第三篇病毒学实验技术
实验学时计划：实验一实验须知6小时；实验二细胞培养用水的制备及检验15小时；实验三组织培养技术20小时；实验四病毒的分离及其理化性质的测定20小时；实验五病毒提纯技术15小时。
实验一实验须知
一、实验室注意事项
1．凡参加病毒学实验的人员均应接种与实验有关的病毒疫苗。
2．实验室内，特别是组织培养操作室，须经常保持干燥、清洁。在进行病毒接种或无菌操作前后，均应用紫外线照射灭菌，必要时可用3～5%的酚或煤酚皂溶液擦拭或喷雾消毒。
3．进入操作室，须先洗净双手并用消毒药水严格消毒；更换拖鞋，戴口罩和帽子，穿消毒的实验服。
4．病毒实验操作完毕后，将所穿戴实验服、口罩、帽子和拖鞋等物，出操作室前须更换；两手须经消毒药水严格浸洗后方能外出。
5．一个接种操作室，严禁同时进行两株病毒株的传种；吸取病毒材料时，勿于悬空吹出或打出。
6．凡沾病毒材料的吸管、试管等器具，须随时投入5%煤酚皂或1%盐酸溶液内，浸泡过夜，或煮沸消毒后才能进行洗涤。
7．凡带有感染性的鸡胚或动物尸体，须立即投入炉内焚化或进行煮沸消毒，或盛入容器内进行高压消毒后，方能携出室外进行处理。
8．工作人员要随时注意安全操作，以免发生事故；如发生意外，应迅速采取有效措施补救。
二、病毒材料收集、运送和保存
（一）材料的收集
分离病毒的成功率与采集材料有密切的关系。采集病料必须在适当的部位和时间内进行，前者与各种传染的发病机理有关，后者常规在疾病早期，因为通常在疾病刚出现时病毒的滴度高。各种病毒感染所采适宜病料参见图1和图2。
由于许多病毒的不稳定性，欲作病毒分离的材料，都应尽快的冷藏。－30℃保存的病毒材料（除少数例外），至少可以活存几个月以上；而－70℃保存的病毒，甚至几年不见毒力降低。有些病毒需在潮湿环境下保存，有的则需干燥环境（如Orf virus）。
对于棉拭子标本，折断放入2 ml pH7.4等渗平衡盐溶液的小瓶内，内含0.2%的明胶或牛白蛋白，青霉素、链霉素每毫升含100 u、100 μg；对于粪便、脓汁、鼻液等分泌物或渗出物，除在等渗平衡盐溶液含高浓度青、链霉素〔1000 u（μg）/ml〕外，还加2.5 μg/ml 的两性霉素B(或40 μg/ml的制霉素）；对脑等组织材料可放在50%甘油缓冲液中。标本最好在冷藏的条件下尽快送到实验室。
病料要填写标签、临床病史和初步诊断。
（二）病毒材料的运送和保存
供分离病毒用的材料，要尽快送到实验室。如距离较远，可将熔封的材料容器放入冰筒，加冰块，盖严实后运送。如无法获得冰块时，可用冷水加入氯化铵（NH4Cl）按3：1的比例倒入冰筒内搅拌1-3分钟，使溶解后，再放入熔封的材料容器，封闭瓶口运送。
病毒材料的保存：病毒标本必需及时处理，接种动物或培养，否则应将标准保存在-25℃至-70℃的低温冰箱或-196℃的液氮中。病毒和病毒株真空干燥保存。
长期保存病毒，一般应用下述两种方法：
1．快速低温冰冻：于灭菌悬液中加入灭活的正常动物血清或其他蛋白保护剂，最好再加一些二甲基亚砜（5～10％），并迅速冷冻和保存于―70℃或―196℃。
含病毒的组织材料可以直接低温冰冻保存；先浸入50%的甘油缓冲液盐水中，再行低温保存，效果更好。
2．冷冻干燥：在真空条件下使冰冻的病毒悬液脱水。通常用低温脱水法，并以干燥剂或冷凝法除去凝器内尚未凝结的多余水汽。通常用的的干燥剂有五氧化二磷、硫酸钙、氯化钙和硅胶。
干燥毒种的保护剂，一般应用脱脂牛奶、灭活正常动物血清、饱和蔗糖溶液等。真空干燥时，将病毒悬液与5－10倍量的保护剂混合，分装安瓶，每支0.2～0.5 ml，立即放入事先预冷的－30℃～－40℃酒精中冻结1～2 h，随后迅速置于盛有干燥剂的干燥器内，立即抽气干燥。充分干燥后，打开干燥器取出毒种安瓶，再抽真空并封口。这样冻干的毒种，一般可在4℃冰箱内保存几年至十年以上。
以上冷冻干燥可在真空干燥机里进行，十分方便。
（三）病料的处理
1．咽喉拭子：放入盛有2～5ml Hanks液的容器内，内含2%犊牛血清和相应浓度（200～500 u或μg/ml）的青、链霉素。通过机械震动，并反复冻融3～5次后，以2000 rpm离心10～20分钟取上清液即可。
2．脑、肝、肌肉等器官或组织：充分剪碎后置乳钵中加石英砂（或玻璃砂）研磨，或置组织研磨器磨碎而制成1︰10的悬液，常用稀释液有pH7.2～7.6的PBS，pH7.2～7.6的肉汤，10%脱脂乳盐水，0.5%乳汉液（乳蛋白-Hanks液），每毫升含有青、链霉素200 u或200 μg。反复冻融3～5次（－20℃下的酒精中迅速冰冻，37℃温水中融化）后，以2000 rpm 离心取上清即可。如中性甘油保存的标本，先用生理盐水冲洗后再研磨。
3．鼻液、乳汁、脓汁等分泌物或渗出物：用含青、链毒素的Hanks液（每ml含1000 u或1000 μg）将其稀释3～5倍，充分混匀悬浮后，置4℃冰箱内过夜，离心取上清。
4．粪便：用含青、链毒素（1000 u或1000 μg/ml），含2%犊牛血清的Hanks液，4℃
过夜，离心取上清。
5．无菌的体液或鸡胚液等：不作任何处理，可直接用于接种。
Orf virus的复壮、收毒及保存
一、病毒液的制备
取脓疱痂皮，充分剪碎置乳钵中加玻璃砂（或石英砂）研成粉末，用pH7.2的PBS或生理盐水按1︰10比例制成悬液，内含500 u和500 g的青、链霉素，－20℃，37℃反复冻融3次，2000 rpm以上离心后，取上清液进行无菌检验（需氧和厌氧培养24小时以上）后即可。
二、易感动物
从非疫区选用1周岁以下的绵羊羔，越小越好。
三、接种动物
1．动物准备：先将羊腹下和股内侧剪毛、脱毛，用水洗刷干净，再用灭菌水冲洗一次，擦干。
2．在羊腹下和股内侧皮肤上用灭菌针头连续划痕，以不划透皮肤，刚见到一点血丝为好。
3．将前所制备的病毒液涂擦在划痕处，均匀涂布，完毕后，等水份蒸发干后，将放开。
4．感染羊要隔离饲养严防散毒。
四、采毒时间及方法
