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![病毒学实验技术 [病毒学,实验技术]](https://img.taocdn.com/s1/m/663906c25ebfc77da26925c52cc58bd63186938c.png)
病毒学实验技术 [病毒学,实验技术]病毒学实验技术病毒学实验技术目的要求通过实验掌握常用的病毒学实验技术和诊断方法。
操作步骤一、病毒诊断用病料的采集病毒分离用生物学材料的最理想的采集时期，是在机体尚未产生抗体之前的疾病急性期。
各种病料，例如血液、鼻咽拭子、粪、尿、脓汁、水泡液、皮肤病变、脊髓液和活体穿刺材料以及剖检时采取的组织，均可用于病毒分离。
每个具体疾病需要采取什么样的生物标本，可参考有关疾病的叙述，特别是其诊断部分。
有一些总的规则适用于病毒分离用的组织的正确选择。
呼吸道疾病在急性期，通常在鼻或咽分泌物排出病毒。
在痘病的水泡液中或痂皮内也可发现病毒。
许多全身性卡他性疾病具有病毒血症期，易于由血液中分离到病毒。
实际上急性发病期间，机体的所有分泌物中都含有病毒。
与中枢神经系统有关的疾病较特殊，但也可由血液或病死动物的脑内分离病毒。
采取组织标本时一个最为重要的注意事项，就是必须在动物死亡后立即进行--必要时可扑杀濒死动物，就更有利于病毒分离。
同时应采取该动物血液作血清学试验,在冰冻前必须先从全血中分离血清，因为溶血标本经常不再能做某些血清学试验。
各种病毒的生物物理学和生物化学特性明显不同。
许多病毒对热及酸敏感，故在采集材料时必须特别注意。
尤其是必须采取新鲜材料，并立即置-60℃至-70℃下冰冻。
此外，在用这些病料接种组织培养物或试验动物分离病毒时，时间尽量要短。
如无其他方法，可将组织标本低温冰冻后置-20℃保存，等待取来干冰后再贮藏和送往实验室。
将标本放入宽口保温瓶或以泡沫苯乙烯隔热的纸板盒内，再用冰充填，也可达到这一目的。
如果没有干冰，则可应用50%甘油;某些病毒在此种溶液中能比其他一些病毒存活更久。
将小块组织、粪或粘液装入小瓶内，再向瓶内注满50%甘油，并贮存于6℃。
组织标本应以无菌器械在无菌条件下采取。
如果想要了解组织中的病毒分布，则必须应用分开的器械采取每个组织。
经常应用紧盖的灭菌旋帽瓶子贮存可疑的组织和液体。
病毒技术实验报告病毒技术实验报告病毒技术是一门研究病毒及其应用的学科，它涉及到病毒的结构、功能、传播途径以及对宿主细胞的影响等方面。
在现代生命科学中，病毒技术的应用非常广泛，不仅可以帮助我们更好地理解病毒的生物学特性，还可以用于疾病的诊断、治疗以及基因工程等领域。
首先，我们来了解一下病毒的基本结构和功能。
病毒是一种非细胞生物，由核酸和蛋白质组成。
病毒的核酸可以是DNA或RNA，而蛋白质则包裹着核酸形成病毒颗粒。
病毒无法自主进行代谢活动，需要寄生在宿主细胞内才能进行复制。
病毒通过感染宿主细胞，将自己的遗传物质注入宿主细胞内，利用宿主细胞的机制来复制自身。
这种感染方式使得病毒能够利用宿主细胞的资源来完成自己的生命周期。
在病毒技术实验中，我们可以利用病毒的特性来进行疾病的诊断和治疗。
例如，病毒载体可以被用作基因传递工具，将特定基因导入宿主细胞中，用于基因治疗。
此外，病毒还可以用于制备疫苗。
疫苗是一种通过引入病毒或病毒相关的成分来刺激免疫系统产生抗体的方法，从而提高人体对某种疾病的免疫力。
通过对病毒进行适当的处理和改造，可以制备出安全有效的疫苗。
除了在医学领域的应用，病毒技术还在基因工程中发挥着重要作用。
基因工程是一种通过改变生物体的遗传物质来实现特定目的的技术。
