病毒学检验

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病毒的特点是:1、形体微小,能通过细菌滤器,用电子显微镜才能观察到。2、无细胞结构,其主要成分是核酸和蛋白质3、每种病毒只含有一种类型的核酸(RNA或DNA)4、因缺乏完整的酶系统和能源,故只能寄生于活细胞内,依靠宿主细胞的代谢系统合成蛋白质和核酸5、病毒以其基因为模板,在宿主细胞内复制出新的病毒颗粒6、为了在生物界保存其种属,病毒具备从一个宿主转移到另一个宿主的能力,并具有对敏感宿主的侵染性和复制性7、在宿主体外,能以大分子状态存在,并可长期保持其侵染能力8、有些病毒的核酸能整合到宿主细胞的基因组中,并能诱发潜伏感染

细胞培养技术:是对由组织分散成的单个细胞或某一型细胞群进行的体外培养方法,即模拟体内的生理环境条件,提供细胞适宜的营养条件和温度,在无菌操作的基础上,使离体组织细胞生长增殖并进行传代的技术

二、单层细胞培养:

用于培养病毒的细胞有原代细胞、传代细胞(二倍体细胞株和传代细胞系)

三、鸡胚的接种途径:1、羊膜腔接种2、绒毛尿囊膜接种3、尿囊腔接种4、卵黄囊接种

四、

间接计数在病毒检验过程中较为常用,是判定病毒感染性的定量方法,常用的有:空斑形成单位法,50%终点法,血凝试验和干扰测定

空斑形成单位(PFUs)试验:是将不同稀释倍数的动物病毒与平铺于平板表面的宿主细胞混合,当病毒颗粒在一大片宿主细胞上引发感染时,会造成细胞被溶解而形成空斑,每个空斑系由一个病毒颗粒所造成,计算空斑数目再乘以稀释倍数,即可得知原来的病毒感染单位的浓度

凡事能在细胞培养物中产生CPE的病毒都可用空斑技术来测定其滴度。

50%终点法:是将病毒悬浮液经一系列稀释后,接种至动物、鸡胚或培养成单层的细胞,将每个稀释度造成的动物、鸡胚致死量或细胞病变做曲线,找出造成50%动物、鸡胚死亡或病变的终点稀释度。

LD50:为造成50%动物或鸡胚死亡的病毒含量

ID50:即是指可造成50%动物或鸡胚感染的剂量

CCID50:造成50%细胞培养产生病变效应的剂量

五、病毒纯化的一般原则:1、释放病毒至细胞外2、去除细胞碎块3、病毒悬液浓缩

六、病毒的保存:1、用低温(-60~25℃)、超低温(-70以下)冰箱或液氮罐(-196~150)保存

2、冷冻干燥保存

七、血清学实验的方法很多,最常用的是中和试验、补体结合试验、红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验

中和试验:是在体外适当条件下孵育病毒与特异性抗体的混合物,使病毒与抗体相互反应,再将混合物接种到敏感的宿主体内,然后测定残存的病毒感染力的一种方法。

中和抗体:凡是能与病毒结合,并使其失去感染力的抗体称为中和抗体

中和试验必须在敏感的动物体内(包括鸡胚)和细胞培养中进行

中和试验所用的病毒应是具有感染力的病毒。用于中和试验的病毒必须先进行病毒滴度的测定

中和试验中,通常以100TCID50/单位体积或100LD50/单位体积作为标准的病毒试验浓度

八、

血凝试验(HA):有些病毒和病毒表面的血凝素能引起人或某些哺乳动物的红细胞发生凝集,这就是所谓的红细胞凝集现象

血凝抑制试验(HAI):血清中血凝素抗体能够与病毒血凝素分子的抗原位点特异性结合,干扰病毒血凝素与红细胞上受体的结合过程,从而抑制红细胞凝集。

HA和HAI应用:1、发现和鉴定病毒2、用于临床病原学诊断3、病毒型或亚型鉴定4、免疫机体后抗体效价的测定5、病毒抗原变异分析等

九、

病毒的分离和鉴定:是指从病人、带菌者、外环境中采集标本经过适当的处理,采用一系列物理化学生物学等手段,将病毒从标本中分离出来,并通过有关特异性方法鉴定属何种病毒,这一类方法称为病毒的分离与鉴定。

十、标本的采集:1、从病原体入侵部位取材2、从病原体感染的靶器官取材3、根据病原体的排泄途径取材4、从环境中采集标本时,则应根据目的,参考病原体可能存在的环境,传播途径采集标本

十一、病毒的分离方法:细胞培养法、鸡胚接种法、动物接种法

十二、病毒的鉴定:

初步鉴定:1、根据临床表现、流行病学特征与标本来源

2、生物学特性:细胞病变效应、血吸附和血凝作用、干扰现象、理化特性、接种动物的观察最终鉴定:1、血清学与免疫学方法:中和试验、血凝抑制试验、免疫荧光试验、酶免疫学试验2、病毒基因的鉴定:PCR技术,核酸分子杂交技术、核酸序列分析

3、电子显微镜技术:超薄切片电子显微镜技术、负染电子显微镜技术、免疫负染电子显微镜技术、免疫超薄切片电子显微镜技术

十三、病毒感染的早期诊断技术

1、对潜伏期较短的病毒,由于机体未能对感染的病毒产生相应地抗体,因此应选择检测病

毒颗粒或病毒抗原及病毒核酸。对于潜伏期10天以上的病毒感染,可检测特异性IgM 抗体作为早期感染的指标。

2、IgM抗体是原发感染的证据,也是早期感染的证据

IgM检测:ELISA法、免疫荧光法

3、病毒特异成分的检测(1)核酸成分的检测:核酸杂交、PCR(2)奸恶感染材料中病毒

抗原成分:免疫荧光技术、酶免疫技术、ELISA、免疫胶体金技术(3)感染细胞中特征性包涵体的检测:核内包涵体、胞浆内包涵体、胞质内和胞核内包涵体

4、电镜或免疫电镜技术:负染标本电镜技术、免疫电镜技术

十四、痘病毒

痘病毒:是病毒界体积最大结构最复杂的DNA病毒

1、引起的疾病:天花、猴痘、牛痘、传染性软疣

2、天花的传播途径为空气飞沫传播,也可通过人-人接触或传播媒介进行传播

3、猴痘的主要传播途径是感染的动物咬伤人类或人类接触了感染动物的体液、分泌物和血

液而感染、人与人之间密切接触或吸入含病毒的飞沫和接触污染物业能干热该病

4、病毒的分离培养:鸡胚绒毛尿囊膜法、细胞培养法、实验动物法

十五、

1、疱疹病毒是一类中等大小、结构相似、有包膜的DNA病毒。

2、引起人类感染的疱疹病毒现有8个成员:HSV-1、HSV-2、VZV、HCMV、HHV-6、HHV-7、EBV、HHV-8

3、疱疹病毒感染特点可表现为:(1)显性感染,病毒增殖并破坏细胞,临床表现为急性感染或隐性感染;(2)病毒经原发感染后长期潜伏于体内,当机体抵抗力下降时常引起复发感染;(3)病毒基因常与细胞基因组整合,导致细胞转化,甚至癌变;(4)可发生宫内感染导致胎儿畸形。

4、致病:

HSV:疱疹性角膜炎、结膜炎、疱疹性脑炎(HSV-1)、生殖性疱疹(HSV-2)

途径:密切接触、空气飞沫、性交、接吻

VZV:原发感染形式是水痘、复发感染时带状疱疹

途径:直接接触、空气中飞沫气溶胶

HCMV:巨细胞包涵体病、先天性畸形、先天性感染

途径:垂直传播、水平传播、医源性感染

EBV:传染性单核细胞增多症、儿童淋巴瘤、鼻咽癌

途径:主要经唾液(如接吻)传播、偶尔也经过输血传播、飞沫不是主要途径

5、哪些疱疹病毒有潜在致癌作用?

对人或动物有较强的致癌作用的疱疹病毒有:①HSV-2,与宫颈癌发生有关;②CMV可能与宫颈癌、前列腺癌、结肠癌和Kaposi肉瘤等发生有关。③EBV与鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤的发生有密切关系。

2、HSV有两种血清型,分别是HSV-1 、和HSV-2 ;前者常引起唇疱疹,后者常引起生殖器疱疹。

3.HSV-1发生的原发感染主要引起龈口炎,HSV-2发生的原发感染主要引起生殖器疱疹。

4.CMV可通过输血感染,发生输血后单核细胞增多症和肝炎等病症。

5.EBV主要侵犯 B 细胞,也可感染上皮细胞。

6.VZV在儿童初次感染时引起水痘,在成年人常引起带状疱疹。

7.与EBV感染有关的疾病主要有三种,分别是传染性单核细胞增多症、非洲儿童恶性淋巴瘤和鼻咽癌。

8 疱疹病毒感染宿主细胞可表现为增殖性感染和潜伏性感染。

十六、乳头瘤病毒及检验

1、DNA病毒、无包膜

2、人乳头瘤病毒(HPV)只能感染人的皮肤和黏膜上皮细胞,引起皮肤黏膜异常增生,使

宿主组织发生疣状或乳头状瘤病变。通过性接触可导致生殖器肛门部位的感染,是尖锐湿疣或肛门生殖器疣的病原体。

3、HPV有严格的宿主和组织特异性、不产生病毒血症、不能再体外细胞中培养