羊感染后一般在3～4天后开始出疹，4～6天后出现水疱，6～8天后出脓疱。采毒可在水疱期－脓疱期之间进行，当完全化脓，甚至结痂之后病毒滴度下降。
采毒方法直接用刀片刮下皮痂，装入灭菌容器内，写明标签。
五、保存
本病毒耐干燥，在保存中，将装病料的容器置于装有干燥剂（如氯化钙）的容器内，密封，置于低温冰箱或超低温冰箱保存。保存时间可达一年以上，2年时还有一定毒力。据有些书籍记载可存活15年之久。
附：真空冰冻干燥法，可见《新实验病毒学》P22～23。
参考文献
1．戴华生等编著. 新实验病毒学.中国学术出版社，1983，20～23
2．殷震，刘景华. 动物病毒学（第一版）.科学出版社，1985，275～276
实验二 细胞培养用水的制备及检测
要搞组织培养，水质的优劣是成败的关键。组织培养用的各种洗液和溶液，需用三蒸水或去离子水配制。三蒸水的第三次蒸馏应在玻璃蒸馏器内进行。水的纯度在用水质检测仪测定时，电阻应在150万欧姆以上，才能用于组织培养。兰州兽医研究所细胞培养用水在1000万欧姆左右。
我们教研组细胞培养用水的制备程度是：蒸馏器—蒸，—蒸水再经过去离子交换树脂柱，去离子水（可达200～500万欧姆）。这种程序所制备的水，可供小型实验室用水。
兰州兽医研究所细胞培养用水的制备程序是：自来水先通过滤器粗滤，可以滤除一些肉眼可见的物质，如一些泥土颗粒等，再经过电渗仪，可将一些大颗粒的物质和一些无机盐离子去除，电渗过的水再经去离子交换树脂柱除去阴、阳离子，经检测合格后可用于组织培养。这种程序适用于大生产用水或供许多实验室用水。
一、去离子水的制备
去离子水有人也叫无离子水，但这种称呼不太恰当，因为去离子水还是含有一些阴、阳离子，并非无离子。
（一）去离子水的制备原理
离子交换柱内装有苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂和苯乙烯型强碱性阴离子交换树脂。阳树脂可交换水中的阳离子，阴树脂交换水中的阴树脂，从而使水中的无机盐正、负离子得以去除，而达到水质净化的目的。
树脂的合成过程：乙烯（CH 2＝CH 2）使苯烷基化→乙苯→苯乙烯→橡胶、树脂。 l C H H H Cl -++--++-???→???→?阳离子树脂阳离子树脂阳离子树脂再生加交换
＋
H ＋
OH － ＋ 阴离子树脂阳离子树脂阳离子树脂再生
交换-++--++-???→???→?Na OH OH NaOH 阴树脂有一定的除去水中热原能力（蛋白性的热原在pH 7.0时带负电），故去离子水可作为注射用水。一般认为去离子水电阻值大于50万欧姆·厘米，作为注射用水均可。
（二）离子交换柱的类型
1．联合式：阳离子交换树脂柱（4公斤）——阴离子交换树脂柱（3公斤）——阴离子交换树脂柱（3公斤）——混合树脂柱（阴树脂1公斤，阴树2.5公斤）。
2．混合式：1根混合树脂柱。
3．复合式：阳离子交换树脂柱——阴离子交换树脂柱——阴离子交换树脂柱——阳离子交换树脂柱——阴离子交换树脂柱——阴离子交换树脂柱。见图3。
三种离子交换柱优缺点
类型优点缺点
联合式水量大，水质好，pH值稳定处理麻烦，树脂用量大。
混合式树脂用量少，设备简单，出水块，水质高，pH值稳
处理麻烦
定。
复合式处理容易水质、pH值都不如上两种。
我们教研组现采用复合式＋混合式的类型。我们现采用的离子交换器柱容量小，出水质量不稳定，树脂再生处理频繁。
要制备优质的去离子水，除选择适当的类型外，更重要的是交换柱容量要大。在一定容量下，柱的直径大出水量多，柱子越长，水质越好，反之出水量少，水质差。在选用离子交换柱时一定遵守这个原则。
（三）离子交换树脂的酸碱再生法
1．方法一：
（1）混合柱中树脂的再生混合柱中树脂?
?→
?倒出用25%氯化钠溶液，分离出阴、阳离子交换树脂（阴性树脂漂在上面，阳性树脂沉在水底）?
?→
?树脂去除污场用25%氯化钠溶液
?
?
倒出氯化钠反复用蒸馏用蒸馏水分别浸泡到第二天分别浸泡阴、阳性树脂12小时?
?
?
?水冲洗至无咸味
?→
?
?
?
?
?
?
?
?→
?树脂处理。
?
?
阳性树脂处理：用7%盐酸溶液浸泡三次，每次浸泡10～15分钟，最后一次浸泡2小时以上。浸泡时应不断搅动—→用泥纶纱将酸水沥干，再用去离子水反复冲洗至pH3～4即可。
阴性树脂处理：用8%氢氧化纳溶液浸泡三次，每次浸泡10～15分钟，最后一次浸泡2小时以上。浸泡时应不断搅动—→用泥纶纱将碱水沥干，再用去离子水反复冲洗至pH8～9即可。
处理好的树脂，可分别装成阴离子交换柱和阴离子交换柱，或阴性树脂和阳性树脂按1.7︰1的比例充分混匀后装成混合柱。
（2）新树脂的处理新树脂常混入一些低聚物、色素、灰沙等异物，必须认真处理除去，否则将影响今后制水的质量和产量。
①漂洗。用水质软的常水，反复漂洗树脂，以除去其中的色素、水溶性杂质、灰尘等。
②用醇浸泡或用10%氯化钠浸泡。用95%乙醇浸没树脂，摇匀并浸泡24小时，以除去醇溶性杂质。用过的醇可利用配外用药。也可用10%氯化钠溶液浸泡12小时。
③其余处理过程同树脂再生。
（3）注意事项
①在处理树脂过程不能使用金属容器，要用耐酸碱的塑料或玻璃容器。
②装柱时不能出现气泡和流沟。使用时要勤检查。
③盛去离子水的容器不能用金属容器。
④热蒸馏水不能进入离子交换柱内。
2．方法二：
（1）新树脂处理树脂经水漂洗，醇浸泡后，再经酸碱反复处理。
阳离子交换树脂先用7%盐酸浸泡三次，最后一次2～3小时后，用水漂洗至pH 3～4时，再用8%氢氧化钠用上法操作，最后水洗至pH9～10。
阴离子交换树脂先用8%氢氧化钠浸泡，操作法同阳树脂，水洗至pH9～10，再用7%盐酸，同上法操作，最后水洗至pH 3～4。
（2）树脂的再生(转型) 同方法一，阳离子用7%盐酸处理，pH调至3～4，阴离子用8%氢氧化钠，pH调至8～9。
（3）方法二的整个过程，可直接在交换柱内进行，通过正洗、逆洗，进行新树脂的处理和树脂的再生（转型）。这种方法不适合混合柱的再生。
（四）离子交换树脂的食盐再生法
