肾小管上皮细胞培养

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810952148.3(22)申请日 2018.08.21(71)申请人 华中科技大学同济医学院附属同济医院地址 430030 湖北省武汉市解放大道1095号(72)发明人 曾锐　徐虎子　邓旋　赵志　(74)专利代理机构 北京一格知识产权代理事务所(普通合伙) 11316代理人 赵永伟(51)Int.Cl.C12N 5/071(2010.01)(54)发明名称一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基(57)摘要本发明涉及一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基，该培养基由以下各原料混合而成：500 mL DMEM/Ham ´s F12培养基、两性离子缓冲液5mL、胎牛血清50mL、庆大霉素500uL、两性霉素B 500uL、表皮生长因子50uL、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂50uL和激素混合物5mL。

本发明还提供了使用上述培养基提取及培养高纯度原代肾小管上皮细胞的方法。

有益效果为，采用本发明的高选择性的培养基，可提取及培养出纯度高达92%以上的小鼠原代肾小管上皮细胞，培养得到的高纯度原代肾小管上皮细胞是研究急性肾损伤或慢性肾脏病损伤机制的较好工具细胞。

权利要求书1页 说明书3页 附图2页CN 109022350 A 2018.12.18C N 109022350A1.一种培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的培养基，其特征在于，由以下各原料混合而成：500 mL DMEM/Ham ´s F12培养基、两性离子缓冲液5mL、胎牛血清50mL、庆大霉素500uL、两性霉素B 500uL、表皮生长因子50uL、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂50uL和激素混合物5mL。

2.根据权利要求1所述的一种培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的培养基，其特征在于，所述激素混合物由以下各原料混合而成：HBSS缓冲液28.5mL、两性离子缓冲剂0.5mL、前列腺素E2 1mL、 Trijod -Thyronine 5mL、氢化可的松5mL和肾上腺素5mL。

肾小管上皮细胞肾脏是人体重要的排泄器官，承担着调节体液平衡、排泄代谢产物等重要功能。

其中，肾小管是肾脏负责调节尿液成分和浓度的重要结构。

在肾小管中，肾小管上皮细胞起着至关重要的作用。

肾小管上皮细胞的功能肾小管上皮细胞是肾小管的主要细胞类型，其主要功能包括：1.吸收和分泌物质：肾小管上皮细胞通过细胞膜上的通道蛋白和转运蛋白，调节尿液中各种物质的进出，保持体液的稳定性。

2.酸碱平衡：肾小管上皮细胞参与调节体液的酸碱平衡，保持血液的PH值在正常范围内。

3.水和电解质的重吸收：肾小管上皮细胞通过调节水和电解质的重吸收，控制尿液的浓缩和稀释，以保持体内水分的平衡。

4.分泌代谢产物：肾小管上皮细胞还可以分泌代谢产物和药物，帮助排泄体内废物。

肾小管上皮细胞的结构肾小管上皮细胞具有特殊的结构和功能，主要包括：1.微绒毛：肾小管上皮细胞表面覆盖着微绒毛，增加细胞的表面积，有利于吸收和分泌物质。

2.紧密连接：肾小管上皮细胞之间有紧密连接，形成了密封的屏障，阻止尿液中物质的非特异性扩散。

3.基底膜：肾小管上皮细胞下方有基底膜支持，稳固细胞结构，有利于细胞的功能发挥。

4.细胞器：肾小管上皮细胞内含有丰富的线粒体、内质网等细胞器，能够提供能量和合成所需的蛋白质。

肾小管上皮细胞的生理调节肾小管上皮细胞的功能受多种生理调节因素影响，主要包括：1.激素调节：肾上腺素、抗利尿激素等激素能够调节肾小管上皮细胞的水和电解质重吸收。

2.神经调节：交感神经和肾上腺髓质素能够通过神经递质的释放，影响肾小管上皮细胞的功能。

3.渗透压调节：体液中的渗透压变化能够影响肾小管上皮细胞对水和电解质的调节。

肾小管上皮细胞与疾病肾小管上皮细胞在多种肾脏疾病中扮演重要角色，包括：1.肾小管功能障碍：肾小管上皮细胞受损或功能异常会导致尿液稀释和浓缩能力下降，引起多尿或少尿等症状。

2.肾小管间质疾病：某些疾病如肾小管间质性肾炎会累及肾小管上皮细胞，损害肾小管结构和功能。

收稿日期:2017-12-28基金项目:国家自然科学基金项目(21675017);中央高校基本科研项目(DUT17LK25)第一作者:曲玥阳(1988-),女,博士研究生,从事肾脏器官芯片研究,E-mail :yyqu@通信作者:罗勇(1978-),男,博士,副教授,从事器官微流控芯片研究,E-mail :yluo@原代肾小管上皮细胞的提取和培养方法的优化曲玥阳1,陈旭2,岳喜庆2,罗勇1,赵伟杰1,林炳承1(1.大连理工大学制药科学与技术学院/精细化工重点实验室,辽宁大连116023;2.沈阳农业大学食品学院,沈阳110161)摘要:为建立理想的研究农药中毒性肾病体外细胞模型,系统考察了原代肾小管上皮细胞提取和培养的一系列关键因素,经过优化组合,提出了一种更为高效实用的原代肾小管上皮细胞提取和培养方法。