病毒可以作为基因传递工具，将外源基因导入宿主细胞中，从而改变宿主细胞的性状。
这种方法被广泛应用于农业、工业以及生物制药等领域。
例如，通过将某种抗虫基因导入作物中，可以提高作物对虫害的抵抗力，减少农药的使用。
此外，病毒还可以用于生物制药中的药物生产，通过利用病毒的复制机制来大量生产药物。
然而，病毒技术的应用也存在一定的风险和争议。
一方面，病毒的复制能力和传播性使得病毒技术在实验室中的操作需要严格的控制和安全措施，以防止病毒的泄漏和传播。
另一方面，病毒的应用可能会引发伦理和道德上的争议。
例如，基因工程领域的研究可能涉及到对人类胚胎的基因编辑，这引发了关于人类基因改造的伦理争议。
病毒学研究中的实验技术病毒学是研究病毒性疾病的科学。
病毒性疾病的病原体是病毒，而病毒无法自行进行代谢活动，必须寄生在宿主细胞内完成其生命活动，因此病毒性疾病是难以治愈的。
病毒学家通过从分子层面研究病毒的结构、生命周期和致病机制等方面，探究病毒感染机制和防治策略。
但是病毒性疾病的研究需要大量的实验技术支持，下面介绍一些病毒学研究中常用的实验技术。
一、细胞培养技术病毒感染的第一步是入侵宿主细胞，因此病毒学研究中不可避免地涉及到细胞培养技术。
细胞培养技术是把生物组织或细胞通过培养基、营养物质等条件模拟人体内环境来培育或生长。
常用的细胞培养技术包括原代细胞培养、细胞系培养和三维细胞培养。
原代细胞培养是将组织切碎后通过酶的作用将细胞分离培养，有原始细胞的特点；细胞系培养是通过连续传代保留的一种相同的细胞群体，细胞系一般在细胞数目增高到一定阶段会停滞不生长，从而要定期传代；三维细胞培养则是将细胞以3D结构的形式培养，可以模拟更接近真实环境的细胞生长。
二、病毒制备技术病毒制备技术是研究病毒性疾病的基础。
制备好的病毒才能在实验中进行感染、药物筛选等研究。
病毒制备技术不同于普通的细胞培养技术，主要包括以下步骤：选择适宜的病毒感染细胞、制备病毒原液、病毒上清的浓缩、纯化和滤过等。
在实际制备中，还需要时刻注意环境卫生和安全控制等因素，保证实验和研究的可行性和可靠性。
三、病毒感染实验技术病毒感染实验技术是研究病毒性疾病的核心。
病毒感染实验技术主要包括病毒感染模型建立、病毒感染实验的设计、病毒感染后的分析与诊断等。
在病毒感染实验中，常常使用到Green Fluorescent Protein (GFP)、Luciferase、β-galactosidase等荧光物质和化学指标来评估病毒感染情况和细胞的生长状态。
此外，病毒感染实验中还会运用到PCR、Western blot等分子和蛋白质分析技术来探究感染机制和影响。
四、病毒抗原与抗体的检测技术病毒的抗原与抗体检测是病毒学研究的重要环节。
实验一病毒对细胞的感染目的：病毒对细胞的感染具有高度的特异性，通过该实验掌握病毒感染细胞的实验操作，并进一步理解病毒对宿主细胞的选择性。
材料：杆状病毒Sf9细胞器材：25或50mL细胞培养瓶，28℃恒温培养箱，培养基，无菌移液管，电动移液器步骤：1、感染前12h传代接种Sf9细胞，28℃培养至汇聚度约70%；2、弃细胞培养液，并以1×PBS洗涤2-3次，吸干残夜；3、加入适量病毒悬液，并补充适量无血清培养基，28℃孵育2h，更换适量新鲜培养基；同时设立空白对照；4、28℃培养24-48h，对照观察细胞病变。
实验二病毒的扩增与收集目的：病毒属于严格细胞内寄生生物，故只能在其敏感宿主细胞内进行有效增殖。
通过该实验掌握病毒的扩增及收集、储存方法。