是一种用普通食盐（粗氯化钠）代替酸碱作再生剂的方法，可制得含微量氯化钠的输液用水（根据水源中离子的多少，而制得含不同量氯化钠的水，一般均低于万分之五）。但是水源必须进行预处理除热原和细菌。这种方法不适于搞细胞培养。
（五）水质检测
作为组织培养用水，最常检测的指标是测量水的电阻值或电导，测量常用仪器为DDS-11型电导仪（天津第二分析仪四厂）。如无电导仪，可检查下列项目：
1．酸碱度：取两支试管，各加去离子水10ml。甲管加甲基红pH指示液2滴不得显红色，乙管加溴麝香草酚兰pH指示液5滴不明显蓝色。
2．氯化物：取10ml去离子水，用硝酸酸化，加硝酸银试液4滴，摇匀，不得显浑浊。
3．钙盐：取10ml去离子水，先用氨试液调节pH至10左右，加铬黑T指示液一滴不得显红色。
（六）可能遇到的问题和注意事项
参考文献
1．红卫医疗器械厂（上海西郊华漕南华路65号）. 70型离子交换纯水器说明书
2．陆洪英编写. 组织培养技术. 油印体，1982
3．天津第二分析仪器厂. DDS-11型电导仪说明书
实验三组织培养技术
一、发展概况
组织培养，原来是指动物或植物组织小块的体外培养。这个名称现在用以泛指体外的组织、器官及细胞培养。
在上世纪初，为了解神经细胞轴突最初在胚胎中形成的方式，于1907年由美国动物学家哈里森（Ross Granville Harrison），设计出一种回答神经纤维起源问题的实验。步骤是，用无菌方法从长约3mm的神经褶闭合后不久的蛙胚取出小块，此时肉眼观察未见分化的神经成分。小心切下一片组织后，即用毛细管将此组织小块移至一块有蛙新鲜淋巴的盖片上，待淋巴凝固后，组织小块就固定在一位置，然后倒置盖玻片于凹玻片之上，边缘用蜡封固，组织块可存活1～4周，成功地在体外培养基（凝结的淋巴）中培养了神经元，并观察到轴突从成神经细胞长出来。首创了组织块悬滴培养法（见图4），所以现在一般皆公认哈里森为组织培养之父。
在1910年，美国医生伯罗斯（M.T.Burrows），在哈里森实验室学习了这种技术，然后对培养温血动物的组织感兴趣，决定在悬滴培养法中用鸡血浆作为鸡胚组织的支持和营养物质，在与其同事外科医生卡雷尔（Alexis Carrel）合作，成功地培养了成年狗、猫、家鼠、豚鼠，以至恶性组织的外植物，后来他们还证明体外培养的细胞的寿命可以因传代而延长。并指出反复传代可使细胞株存活34年之久是可行的，这主要是归功于卡雷尔发明的卡氏瓶（见图5）。
后来，两位美国科学家W.H.刘易斯（Lewls）和M.R.刘易斯从另一个角度研究培养技术，试图用已知成份的合成培养基取代不能正确肯定其成份的天然培养基（血浆及胚胎提取液），后经他们及其他许多科学家经30年的努力，终于发展出许多合成培养基，现已有好多定型培养基，可现成购得。
1929年在英国剑桥的斯特兰奇韦斯（Strange ways）研究实验室的费尔（Honor Fell）夫人，在组织块培养的基础上，发展了整个胚胎器官的体外培养，称之为器官培养。其方法是，事先准备好有小鸡血浆与胚胎提取液混合形成凝块的表玻皿，把鸡胚器官原基置于凝块上，再将表破皿置于陪替氏碟内，同时在碟内备有湿润的棉花(见图6)。外植物从下面的血浆凝块中吸取营养，同时从与之接触的空间中吸取氧气。费尔用这种方法还进行了骨和关节组织的培养。
在50年代以前虽然在组织培养方法有以上成就，但是发展较慢，关键的问题是污染问题未能解决。50年代后由于青霉素等抗菌素在组织培养上的应用，这样才使组织培养兴起，并得到广泛应用，应用于病毒学的研究。组织培养技术进一步改进，发展成为细胞培养。
二、组织培养的类型及一些术语
组织培养可分为三种：即组织（块）培养、器官培养、细胞培养。
（一）组织（块）培养
将动物组织切成小块，包埋于玻片或培养瓶（管）壁上的一滴凝固血浆内，待其充分附着后，再加适当的营养液进行培养。
（二）器官培养
取器官薄片，如一段胎儿气管或一小块鼻粘膜，应用适宜的营养液加以培养，可以存活几天到几周，并保持其原来的结构和功能，例如正常的纤毛上皮运动。
（三）细胞培养
应用胰酶等分散剂将动物组织消化成单个细胞悬液，适当洗涤后，加入营养液，通常即可使其贴附于玻璃瓶壁上，并生长繁殖。这样的细胞培养物称原代细胞。将已长成单层的原代细胞从玻璃瓶壁上消化下来后再作培养，就是继代细胞。原代细胞和继代细胞一般还保留着原来细胞的主要特征。如继代细胞继续保持正常体细胞的二倍体组型的染色体，经严格检查，染色体数目和形态正常，并且没有污染，特称二倍体细胞株，可经多次传代，最后不可避免地逐渐衰老死亡。
由于遗传突变或者在理化学致癌物质和致癌病毒作用下，使组织培养细胞出现恶性变细胞（癌变细胞），从而建立起具有很高生长和增殖势能，几乎可以无限地传代的细胞，称传代细胞系或细胞系。传代细胞系染色体不再保持原来细胞的二倍体组型，变成多倍体，故又称为异倍体细胞。由动物取得肿瘤组织进行培养，也可获得传代细胞系。
常见的二倍体细胞株和传代细胞系有：
Hela细胞：系由子宫颈癌患者（Hela）分离获得，在体外培养而成的稳定传代细胞系。
KB细胞：由鼻咽癌建立的传代细胞系。
BHK21细胞：乳仓鼠肾继代细胞株。
Vero细胞：系由非洲绿猴肾培育的一株稳定的传代细胞。
WI-38细胞：人胚肺二倍体细胞株。
PK-15：猪肾细胞。
Hep-2细胞：由人表皮样癌建立的传代细胞系。
LLC-MK2：红猴肾传代细胞系。
BS-C-1：绿猴肾建立的传代细胞系。
IBRS-2（IB-RS-2）：猪肾细胞。
CHO细胞：仓鼠卵巢细胞。
除此以外还有CEF细胞、L细胞、RK13细胞等。
三、器材准备
（一）玻璃器皿
用于组织培养用的玻璃器皿要求比较高，以中性硬质玻璃制品为宜，并且玻璃表面要求平整光滑。一些优质的青、链霉素瓶也可用于组织培养。
玻璃皿器的洗涤比用于细菌等的玻璃器皿洗涤要复杂。用过的玻璃器皿先用清水冲洗后，浸泡于硫酸－重铬酸钾清洁液里浸泡过夜，然后再用清水冲洗，以优质的洗衣粉的1%水溶液洗刷，并用清水和蒸馏水分别冲洗3～5遍以上，再用去离子水冲洗2～3遍，浸泡在去离子水中过液，捞出后用去离子水或更高质量的水冲洗3～5遍以上后，晾干或烤干，等待包扎。