通过显微镜明场观察肾小管节段组织形态和纯度,研究0.1%的Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、Ⅴ型胶原酶在15min 和3h 的时候对组织的消化情况以及Ⅱ型胶原酶作用0min,8min,15min,40min,1h,3h 时组织消化情况。

利用MTT 比色法考察了鼠尾I 型胶原,层粘连蛋白,基质胶对培养皿的包被情况对细胞增殖速率的影响,利用MTT 比色法考察不同浓度的血清对细胞增殖速率以及细胞活性维持的影响,细胞免疫荧光法考察不同浓度血清对肾小管上皮细胞的Na +/K +ATPase 表达的影响。

结果表明:利用Ⅱ型胶原酶,消化15min 可以获得较好的肾小管节段;利用基质胶包被培养皿是性价比最高的促进肾小管上皮细胞增殖的条件;观察到在细胞增殖期内,1%,2%,4%的血清浓度较0%和5%有较好的促进细胞增殖作用;在平台期内,2%,4%,5%的血清浓度较0%和1%有较好的细胞活性维持作用;第3天时,2%血清浓度培养的肾小管上皮细胞的Na +/K +ATPase 表达最强;第14天时,1%和2%血清浓度培养的细胞的Na +/K +ATPase 表达较好,最终确定血清最优浓度为2%。

正常人肾脏近球小管上皮细胞（RPTEC）的培养方法拆装与贮存1.检查所有容器是否漏液或破损。

2.对于冻存细胞：将细胞冷冻管从干冰中取出并迅速放入液氮中贮存。

或者，解冻并立即培养。

3.对于增殖细胞：用70%的乙醇或异丙醇擦洗盛有细胞的培养皿，将细胞培养皿置于培养箱（如不特殊说明，均为37℃，5% CO2）中3到4个小时。

细胞处于平衡状态后，除去运送时的培养基并更新。

4.Bulletkit®使用说明：送达后，在无自动除霜功能的冰箱中4-8℃下冷藏保存基础培养基，-20℃下冷冻保存SingleQuots®细胞生长因子。

如送达后已经解冻，生长因子可在4℃下冷藏，并需要在72小时之内加入基础培养基中。

加入基础培养基后，在一个月之内使用，不要再次冷冻。

5.ReagentPack TM传代试剂在运送前已经过无菌过滤在-20℃下保存。

传代试剂在运送过程中可能会解冻。

可以进行一次再冷冻。

如果在3天之内使用，可以在4℃下冷藏。

Trypsin/EDTA溶液的保存时间有限并会在4℃下活化。

如果在送达之后出现解冻，立即分装并在-20℃下冷冻。

建议HEPES缓冲液（以下简称HEPES）和Trypsin中和液不要在4℃下冷藏超过一个月。

注意：为保持解冻后的Trypsin/EDTA的新鲜和活性，可将其按20ml分装并置于消毒的离心管中，-20℃下再次冻存。

培养基的制备1.用乙醇或异丙醇对所有的添加剂管瓶及装有培养基的试剂瓶消毒。

2.用移液管将全部的添加剂加入培养基中。

3.用培养基冲洗添加剂管瓶。

对于每瓶添加剂，可能会有少量残存未被移取。

少量的残存，即使10%，也不会显著影响在含有添加剂培养基中的细胞生长。

4.将添加剂管瓶上的标签撕下并贴于培养基的试剂瓶上。

以此记录每种添加剂加入的时间和含量。

建议将全部标签贴于培养基试剂瓶上（不要将培养基的批号及有效期覆盖）以避免混淆和重复添加。

细胞解冻/起始培养1.RPTEC(Renal Proximal Tubule Epithelial Cell，肾脏近球小管上皮细胞)的建议接种密度为2500 cells/cm2。

肾小管上皮细胞分离实验研究-细胞生物学论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——目前大量关于肾的毒理学、药物测试等研究需要肾小管上皮细胞株。

但是，细胞株部分基因的变异或缺失与正常细胞存在差异，原代细胞在表达正常细胞生理状态下则更显优势[1],因此寻求一种有效的肾小管上皮细胞的原代培养尤为重要。

目前多篇文献[1-7]对肾小管上皮细胞的原代培养都有各自见解，本实验将其简化并加以改良，在文献的基础上[2]优化实验条件，寻找经济材料以及合适的浓度以获得大量良好的肾小管上皮细胞。