材料：杆状病毒Sf9细胞器材：25或50mL细胞培养瓶，28℃恒温培养箱，培养基，无菌移液管，电动移液器、低温高速离心机、离心管，滤器步骤：1、感染前12h传代接种Sf9细胞，28℃培养至汇聚度约70%；2、弃细胞培养液，并以1×PBS洗涤2-3次，吸干残夜；3、加入适量病毒悬液，并补充适量无血清培养基，28℃孵育2h，更换适量新鲜培养基；4、28℃培养24-36h，观察细胞裂解情况；5、吹吸细胞，并转移细胞裂解物至无菌冰预冷离心管；6、4℃，12000rpm,10min，取上清；7、滤器过滤上清，取滤液，分装于无菌冻存管，避光保存于4℃或-20℃或-80℃.实验三病毒的敏感性测定目的：不同类型的病毒对不同理化因子的敏感性存在着显著差异。
本实验拟检测杆状病毒对高温及有机溶剂的敏感性，以加深对病毒理化因子敏感性差异的理解。
材料：杆状病毒Sf9细胞乙醚氯仿器材：25或50mL细胞培养瓶，28℃恒温培养箱，培养基，无菌移液管，电动移液器，水浴锅步骤：1、氯仿预处理：于一定量病毒悬液中加入终浓度为5%的氯仿，混匀，4℃静置1h，2000rpm，10min，取上清备用；同样，取等量病毒不加氯仿于4℃同样处理备用（空白对照）；2、乙醚预处理：于一定量病毒悬液中加入终浓度为20%的乙醚，混匀，4℃静置1h，2000rpm，10min，取下层备用；同样，取等量病毒不加乙醚于4℃同样处理备用（空白对照）；3、高温预处理：取一定量病毒悬液于55℃处理30min后备用；同样，取等量病毒于4℃处理30min备用（空白对照）；4、分别取适量经氯仿、乙醚、高温处理及未处理的病毒悬液感染Sf9细胞；5、28℃培养24-48h，对照观察细胞感染效率。
常规病毒学实验技术（一）病毒的培养实验动物：家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠主要用于：①分离病毒，并借助感染范围试验鉴定病毒②培养病毒，制造抗原和疫苗③测定各毒株之间的抗原关系，（用实验动物作中和试验和交叉保护实验）④制备免疫血清和单克隆抗体⑤作病毒感染的实验研究，包括病毒毒力测定、建立病毒病动物模型等注意：选择对目的病毒敏感的实验动物品种品系，以及适宜的接种途径和剂量。
鸡胚（一）条件要求SPF鸡、孵化温度38-39℃，湿度40-70%，通风。
新鲜受精卵：产下后不超过10天并保存10℃左右。
（二）优点组织分化程度低，可选择不同的日龄和接种途径，病毒易于增殖，感染病毒的组织和液体中含有大量病毒，容易采集和处理，而且来源充足，设备和操作简便易行。
（三）接种途径1．绒毛尿囊膜接种（10-12日龄鸡胚）主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。
1）方法一（造人工气室）①在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm的烤焦圈。
②用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳，造成卵窗。
③在气室端中央钻一个小孔。
④用针尖挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜。
⑤滴加滴生理盐水于刺破处，用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成气室内负压，使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理盐水迅速渗入。
⑥用1ml注射器滴入2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。