新购的玻璃器皿，清洗晾干后，浸泡于清洁液内1天以上，用清水冲洗，再按上法洗刷、冲净。
带毒的玻璃器皿需先浸泡在5%来苏液或1%盐酸溶液（依病毒种类而定）中一天以上或高压灭菌，此后再按上法洗涤。
晾干或烤干的培养瓶，需用内层白纸、外层报纸的双层纸包扎瓶口，或用牛皮纸单层包扎瓶口，随后几个包成一大包；吸管用棉花塞好管口，随后放入铜制、铝制的吸管筒或牛皮纸袋内；平皿也先用牛皮纸单个包扎，然后再包成大包。包扎后注明标签。
灭菌，玻璃器皿多采用160～170℃干热灭菌2小时。我们多用150℃左右，时间相应延长一点。
（二）塑料制品
细胞培养瓶（管）的塑料化，将必为发展的趋势。一般塑料制品在制造时无菌装入塑料袋，用时直接启开使用。
近年来用聚苯乙烯微量培养板，进行细胞培养。新购置的在使用前，先用稀释一倍的硫酸重铬酸钾清洁液浸泡过夜，然后按组织培养器皿的要求洗涤（但不能蒸煮或用高温水），以消除塑料对细胞的毒性。每次临用前，将微量培养板置于30W紫外线下（距离20cm）照射30分钟灭菌。使用过的，先将孔内营养液吸除，再加胰酶液，置37℃下过夜，使孔内细胞脱落，再按要求洗涤，倒置烤干（37℃）备用。对于接过病毒的，先用胰酶液处理后浸泡于1%盐酸中过夜，随后如上清洗。对耐酸性病毒，盐酸浓度可提高至3～5%。
（三）橡皮制品：
应选用对细胞毒性小的软质橡皮管和橡皮塞。新购置的橡皮制品先用2%的NaOH液煮15分钟，以自来水冲洗后再用4%的盐酸溶液煮15分钟。橡皮管在煮时，内不含气泡。用蒸馏水、双蒸水分别冲洗5～7次后再浸泡在双蒸水中1天以上，捞出后再用去离子水冲洗2-3遍后，晾干包装。121℃高压灭菌20分钟。
用过的橡皮制品先灭菌之后，于1%洗衣粉液里煮半小时，再按蒸馏水、双蒸水、去离子水分别浸泡冲洗，晾干备用。
（四）金属器械
洗干净、烤干、包扎、干热灭菌。
对蔡氏滤器洗净、烤干，安上滤板后，包扎，高压灭菌。
四、溶液及营养液
用于组织培养的液体配制，所用的化学药品应为分析试剂或生物学试剂，水应为电阻值在150万欧姆以上，一般说能达到500万欧姆以上就更好。
1．Hanks、Earle、PBS溶液：用于冲洗动物组织和细胞以及配制胰酶等分散剂和营养液的基础液，具有一定的缓冲作用。Hanks液和Earle氏液成分相近，用途相同，均以二氧化碳－重碳酸盐缓冲系统维持pH值，但Earle氏液缓冲作用更强，两者均可使用，看习惯而定。
在配制与空气长时间接触的液体，如病毒稀释液以及组织提取液等时，不能使用Hanks 氏液和Earle氏液，因它们为二氧化碳－重碳酸盐缓冲系统，而采用PBS，在配制胰酶液等细胞分散剂时应选用无钙PBS，或无钙、镁PBS，因钙离子、镁离子会影响组织的消化作
用。
上述溶体配制好后，115℃15分钟灭菌，置0～4℃冰箱内备用。
2．抗菌素溶液：防止细菌性污染，一般应用青霉素、链霉素，即取青霉素100万单位，链霉素100万微克，用灭菌去离子水或平衡盐溶液配成100毫升的上述两种抗生素的混合液，使每毫升含青霉素1万单位、链霉素1万微克，这就是我们所称的“双抗液”。分装于小瓶，于－20℃以下低温保存备用。有人用庆大霉素配成抗菌素液，代替双抗液。也有人乐于用金霉素，用37℃的灭菌去离子水，配成每毫升含1万单位的抗生素液，置－20℃下保存备用。
为了防止霉菌污染，可用静注两性霉素B（50毫克），用灭菌去离子水配成每毫升含200微克的溶液，于－20℃下保存备用。还可用制霉素配成每毫升含5000单位的溶液，也可用卡那霉素配成每毫升含1万单位的浓度溶液，于－20℃保存备用。
常规的细胞培养只加双抗，只有当霉雨季节或有霉菌、霉形体污染的较大危险时，才加抗霉菌的抗菌素。
于－20℃低温保存的上述各种抗生素溶液，可以使用3个月。
双抗液正常使用浓度，是进行100倍稀释后的浓度，只在考虑有严重污染时，才加正常量大5～10倍的量。
3．碳酸氢钠溶液：此液与气相CO2一起，对各种溶液提供缓冲系统，。通常用去离子水配成5.6%、7.5%或8.8%浓度的溶液，115℃高压灭菌15分钟后，灭菌分装于小瓶中，4℃保存备用。
4．肝素溶液：取瓶装无菌肝素一瓶（含量1克左右，相当于12～15万国际单位），以灭菌Hanks氏液或Earle氏液配制成0.5%溶液，分装于小瓶，4℃可保存一年。每1毫升可抗凝100毫升血液。如系非无菌制品，配制好后除菌过滤，分装小瓶，4℃保存备用。
5．细胞分散剂：是指能使组织块或成片细胞分散成单个细胞的化学制剂或生物制剂。胰酶、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）和灰色链丝菌酶是主要使用的细胞分散剂。
（1）胰酶液胰酶能使精氨酸或赖氨酸的羧基与其他氨基酸的胺基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞块或单层细胞“消化”为分散的单个细胞。但如感作时间太长，也可使细胞发生严重损伤。
通常取胰酶粉，用pH7.4～7.6的无钙PBS配制成0.25～1%的浓度，过滤除菌分装于小瓶，保存于－20℃以备用。使用时常用0.25%的浓度。
由于动物血清中含有抗胰酶物质，在进行消化时要将组织块中的血液冲干净或单层细胞中的血清冲净。
为防止污染，在贮存时可在胰酶液里加一点抗生素液。
（2）乙二胺四乙酸二钠（EDTA）液：其商品名Versene，某些组织，特别是上皮组织，需要有钙、镁两价离子的存在，才能保持其完整性，如果应用某种物质或方法除去这些离子，则就可使组织细胞分散脱离。乙二胺四乙酸二钠就因结合组织中的这些离子，使组织细胞分散而被用作细胞分散剂。
乙二胺四乙酸二钠的使用液为其0.02%溶液，配制方法如下：
DETA 0.05 g，NaCl 2.0 g，KCl 0.05 g，Na2HPO4 0.288 g，KH2PO40.05 g，加去离