在试验中发现将第一次细胞换取液可再次利用，仍有大量高纯度的肾小管上皮细胞贴壁且贴壁良好。

1 材料与方法1.1 材料实验动物：SD 大鼠，雄性，4~5 周龄（徐州医学院实验动物中心）；昆明小鼠，4~5 周龄（徐州医学院实验动物中心）。

1.2 主要试剂胎牛血清（杭州四季青），DMEM-F12 1:1 培养基（Thermo），Ⅰ型胶原酶（美国Sigma），胰酶消化液，双抗（青霉素-链霉素溶液100），兔抗人角蛋白CK18（Bioss），SABC 免疫组化染色试剂盒（博士德生物），DAB 显色试剂盒（博士德生物）。

1.3 试验方法1.3.1 肾小管节段分离大鼠和小鼠实验前均禁食12 小时，进水自由。

脱臼，75% 乙醇中浸泡5min.在超净台中取出肾，置于冷的含双抗的PBS 溶液中，去除肾蒂和包膜，将肾皮质剪碎大小至1mm3,PBS 洗涤3 次后，放置80 目不锈钢筛网上，用50ml灭菌注射器柄轻轻研磨，PBS 液充分清洗后的网下液转移至100 目不锈钢筛网中，将100 目筛网倒置PBS 冲洗取网上液。

取得的液体经1500r/min 离心8min,弃去上清液在沉淀中加入Ⅰ型胶原酶，分别37Ⅰ振荡消化，振荡消化时间分三组，分别为20min,25min,30min.双倍体积DMEM-F12 培养基中和后，1500r/min 离心8min.1.3.2 肾小管上皮细胞的原代培养及传代在上述离心后的沉淀中加入含10% 胎牛血清的DMEM-F12 培养基，轻轻吹打混匀。

小鼠肾小管上皮细胞的培养和鉴定
小鼠肾小管上皮细胞的培养和鉴定可以通过以下步骤进行：
1. 准备培养基：根据实验需要选择适当的培养基，常用的包括DMEM/F12和MEM（有或无血清），并添加适当的生长因子和抗生素。

2. 提取小鼠肾小管上皮细胞：将小鼠肾脏取出，去除皮质并切成小块，用酶（如胰蛋白酶）消化去除细胞外基质，然后经过筛网过滤获得单细胞悬浮液。

3. 细胞培养：将细胞悬浮液转移到预先准备好的培养基中，调整细胞密度后在培养皿中孵育。

培养条件一般为37℃、5% CO2含量的无菌培养箱。

4. 细胞培养的维护：每两天更换培养基并观察细胞数量和形态的变化。

细胞密度达到80-90%时，可以进行细胞分裂和次级分化。

5. 细胞鉴定：通过免疫细胞化学染色、细胞形态学观察、细胞特异性基因表达以及细胞功能的分析等多种方法，来确定细胞的特异性。

这些步骤可以帮助研究人员成功地培养和鉴定小鼠肾小管上皮细胞，为进一步的细胞和分子生物学研究提供基础。

新生山羊肾小管上皮细胞的原代培养与鉴定向华;张彦明;程媛媛;康恺;杨幼聪【摘要】[目的]建立新生山羊肾小管上皮细胞(Renal tubular epithelialcell,RTECs)的分离培养方法.[方法]采集刚出生未哺乳健康山羊的肾脏,分别采用胶原酶Ⅰ和胶原酶Ⅳ消化法分离培养RTECs,选择孔径0.15 mm的筛网对RTECs进行纯化,观察各组RTECs的生长情况;对分离的RTECs进行免疫组化和碱性磷酸酶染色鉴定,并进行透射电镜观察;用流式细胞仪检测RTECs的增殖周期和凋亡情况.[结果]胶原酶Ⅳ对RTECs的消化效果优于胶原酶Ⅰ,所得的细胞团块多,纯度高,细胞生长快,经孔径0.15 mm的筛网过滤后,RTECs的纯度达95%以上,并可连续传至第12代.分离获得的细胞经免疫组化法和碱性磷酸酶染色法鉴定呈阳性;透射电镜观察显示,细胞表面有微绒毛和桥粒连接.用流式细胞仪检测的结果显示,第4代新生山羊RTECs中G1期和S期细胞分别占细胞总数的25.01%和74.99%,G2/G1为1.97%,第10代细胞中G1期细胞和S期细胞均占50.00%,G2/G1为1.88%;第4代细胞的早期凋亡率在0.32%左右,而第10代可达3.7%,远高于第4代细胞.[结论]建立了增殖快、细胞活力高的山羊RTECs分离培养方法.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2011(039)004【总页数】6页(P1-6)【关键词】新生山羊肾小管上皮细胞;原代培养;酶消化;纯化【作者】向华;张彦明;程媛媛;康恺;杨幼聪【作者单位】西北农林科技大学,动物医学院,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学,动物医学院,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学,动物医学院,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学,动物医学院,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学,动物医学院,陕西,杨凌,712100【正文语种】中文【中图分类】Q813.1+1人和多种动物的肾小管上皮细胞系已经建立，细胞在体外能够无限增殖，这为研究肾小管的生理和病理提供了材料[1-2]。