转染时细胞密度一般应为60-80%，但这因细胞株的不同而变化，对最常用的细胞株建议细胞密度为70-90%。

以24孔板的转染为例，最理想条件是在转染前24小时，每孔接种(500 µl )0.5－2×105个细胞。

在大多数情况下，如果在细胞贴壁后(接种几小时后)即进行转染，也可以得到相近的结果。

表1列举了不同细胞培养装置的推荐细胞数量。

2．DNA的质量为了取得较高的转染效率，推荐使用高纯度的质粒。

仅仅根据DNA电泳条带的情况估计DNA的量和纯度是不够准确的。

建议对提取的质粒DNA的量和纯度进行检测，DNA含量(μg/mL)=50 × (260 nm的读数) ×稀释倍数，通过检测质粒DNA在260nm和280nm的OD 值的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度，OD260/OD280值应该≥1.8。