子水250ml。溶解后，滤纸过滤，分装小瓶，115℃10分钟高压灭菌后，保存于4℃备用。
（3）灰色链丝菌酶（Pronase）液：这是一种蛋白酶、胺肽酶和羧肽酶的混合物。据说此酶用以“消化”鸡胚和鼠组织，许多上皮细胞类和纤维样细胞类单层细胞的传代，其作用比胰酶强，而且消化下来的细胞更为分散和均匀，但对细胞系“消化”不完全。
常用浓度为0.05～0.1%，用PBS配制，过滤除菌，分装于小瓶中，于－20℃保存备用，可用几个月。
上述胰酶、EDTA和灰色链丝菌酶液3种分散剂，其特性和作用原理不同，各有优缺点，各实验室应根据经验和条件，选择使用。
近年来常用胰酶和乙二胺四乙酸二钠混合液作为细胞分散剂，据说效果优于单独一种分散剂，用于继代细胞和传代细胞系，效果较好。尤其适用于上皮样细胞类的消化、分散。
6．营养液：营养液是组织培养系统中细胞赖以生长和增殖的直接环境，因此不仅要求含有各种营养物质，例如氨基酸、碳水化合物、维生素和无机盐类等，而且必须保证适宜的温度、酸碱度、渗透压和气相。目前所用的各种营养液有二类，一类为来自动物体的天然营养物质和其加工产品，如血清、腹水、组织浸出液和乳白蛋白水解物等，另一类是根据细胞的营养要求和生长特性而精密设计和配制的所谓人工综合营养液。
（1）血清动物血清中具有细胞生长所必须的各种营养物质，具有很强的酸碱缓冲作用。血清还有促进细胞贴壁的作用。
当前动物血清通常作为生物学添加物，用以丰富或补充其他营养液，使后者具有更较完全的营养成分。仅在培养外周血液的细胞或骨髓细胞时，有时应用全血清。有人认为动物血清中具有细胞生长因子或称生长刺激因子，具有明显的促细胞生长作用，故在培养各种细胞时都要求加入适量（如5～10%）的血清，但在维持培养时期可以减少血清用量，甚至全部不用血清。
各种动物的血清都能应用，并不必然要求同种血清，例如犊牛血清或胎牛血清可以用于人、马、猪、狗、鼠等多种细胞的培养。由于同种动物的不同个体的血清，在组成成分上可能有差别，因此最好采用来自几个个体的混合血清。混合血清的数量较大，进行一次鉴定试验，可以长期使用。
某些血清可能对细胞呈现毒性作用，毒性作用与血清中所含脂蛋白有关，尤其是胆固醇和三酸甘油酯。可通过石棉或玻璃滤皿过滤，吸附脂蛋白而降低其毒性作用。但须注意，石棉滤板中可能含有毒性物质，初滤血清废弃或先将滤板用Hanks氏液清洗过滤除毒。
每批次血清，在使用前都必须对相应细胞作培养试验。
细胞培养最常用犊牛血清，效果很好。也可根据各单位具体情况和条件，采用马血清、大牛血清、绵羊血清或鸡、兔血清等等，但是必须经过试验。
犊牛血清来源于奶牛场淘汰的公犊牛，出生后不能吸母乳，以免母源抗体进入犊牛血液，而干扰病毒的生长。
采用颈动脉无菌放血，盛于3000～5000ml事先加入30～50ml血清或等渗盐溶液的三角瓶，以免血块粘附瓶壁，影响血凝块收缩。采血后置37℃温箱或水浴中1小时，随后室温或4℃冰箱1天，倾出或吸出血清和红细胞混合液，装于离心管，以3000 rpm离心沉淀半小时后，吸取上层黄色透明的血清，分装，置－20℃以下保存备用。使用前置56℃水浴
中灭活30分钟。
对于某些病毒，如细小病毒，犊牛血清具明显的病毒抑制作用，故应选用5日龄以内的胎牛血清。可通过剖腹产获得胎牛。
（2）血浆是早期组织培养所采用的营养液和固体支持剂。常用鸡血浆，采血前，停食12小时以上，以肝素抗凝，并立即以2000 rpm离心30分钟，取上层液，检验无菌后，置4℃冰箱，可用2个月。
（3）组织浸出液其应用日趋减少，通常只在作组织块培养时，用它作为凝固液成分。
组织浸出液一般取9～11日龄的鸡胚制取，也可用牛或其它动物的胚胎制造组织浸出液。
（4）0.5%乳白蛋白水解物乳白蛋白水解物是乳中白蛋白、乳球蛋白和血清蛋白的水解产物，具有大量的多种氨基酸和肽类。应用Hanks液或Earle氏液配制的0.5%乳白蛋白水解物，特别是在添加犊牛血清后，可以培养哺乳动物绝大多数的组织细胞。
乳白蛋白水解物因生产厂家、批号等不同，质量明显差异，使用前必须试验选择。
（5）人工综合营养液
人工综合营养液是通过分析或综合方法，应用各种纯净的化学物质，人工设计和配制许多种类的营养液。所谓“分析法”就是分析天然营养液，如血清、组织浸出液和乳白蛋白水解物等的成分，随后加以仿制；“综合法”则是根据细胞的营养需要，逐项配合各种化学物质，并按实验结果加以改进完善。人工综合营养液的主要成分有氨基酸、碳水化合物、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶和辅助生长物质等。
经过近20多年研究，设计的人工综合营养液配方多达几十种，都有其最适宜培养的细胞种类，但某些具有较广的细胞适用范围，有些少。现较广泛应用的人工综合营养液有：199综合营养液、Eagle氏最低要素营养液（E-MEM）以及RPMI 1640综合营养液3种。它们适用于许多种类原代细胞、二倍体细胞株和传代细胞系的培养。
五、细胞培养方法
细胞培养，则常用单层培养法或悬浮培养法。至于组织块培养、器官培养不作介绍。
1．单层细胞培养：单层细胞培养是研究病毒生物学特性以及病毒与细胞相互作用过程的合适模型。应用单层细胞培养病毒，常可获得大量高效价的病毒液，用以制造特异性病毒抗原或病毒疫苗。单层细胞培养分为原代细胞、继代细胞和传代细胞3个主要类型，现以常用的几种，说明其培养方法。
（1）鸡胚原代细胞无菌采取9～10日龄鸡胚，置灭菌平皿中，除头、爪和内脏，并剪成块，以Hanks液充分冲洗后移于大号链霉素瓶或其他广口瓶内，用眼科剪剪成1 mm大小的碎块，加入Hanks液反复冲洗2-3次后，于沉淀组织块内加入约4倍量的0.25%的胰酶，并调整pH于7.6～7.8，振荡混匀后置37℃水浴中感作30分钟，每10分钟轻摇一次。取出后小心吸弃上层胰酶液，再用洗液（Hanks）轻洗2次后，即在洗液内以大口吸管吹打数次或十数次，此时可见大量细胞游离，液体变浑，经用双层细亚麻布或72孔不锈钢纱网，或4层纱布过滤，收集于离心管以600 rpm离心沉淀5～10分钟，吸弃上清，加入营养液充分吹打至形成均匀的细胞悬液，然后在血球计数板按白细胞进行计数，进一步稀释成为每ml含50万个细胞的浓度，即可装瓶培养。置36～37℃温箱培养，在1～2小时内贴壁，