⑦用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的小孔用石蜡密封。
⑧鸡胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。
2）方法二①在气室端的卵壳上开约1.5×1.5cm的口。
②用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜。
③滴入接种物。
④用透明胶纸封闭开口。
2．尿囊腔接种（10-11日龄）用于正粘病毒和副粘病毒（NDV）1）画出气室和胚位2）在气室接近胚位处涂沫碘酊和酒精消毒3）用钢锥穿一小孔4）将注射器针头沿此小孔插入0.5-1cm，注入接种物5）用石蜡封口，置孵卵箱中孵育，每天翻卵1-2次3．卵黄囊接种（6-8日龄）主要用虫媒病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等的分离和增殖。
常规病毒学实验技术常规病毒学实验技术（⼀）病毒的培养实验动物：家兔、⼩⽩⿏、⼤⽩⿏、豚⿏、仓⿏主要⽤于：①分离病毒，并借助感染范围试验鉴定病毒②培养病毒，制造抗原和疫苗③测定各毒株之间的抗原关系，（⽤实验动物作中和试验和交叉保护实验）④制备免疫⾎清和单克隆抗体⑤作病毒感染的实验研究，包括病毒毒⼒测定、建⽴病毒病动物模型等注意：选择对⽬的病毒敏感的实验动物品种品系，以及适宜的接种途径和剂量。
鸡胚（⼀）条件要求SPF鸡、孵化温度38-39℃，湿度40-70%，通风。
新鲜受精卵：产下后不超过10天并保存10℃左右。
（⼆）优点组织分化程度低，可选择不同的⽇龄和接种途径，病毒易于增殖，感染病毒的组织和液体中含有⼤量病毒，容易采集和处理，⽽且来源充⾜，设备和操作简便易⾏。
（三）接种途径1．绒⽑尿囊膜接种（10-12⽇龄鸡胚）主要⽤于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。
1）⽅法⼀（造⼈⼯⽓室）①在胚胎附近近⽓室处，选择⾎管较少的部位，⽤电烙器在卵壳上烙⼀个直径约3-4mm的烤焦圈。
②⽤碘酊和酒精消毒后，⼩⼼⽤⼑尖撬起卵壳，造成卵窗。
③在⽓室端中央钻⼀个⼩孔。
④⽤针尖挑破卵窗中⼼的壳膜，切勿损伤其下的绒⽑尿囊膜。
⑤滴加滴⽣理盐⽔于刺破处，⽤橡⽪乳头紧贴于⽓室中央⼩孔上吸⽓，造成⽓室内负压，使卵窗部位的绒⽑尿囊膜下陷⽽形成⼈⼯⽓室，此时可见滴于壳膜上的⽣理盐⽔迅速渗⼊。
⑥⽤1ml注射器滴⼊2-3滴接种物于绒⽑尿囊膜上。
⑦⽤透明胶纸封住卵窗，或⽤玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的⽯蜡密封，⽓室中央的⼩孔⽤⽯蜡密封。
⑧鸡胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。
2）⽅法⼆①在⽓室端的卵壳上开约1.5×1.5cm的⼝。
②⽤灭菌眼科镊⼦撕去⼀⼩⽚内壳膜。
③滴⼊接种物。
④⽤透明胶纸封闭开⼝。
2．尿囊腔接种（10-11⽇龄）⽤于正粘病毒和副粘病毒（NDV）1）画出⽓室和胚位2）在⽓室接近胚位处涂沫碘酊和酒精消毒3）⽤钢锥穿⼀⼩孔4）将注射器针头沿此⼩孔插⼊0.5-1cm，注⼊接种物5）⽤⽯蜡封⼝，置孵卵箱中孵育，每天翻卵1-2次3．卵黄囊接种（6-8⽇龄）主要⽤⾍媒病毒以及鹦鹉热⾐原体和⽴克次⽒体等的分离和增殖。
病毒学实验技术_病毒学,实验技术,2病毒学实验技术 2 (2)接种和孵育用一支连接7或8号针头的1ml注射器，小心地将针头经内壳膜的裂缝插入，滴加0.1~0.2ml接种物于绒毛尿囊膜上。