几小时至十几小时后开始生长，24～48小时长成单层。此时即可更换维持液，并接种病毒。
鸡胚细胞常用的生长液和维持液为：
①生长液。0.5%乳汉液 97 ml，犊牛血清 2～5 ml，双抗液 1 ml。以碳酸氢钠溶液调整pH至7.2～7.4。
②维持液。0.5%乳汉液 98ml，醋酸钠溶液(240 mg/ml) 1ml，双抗液 1ml。根据需要，例如生长情况，加或不加1-2%犊牛血清，并以碳酸氢钠溶液调整pH至7.6左右。
（2）仓鼠肾原代细胞取10～14日龄的幼仓鼠，颈动脉放血致死，无菌取肾脏，移于灭菌平皿，剪去肾脏上的脂肪，剥去肾包膜，除掉肾盂部分，用Hanks液冲洗，移入广口瓶中剪碎，洗净后加0.25%胰酶消化。消化可在37℃水浴中进行，也可置4℃冰箱作冷消化14～18小时。其余操作步骤同前，也配成每毫升50万的细胞悬液。
其生长液为加10%犊牛血清的0.5%乳汉液，维持液犊牛血清用量减半。
（3）驴胎原代细胞选妊娠4～6个月的母驴，剖腹取胚胎，或放血致死，将胎儿连同子宫一起取出，以便保持无菌。取出胎儿剖开胸腹腔，剪取肺、肾、胸腺和肠管等组织，各为拇指头大1-2块，置于灭菌平皿。其后的冲洗、消化和培养方法同仓鼠肾细胞，但其生长液和维持液的血清含量较高，分别达30%和15%～20%（可用大牛血清）。
（4）皮肤原代细胞各种动物的皮肤均可培养，但以胎儿皮肤为宜。一般由腹部或后肢内上侧剪取皮块。随后按上述方法进行冲洗、消化和培养。以0.25%胰酶于4℃冷消化18～20小时的效果较好。营养液为含30%犊牛血清的0.5%乳白蛋白水解物；或0.5%乳白蛋白水解物与E-MEM的等量混合液，内含30%犊牛血清，pH7.2。
（5）猪肾继（传）代细胞取已长成单层的猪肾细胞，倾弃原来的营养液，最后再用Hanks液等冲洗一次。加入0.02%乙二胺四乙酸二钠溶液或0.5%胰酶和0.04%乙二胺四乙酸二钠溶液的等量混合液，其加入量以能在单层细胞上形成 1 mm厚的液层为宜。置室温或37℃温度中消化5～10～30分钟（随细胞种类而不同）。当细胞层开始由瓶壁剥离时，即可将消化液倾出，并加入少量营养液，轻晃冲洗细胞层后倾弃，再加相同于原营养液量的新营养液，以大口吸管充分吹打，直至细胞完全分散，再加同量营养液，吹打数次后即可分装。其分种率为1︰2，即1瓶变2瓶，传代细胞系，其分种率为1︰3或1︰4。
营养液配方：199或E-MEM 45%，0.5%乳白蛋白水解物 45%，犊牛血清 10%，另加抗生素液，调pH 7.0～7.2。
（6）Vero细胞非洲绿猴肾传代细胞系。
取已长成的单层的细胞，倾弃营养液，加入0.25%胰酶液，其加入量为原营养液的1/3，37℃水浴或室温消化，待细胞面开始脱落时，即可翻转培养瓶，并倾去大部分胰酶溶液后，再翻转培养瓶，让残留胰酶液继续呈现消化作用，并加入营养液，吹打和分装。
营养液为E-MEM与0.5%乳白蛋白水解物的等量混合液，内含10%犊牛血清，调pH7.2；维持液的犊牛血清减半，pH7.4～7.6。
（7）Hela细胞取已长成的单层细胞，弃去营养液，用Hanks液洗一次，加入已加温至37℃的0.02%乙二胺四乙酸二钠（EDTA）溶液或0.25%胰酶溶液为1 mm厚，平放于37℃温箱，消化5～10分钟，当细胞开始剥落时，振荡玻瓶，使细胞全部悬浮于消化液中，用大口吸管吹打，使成均匀的悬液，加入等量Hanks液以及少量血清，以每分钟600转离心
5分钟，弃上清，加入适量营养液配成每毫升含3万左右个细胞的悬液。分装培养。
营养液：199培养液 40%，0.5%乳白蛋白水解物40%，犊牛血清 20% ，加抗生素液，调pH7.2～7.4。
维持液：在营养液的基础上将犊牛血清减至2～5%，调pH 7.6。
2．悬浮培养：为能获得大量均匀生长的细胞悬液，早在30年前，人们已开始探索细胞悬浮培养的方法。最先以40～50 rpm转瓶培养，后改用搅拌器搅拌方法，使细胞维持悬浮状态。目前已设计制造出细胞悬浮培养罐，这种罐具有自动加温、搅拌以及空气供应、pH调节等装置，并以射入高压蒸汽的方法灭菌。
六、细胞的保存
细胞株需定期传代，随传代次数的增加，相应地增加了细胞污染和变异（包括恶性变）的危险性，尤其是二倍体细胞株，传代次数增多，会过早发生衰老死亡。
1．细胞培养物的常温保存：进行短期保存，可将已长成的单层细胞换液后置室温或20～22℃温度下避光保存，其生活力可达半个月以上，但维持液的血清量提高5～10%。
如果传代培养时，可降低培养温度至30～32℃，则可延缓生长，老化也迟，可以每隔15～30天传代一次。如这种温度不能形成单层，可先将其置37℃培养，待单层将形成时，再移置30～32℃培养。
长途运送，可选刚刚长成的单层，弃去营养液，加满维持液（不留空气），塞紧，在15～25℃左右运送，夏季炎热可用冰瓶运送。到达目的地后，将维持液倒出，仅剩正常的维持液量，置37℃培养1～2天后，再行传代。
2．细胞培养物的低温保存：该法操作复杂，可按下列步骤进行。
（1）细胞悬液的制备将已长成的单层壮龄细胞，用常规方法消化分散，并以该细胞常用的营养液内作成分散的细胞悬液，倾入离心管，以每分钟500转离心5～10分钟，弃去上清液，于沉淀细胞内加入内含10%二甲基亚砜或甘油的营养液（血清含量为10～15%），吹打并稀释至每毫升含2～5×106个细胞的悬液。在加二甲基亚砜液时，将离心管置于冰浴，必须一滴滴地缓慢加入，以免二甲基亚砜溶液产生潜热，损伤细胞。
甘油和二甲基亚砜均应为化学纯品，甘油以高压灭菌，二甲基亚砜用滤器过滤除菌，两者均分装于小瓶，紧紧加塞后保存于普通冰箱备用，不宜多次开启，以免形成有毒的氧化产物。
Shhannon等1974年曾建议应用较低含量（15%）的二甲基亚砜或甘油作细胞保护剂。
（2）装瓿和封口将细胞悬液分装1毫升于干净的安瓿内，在距离细胞面3厘米处用酒精喷灯封口，以防烫死细胞。封口要十分可靠以免液氮进入，取出时发生爆炸。封口可用10%甲基蓝浸泡10分钟检查。
（3）冷冻 a.将细胞安瓿置于特制的预冻装置，使其温度缓慢下降，每分钟下降1℃，直至－20℃，此后直接置安瓿于－196℃的液氮中。b.没预冷装置，先将安瓿置4℃冰箱2～4小时或过夜，随后置于冰室里（－4～－10℃）1～2小时，再置－15℃和－20℃低温酒精中各半小时，此后迅速置于液氮中。C.再简单的方法是将安瓿加入一适合的纸盒内，内垫棉花加以固定，切勿倾斜，盒外包裹3层棉花，每层厚1厘米，扎紧。置4℃冰箱6小时，再置－20℃冰箱内24小时，取出安瓿迅速置于液氮中保存。
（4）复苏和培养取出安瓿，迅速投入38℃～40℃的水浴锅内，摇动使冰迅速融化（40～60秒）。融化后，用75%酒精消毒安瓿，打开安瓿，用毛细管吸出细胞悬液，置入培养瓶加入10倍量预热37℃的营养液（含血清10～15%），培养4～12小时贴壁后，即可换入新的营养液，继续培养至形成单层。也可在细胞悬液内加入10倍量的营养液后，以500 rpm离心10分钟，弃去上清，再于沉淀细胞内加入营养液，充分悬浮后分装培养。在液氮中保存1～2年，细胞存活率一般可达80～90%。
液氮操作必须十分小心，应穿戴防护服、面罩和手套，特别注意眼睛。
实验四病毒的分离及其理化特性的测定
一、病毒材料的准备
关于病毒材料的准备，在实验一已作叙述。病料经前所述方法处理提取后，在接种前需做无菌检验。
二、接种方法
关于实验动物、鸡胚接种不作介绍，只介绍组织培养细胞接种。
在接种前先选择敏感细胞，进行细胞培养，长成单层后，弃去营养液，并以Hanks液或Earle氏液清洗1－2次，然后加入不同稀释度的接种物（病毒液或待检病料悬液），每个稀释度最少用2－3个细胞培养瓶，接种量以盖满细胞层为度，摇匀后置37℃温箱内感作30～60分钟，使病毒充分吸附于细胞上。
吸附30～60分钟后，加入新的维持液。维持液中的血清不得含抗病毒的抗体。一般而言，维持液中的血清含量应尽可能减少，甚至完全不用。
应用不同稀释度接种物的目的，是避免因病毒接入量太大而引起自身干扰现象，同时也减少接种物中毒性物质造成细胞损伤。如接种物毒性太大，吸附后，将接种液吸弃，再用洗液轻轻洗一次细胞，随后再加入维持液。
三、病毒增殖的判定
1．细胞病变（CPE）：对可引起CPE的病毒根据有无细胞病变的出现，来判定病毒的增殖与否。常见病变有胞浆的颗粒性变、胞核变形浓缩和碎裂，进而导致细胞完全破坏。有些引起细胞融合，有的在胞浆或胞核中形成特异性包涵体。细胞病变经常具有病毒“种”的特性。
细胞病变可在光学显微镜下观察，每天检查1－2次。
2．细胞代谢的测定：有些病毒增殖后不引起细胞病变，但可使感染细胞代谢障碍，致使产酸能力降低，且因细胞破坏释放出碱性成分，结果维持液pH下降不明显。根据这一原理，应用比色法测定感染培养物与对照培养物的pH差异，从而间接推测细胞培养物中有无病毒增殖。
3．抗原或病毒的测定：在病毒感染的细胞培养物中，有病毒的增殖就会有病毒和病毒特异性抗原出现。我们可以用已知的抗体，应用补体结合反应、沉淀反应以及荧光抗体和酶标抗体检查法等血清学方法，来判定有无病毒增殖，而且可以鉴定种类，甚至确定病毒存在的位置。
应用电子显微镜观察，可以直接检查有无病毒的存在，接种实验动物或鸡胚，根据所引起的症状、死亡以及病理变化，判定接种物中病毒的存在。
4．病毒间的干扰现象：利用病毒间经常出现干扰现象，如流感病毒能够干扰西方型马脑炎病毒增殖，乙型脑炎病毒则可干扰脊髓灰质炎病毒等等，在某一细胞培养物中同时加入接种物和可被干扰的病毒，如果后者的增殖抑制，不引起CPE，则可间接判定接种物中
存在一种可干扰后者的病毒。
四、病毒理化学特性的测定
1．病毒核酸类型的鉴定：核酸类型的鉴定可用药物抑制试验和染色法进行。
（1）药物抑制试验根据某些化学药物对DNA病毒和RNA病毒的不同抑制作用，判定新分离病毒的核酸类型。较常用的抑制药物是5-氟脱氧尿核苷（FUDR）和5-碘脱氧尿核苷（IUDR），它们是嘧啶的卤化物，进入细胞后发生磷酸化，掺入新合成的DNA以代替胸腺嘧啶（T），产生无功能分子，从而抑制DNA的合成；有人认为FUDR等强烈抑制一种转化酶，此酶催化尿嘧啶脱氧核糖核苷酸（dUMP）转化为胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸（dTMP），由于此酶受到抑制，DNA的合成受阻。将此药物加入细胞培养物中，对DNA病毒有明显的抑制作用，而对RNA病毒没有或仅有极低的抑制作用。
选择一种对该病毒敏感的细胞，如能产生CPE，则更理想。将几十个小培养瓶的单层细胞，分成两组，先在两组细胞培养瓶内同时分别接种不同稀释度的病毒，例如10-2～10-7，每组每个稀释度至少3瓶，在加维持液时，一组的维持液内含FUDR或IUBR，其浓度为每毫升含50微克，另一组不加药物作为对照，此后逐日观察CPE。由于DNA病毒增殖受到了明显抑制，与未加药物的对照组相比时，抑制滴度一般大于2个对数。RNA病毒不受抑制，与对照组相比，抑制滴度小于1个对数。
应用微量培养板进行此项试验，更为方便。
某些不产生CPE的病毒，则可用其他方法判定病毒的增殖。
（2）Feulgen染色用于鉴定细胞内的DNA病毒。胞核和胞浆内的DNA包涵体呈紫红色。
将飞片上长成的敏感细胞单层，分成4组，分别感染已知的DNA病毒、已知的RNA病毒和待鉴定病毒，另一组不接种病毒作为对照。待单层细胞刚刚开始出现细胞病变时，由瓶内取出飞片，置Carnoy氏固定液中固定20～30分钟，分别于纯乙醇、95%乙醇和70%乙醇中浸洗3～5分钟，再在馏水中涮洗。取4组飞片各2片，分别用胃蛋白酶液处理，37℃10分钟，随后各抽取一片作DNA酶处理，另一片作RNA酶处理，均为37℃30分钟。另取同样4组飞片各2片，分别直接用DNA酶和RNA酶处理如上。将所有上述各飞片置1 N HCl 中于60℃处理10分钟，并用蒸馏水涮洗后，以Shiff氏试剂染色10分钟，再在3杯偏重亚硫酸钠洗剂中顺序涮洗各2分钟。用自来水冲洗至无亚硫酸气味，再于75%乙醇中涮洗，并用固绿溶液复染5秒钟，再用纯乙醇脱水，并置二甲苯中透明，最后用中性香胶封固后镜检。