严格的操作应在检蛋灯上进行，以保证接种物确实滴在绒毛尿囊膜上，而不是穿透了绒毛尿囊膜。
接种后，将鸡蛋稍行摇动，使接种物均匀扩散于绒毛尿囊膜表面。
蛋壳的开口用一小块橡皮膏封闭。
继续孵育，使蛋壳窗向上。
另一个接种方法可以不开蛋壳窗，方法如下:在已消毒的蛋壳上选好部位钻孔，达内壳膜。
用一6号针头，使针头尖的斜面向下，在钻孔的周围小心地稍稍下压针头，将内壳膜与蛋壳分开。
随后将蛋放在检蛋灯上，并在已经钻好的气室孔上吸气。
当时即可清楚地见到绒毛尿囊膜的塌落。
(3)膜组织的收获将蛋平放，蛋壳窗向上。
用碘酊棉球消毒蛋壳窗周围，撕去橡皮膏。
用灭菌镊子除去周围蛋壳，暴露出绒毛尿囊膜。
用镊子将膜夹住，并用剪刀剪下后迅速移置于一个灭菌平皿内。
因为9或10日龄的鸡胚的绒毛尿囊膜牢固地粘连于内壳膜上，所以一个通用的方法是在鸡胚7、8日龄时就使绒毛尿囊膜塌落，随后继续孵育，直至准备接种时为止。
接种操作需在检蛋灯上进行，以保证此时绒毛尿囊膜不上升，而且接种物确实是放在绒毛尿囊膜上而不是在尿囊腔内。
随后用石蜡-凡士林混合物或橡皮膏封闭蛋壳孔。
此后按第一法所述方法进行孵育和收获。
4.羊膜(Amniotie)接种此法主要用于由咽喉洗嗽液中分离流感病毒。
由于鸡胚在发育过程中吞咽羊水，并将其中所含的病毒携带至呼吸道和肠道组织，病毒主要在这些组织内增殖。
脑脊髓炎病毒也可通过羊水腔途径进行分离。
(1)日龄和准备用7~15日龄的鸡胚，检蛋，确定胚胎位置，随后根据胚胎位置在鸡蛋的侧面、气室上方蛋壳的相应位置上选点并标记。
按常法处理后，象卵黄囊接种那样钻孔。
(2)接种和孵育接种时应用lm1注射器，连接一个长约1.8cm的7号针头。
将蛋平放于检蛋灯上，插入针头，并缓慢地向胚胎方向刺入。
《病毒学检验》课程教学大纲一、课程基本信息课程名称：病毒学检验（Experimental Virology）课程编码：课程类别: 必修课(专业课)适用专业: 卫生检验学本科开课学期: 第七学期课程学时: 63学时（理论学时27，实验学时36）课程学分：3.5先修课程：医学寄生虫学及检验、细菌学检验、临床医学概要等课程简介：病毒学检验是卫生检验重要的专业课程之一，是卫生检验课程体系的重要组成部分，也是卫生检验专业学生必修的考试课程。
本课程通过课堂讲授、实验实习、网络自学等方式进行教学。
注重培养学生综合性思维能力，重视学生自主学习、自觉学习，分析和解决实际问题能力，以及创新思维和能力的培养。
选用教材：李洪源、王志玉主编：《病毒学检验》，人民卫生出版社，第一版，2006年7月。
参考书:1. 张朝武主编：《现代卫生检验》，第一版，人民卫生出版社，2005。
2. 李影林主编：《中华医学检验全书》，人民卫生出版社，1996。
3. 王秀茹主编：《预防医学微生物学及检验技术》，人民卫生出版社，2002。
4. 贾文祥主编：《医学微生物学》，四川大学出版社，2005年1月。
5. 李凡、刘星晶主编：《医学微生物学》，人民卫生出版社，第七版，2008年1月。
二、课程教育目标通过学习，使学生知悉病毒学检验的基本技术和分子生物学技术，知悉常见重要致病病毒。
要求学生掌握病毒的分离培养方法、血清学实验及分子生物学技术在病毒学检验中的应用；掌握常见重要致病病毒的生物学性状、检验方法和预防医学意义。
为学生能独立开展各种病毒学检验打下良好基础。
三、理论教学内容与基本要求绪论（一）学时：0.5（二）要求【掌握】病毒的特性；病毒学检验的内容及其应用范围；病毒学检验的一般原则。
【熟悉】病毒学检验的质量控制；病毒学实验室的生物安全管理。
【了解】病毒学和病毒学检验的发展史。
第一篇病毒学检验技术第一章细胞培养技术（一）学时：1.5（二）要求【掌握】体外培养细胞的生物学特性；体外细胞培养的条件；组织培养的种类；细胞系和细胞株的概念；细胞培养方法；细胞培养中平衡盐、消化液和血清的作用；细胞检查方法；细胞的冻存。
第三篇病毒学实验技术实验学时计划：实验一实验须知6小时；实验二细胞培养用水的制备及检验15小时；实验三组织培养技术20小时；实验四病毒的分离及其理化性质的测定20小时；实验五病毒提纯技术15小时。
实验一实验须知一、实验室注意事项1．凡参加病毒学实验的人员均应接种与实验有关的病毒疫苗。
2．实验室内，特别是组织培养操作室，须经常保持干燥、清洁。
在进行病毒接种或无菌操作前后，均应用紫外线照射灭菌，必要时可用3～5%的酚或煤酚皂溶液擦拭或喷雾消毒。
3．进入操作室，须先洗净双手并用消毒药水严格消毒；更换拖鞋，戴口罩和帽子，穿消毒的实验服。
4．病毒实验操作完毕后，将所穿戴实验服、口罩、帽子和拖鞋等物，出操作室前须更换；两手须经消毒药水严格浸洗后方能外出。
5．一个接种操作室，严禁同时进行两株病毒株的传种；吸取病毒材料时，勿于悬空吹出或打出。
6．凡沾病毒材料的吸管、试管等器具，须随时投入5%煤酚皂或1%盐酸溶液内，浸泡过夜，或煮沸消毒后才能进行洗涤。
7．凡带有感染性的鸡胚或动物尸体，须立即投入炉内焚化或进行煮沸消毒，或盛入容器内进行高压消毒后，方能携出室外进行处理。
8．工作人员要随时注意安全操作，以免发生事故；如发生意外，应迅速采取有效措施补救。
二、病毒材料收集、运送和保存（一）材料的收集分离病毒的成功率与采集材料有密切的关系。
采集病料必须在适当的部位和时间内进行，前者与各种传染的发病机理有关，后者常规在疾病早期，因为通常在疾病刚出现时病毒的滴度高。
各种病毒感染所采适宜病料参见图1和图2。
由于许多病毒的不稳定性，欲作病毒分离的材料，都应尽快的冷藏。
－30℃保存的病毒材料（除少数例外），至少可以活存几个月以上；而－70℃保存的病毒，甚至几年不见毒力降低。
有些病毒需在潮湿环境下保存，有的则需干燥环境（如Orf virus）。
对于棉拭子标本，折断放入2 ml pH7.4等渗平衡盐溶液的小瓶内，内含0.2%的明胶或牛白蛋白，青霉素、链霉素每毫升含100 u、100 μg；对于粪便、脓汁、鼻液等分泌物或渗出物，除在等渗平衡盐溶液含高浓度青、链霉素〔1000 u（μg）/ml〕外，还加2.5 μg/ml 的两性霉素B(或40 μg/ml的制霉素）；对脑等组织材料可放在50%甘油缓冲液中。
标本最好在冷藏的条件下尽快送到实验室。
病料要填写标签、临床病史和初步诊断。
（二）病毒材料的运送和保存供分离病毒用的材料，要尽快送到实验室。
如距离较远，可将熔封的材料容器放入冰筒，加冰块，盖严实后运送。
如无法获得冰块时，可用冷水加入氯化铵（NH4Cl）按3：1的比例倒入冰筒内搅拌1-3分钟，使溶解后，再放入熔封的材料容器，封闭瓶口运送。
病毒材料的保存：病毒标本必需及时处理，接种动物或培养，否则应将标准保存在-25℃至-70℃的低温冰箱或-196℃的液氮中。
病毒和病毒株真空干燥保存。
长期保存病毒，一般应用下述两种方法：1．快速低温冰冻：于灭菌悬液中加入灭活的正常动物血清或其他蛋白保护剂，最好再加一些二甲基亚砜（5～10％），并迅速冷冻和保存于―70℃或―196℃。
含病毒的组织材料可以直接低温冰冻保存；先浸入50%的甘油缓冲液盐水中，再行低温保存，效果更好。
2．冷冻干燥：在真空条件下使冰冻的病毒悬液脱水。
通常用低温脱水法，并以干燥剂或冷凝法除去凝器内尚未凝结的多余水汽。
通常用的的干燥剂有五氧化二磷、硫酸钙、氯化钙和硅胶。
干燥毒种的保护剂，一般应用脱脂牛奶、灭活正常动物血清、饱和蔗糖溶液等。
真空干燥时，将病毒悬液与5－10倍量的保护剂混合，分装安瓶，每支0.2～0.5 ml，立即放入事先预冷的－30℃～－40℃酒精中冻结1～2 h，随后迅速置于盛有干燥剂的干燥器内，立即抽气干燥。
充分干燥后，打开干燥器取出毒种安瓶，再抽真空并封口。
这样冻干的毒种，一般可在4℃冰箱内保存几年至十年以上。
以上冷冻干燥可在真空干燥机里进行，十分方便。
（三）病料的处理1．咽喉拭子：放入盛有2～5ml Hanks液的容器内，内含2%犊牛血清和相应浓度（200～500 u或μg/ml）的青、链霉素。
通过机械震动，并反复冻融3～5次后，以2000 rpm离心10～20分钟取上清液即可。
2．脑、肝、肌肉等器官或组织：充分剪碎后置乳钵中加石英砂（或玻璃砂）研磨，或置组织研磨器磨碎而制成1︰10的悬液，常用稀释液有pH7.2～7.6的PBS，pH7.2～7.6的肉汤，10%脱脂乳盐水，0.5%乳汉液（乳蛋白-Hanks液），每毫升含有青、链霉素200 u或200 μg。
反复冻融3～5次（－20℃下的酒精中迅速冰冻，37℃温水中融化）后，以2000 rpm 离心取上清即可。
如中性甘油保存的标本，先用生理盐水冲洗后再研磨。
3．鼻液、乳汁、脓汁等分泌物或渗出物：用含青、链毒素的Hanks液（每ml含1000 u或1000 μg）将其稀释3～5倍，充分混匀悬浮后，置4℃冰箱内过夜，离心取上清。
4．粪便：用含青、链毒素（1000 u或1000 μg/ml），含2%犊牛血清的Hanks液，4℃过夜，离心取上清。
5．无菌的体液或鸡胚液等：不作任何处理，可直接用于接种。
Orf virus的复壮、收毒及保存一、病毒液的制备取脓疱痂皮，充分剪碎置乳钵中加玻璃砂（或石英砂）研成粉末，用pH7.2的PBS或生理盐水按1︰10比例制成悬液，内含500 u和500 g的青、链霉素，－20℃，37℃反复冻融3次，2000 rpm以上离心后，取上清液进行无菌检验（需氧和厌氧培养24小时以上）后即可。
二、易感动物从非疫区选用1周岁以下的绵羊羔，越小越好。
三、接种动物1．动物准备：先将羊腹下和股内侧剪毛、脱毛，用水洗刷干净，再用灭菌水冲洗一次，擦干。
2．在羊腹下和股内侧皮肤上用灭菌针头连续划痕，以不划透皮肤，刚见到一点血丝为好。
3．将前所制备的病毒液涂擦在划痕处，均匀涂布，完毕后，等水份蒸发干后，将放开。
4．感染羊要隔离饲养严防散毒。
四、采毒时间及方法羊感染后一般在3～4天后开始出疹，4～6天后出现水疱，6～8天后出脓疱。
采毒可在水疱期－脓疱期之间进行，当完全化脓，甚至结痂之后病毒滴度下降。
采毒方法直接用刀片刮下皮痂，装入灭菌容器内，写明标签。
五、保存本病毒耐干燥，在保存中，将装病料的容器置于装有干燥剂（如氯化钙）的容器内，密封，置于低温冰箱或超低温冰箱保存。
保存时间可达一年以上，2年时还有一定毒力。
据有些书籍记载可存活15年之久。
附：真空冰冻干燥法，可见《新实验病毒学》P22～23。
参考文献1．戴华生等编著. 新实验病毒学.中国学术出版社，1983，20～232．殷震，刘景华. 动物病毒学（第一版）.科学出版社，1985，275～276实验二 细胞培养用水的制备及检测要搞组织培养，水质的优劣是成败的关键。
组织培养用的各种洗液和溶液，需用三蒸水或去离子水配制。
三蒸水的第三次蒸馏应在玻璃蒸馏器内进行。
水的纯度在用水质检测仪测定时，电阻应在150万欧姆以上，才能用于组织培养。
兰州兽医研究所细胞培养用水在1000万欧姆左右。
我们教研组细胞培养用水的制备程度是：蒸馏器—蒸，—蒸水再经过去离子交换树脂柱，去离子水（可达200～500万欧姆）。
这种程序所制备的水，可供小型实验室用水。
兰州兽医研究所细胞培养用水的制备程序是：自来水先通过滤器粗滤，可以滤除一些肉眼可见的物质，如一些泥土颗粒等，再经过电渗仪，可将一些大颗粒的物质和一些无机盐离子去除，电渗过的水再经去离子交换树脂柱除去阴、阳离子，经检测合格后可用于组织培养。
这种程序适用于大生产用水或供许多实验室用水。
一、去离子水的制备去离子水有人也叫无离子水，但这种称呼不太恰当，因为去离子水还是含有一些阴、阳离子，并非无离子。
（一）去离子水的制备原理离子交换柱内装有苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂和苯乙烯型强碱性阴离子交换树脂。
阳树脂可交换水中的阳离子，阴树脂交换水中的阴树脂，从而使水中的无机盐正、负离子得以去除，而达到水质净化的目的。
树脂的合成过程：乙烯（CH 2＝CH 2）使苯烷基化→乙苯→苯乙烯→橡胶、树脂。
l C H H H Cl -++--++-−−−→−−−→−阳离子树脂阳离子树脂阳离子树脂再生加交换＋H ＋OH － ＋ 阴离子树脂阳离子树脂阳离子树脂再生交换-++--++-−−−→−−−→−Na OH OH NaOH 阴树脂有一定的除去水中热原能力（蛋白性的热原在pH 7.0时带负电），故去离子水可作为注射用水。
一般认为去离子水电阻值大于50万欧姆·厘米，作为注射用水均可。
（二）离子交换柱的类型1．联合式：阳离子交换树脂柱（4公斤）——阴离子交换树脂柱（3公斤）——阴离子交换树脂柱（3公斤）——混合树脂柱（阴树脂1公斤，阴树2.5公斤）。
2．混合式：1根混合树脂柱。
3．复合式：阳离子交换树脂柱——阴离子交换树脂柱——阴离子交换树脂柱——阳离子交换树脂柱——阴离子交换树脂柱——阴离子交换树脂柱。
见图3。
三种离子交换柱优缺点类型优点缺点联合式水量大，水质好，pH值稳定处理麻烦，树脂用量大。
混合式树脂用量少，设备简单，出水块，水质高，pH值稳处理麻烦定。
复合式处理容易水质、pH值都不如上两种。
我们教研组现采用复合式＋混合式的类型。
我们现采用的离子交换器柱容量小，出水质量不稳定，树脂再生处理频繁。
要制备优质的去离子水，除选择适当的类型外，更重要的是交换柱容量要大。
在一定容量下，柱的直径大出水量多，柱子越长，水质越好，反之出水量少，水质差。
在选用离子交换柱时一定遵守这个原则。
（三）离子交换树脂的酸碱再生法1．方法一：（1）混合柱中树脂的再生混合柱中树脂−−→−倒出用25%氯化钠溶液，分离出阴、阳离子交换树脂（阴性树脂漂在上面，阳性树脂沉在水底）−−→−树脂去除污场用25%氯化钠溶液−−倒出氯化钠反复用蒸馏用蒸馏水分别浸泡到第二天分别浸泡阴、阳性树脂12小时−−−−水冲洗至无咸味−→−−−−−−−−→−树脂处理。
−−阳性树脂处理：用7%盐酸溶液浸泡三次，每次浸泡10～15分钟，最后一次浸泡2小时以上。
浸泡时应不断搅动—→用泥纶纱将酸水沥干，再用去离子水反复冲洗至pH3～4即可。
阴性树脂处理：用8%氢氧化纳溶液浸泡三次，每次浸泡10～15分钟，最后一次浸泡2小时以上。
浸泡时应不断搅动—→用泥纶纱将碱水沥干，再用去离子水反复冲洗至pH8～9即可。
处理好的树脂，可分别装成阴离子交换柱和阴离子交换柱，或阴性树脂和阳性树脂按1.7︰1的比例充分混匀后装成混合柱。
（2）新树脂的处理新树脂常混入一些低聚物、色素、灰沙等异物，必须认真处理除去，否则将影响今后制水的质量和产量。
①漂洗。
用水质软的常水，反复漂洗树脂，以除去其中的色素、水溶性杂质、灰尘等。