敏感细胞飞片单层
①②↓③④
2片 2片 2片 2片1片 1片 1片 1片 1片1片1片1片
（3）吖啶橙染色：单链核酸染成火红色，双链核酸染成黄绿色。未感染细胞的胞核呈黄绿色、核仁桔及黄色，胞浆呈暗红色。在感染双链DNA 病毒的细胞核内，出现黄色荧光样物质的微小丝块，核内包涵体也呈黄绿色；在胞浆内复制的双链DNA 病毒和双链RNA 病毒，于红色背景上显示黄绿色着染，单链DNA 病毒在细胞内，复制区呈桔红色。
将待鉴定病毒和对照病毒接种飞片上的单层细胞，置Carnoy 氏固定液中固定15分钟，通过95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇和30%乙醇各2分钟，并在1%枸椽酸溶液中浸泡3分钟，用去离子水涮洗后，浸入枸椽酸—磷酸盐缓冲液中5分钟，置0.01%吖啶橙溶液中（以枸椽酸—磷酸盐缓冲液由1%吖啶橙溶液临时配制），染色
5分钟，再在缓冲液内涮洗5分钟。于一载玻片上滴加1滴缓冲液，将飞片翻转，使标本向下，压在缓冲液滴上，并迅速移置荧光显微镜下观察。
2．脂溶剂敏感性试验：具囊膜的病毒对脂溶剂敏感。
（1）乙醚敏感试验取待鉴定病毒液，以3000 rpm离心20分钟，除去较大颗粒，吸取上清液1.6 ml，分别移入2个灭菌小瓶，各0.8 ml，并于其中一瓶内加入麻醉用乙醚0.2 ml，另一瓶不加乙醚作为对照，两瓶均用橡皮塞塞紧后，置4℃24小时，其间不时振荡（另法是将病毒－乙醚混合瓶和对照瓶置振荡器上振荡60 min，瓶外用冰水致冷），随后以2000 rpm离心20 min，分为两层，上层为乙醚，下层为病毒液，用毛细管吸取病毒液，移入另一小瓶内，吹打使残余乙醚挥发殆尽。再以乙醚处理的病毒液和对照病毒液以不同稀释度感染细胞培养物或实验动物，乙醚处理的病毒液感染滴度明显比对照降低2个对数以上，甚至完全灭活为对乙醚敏感。
（2）氯仿敏感试验取待鉴定病毒液，分为2瓶，一瓶加AR级氯仿使最终浓度为4.8%，另一加入4.8%量生理盐水作为对照，置4℃振荡混合10 min，后以500 rpm离心5 min，取上层液体，同样滴定病毒感染力。如氯仿处理的病毒液的滴度比对照病毒液下降2个对数以上者，判为对氯仿敏感。
（3）去氧胆盐敏感性试验将去氧胆酸钠在内含0.75%牛白蛋白的磷酸缓冲液中作成0.2%浓度，用前加温至37℃。将病毒液在3000 rpm离心半小时（周围用冰水致冷），取上清液1份加入等量0.2%去氧胆酸钠溶液，另1份加等量磷酸缓冲液作为对照，分别混合均匀后置37℃感作1小时后，分别在pH7.0 PBS中4℃透析24小时，除去残余去氧胆酸钠，然后在细胞培养物上滴定感染力，试验病毒液与对照病毒液相比下降2个对数以上者，判为对去氧胆盐敏感。
3．耐酸性试验：测定耐酸性的标准尚未统一，有人以pH 3.0感作2小时为标准，有人却以pH 5.0感作1小时为标准。
将待鉴定的病毒悬液如上离心后，取上清液等量分装于2个小瓶中，用0.1N HCl将1个瓶中的病毒液的pH调至3.0（或5.0），并在另1个小瓶中的病毒液中加入相同于用酸量的灭菌生理盐水作为对照。置37℃水浴或室温中感作2小时（或1小时）后，再用5.6% NaHCO3溶液将pH调回至7.2左右。此后将两瓶病毒液分别用敏感细胞或实验动物测定感染力。如果试验组病毒的感染力比对照组降低2个对数以上乃至完全灭活者，则证明对酸敏感，相差不到1个对数者为耐酸。
4．胰蛋白酶敏感试验：取病毒离心上清液于2个小瓶中各0.5 ml，于一瓶中加入1%胰蛋白酶液0.5 ml，另一瓶加入pH 7.4 Hanks液0.5 ml，用橡皮塞塞紧瓶口，倒转几次使之混匀，置37℃小时，随即各瓶加入灭活犊牛血清4 ml，充分混合以终止胰酶的作用。
《病毒学检验》课程教学大纲 一、课程基本信息 课程名称：病毒学检验（Experimental Virology） 课程编码： 课程类别: 必修课(专业课) 适用专业: 卫生检验学本科 开课学期: 第七学期 课程学时: 63学时（理论学时27，实验学时36） 课程学分：3.5 先修课程：医学寄生虫学及检验、细菌学检验、临床医学概要等 课程简介：病毒学检验是卫生检验重要的专业课程之一，是卫生检验课程体系的重要组成部分，也是卫生检验专业学生必修的考试课程。本课程通过课堂讲授、实验实习、网络自学等方式进行教学。注重培养学生综合性思维能力，重视学生自主学习、自觉学习，分析和解决实际问题能力，以及创新思维和能力的培养。 选用教材：李洪源、王志玉主编：《病毒学检验》，人民卫生出版社，第一版，2006年7月。 参考书: 1. 张朝武主编：《现代卫生检验》，第一版，人民卫生出版社，2005。 2. 李影林主编：《中华医学检验全书》，人民卫生出版社，1996。 3. 王秀茹主编：《预防医学微生物学及检验技术》，人民卫生出版社，2002。 4. 贾文祥主编：《医学微生物学》，四川大学出版社，2005年1月。 5. 李凡、刘星晶主编：《医学微生物学》，人民卫生出版社，第七版，2008年1月。 二、课程教育目标 通过学习，使学生知悉病毒学检验的基本技术和分子生物学技术，知悉 常见重要致病病毒。要求学生掌握病毒的分离培养方法、血清学实验及分子 生物学技术在病毒学检验中的应用；掌握常见重要致病病毒的生物学性状、 检验方法和预防医学意义。为学生能独立开展各种病毒学检验打下良好基 础。
三、理论教学内容与基本要求 绪论 （一）学时：0.5 （二）要求 【掌握】病毒的特性；病毒学检验的内容及其应用范围；病毒学检验的一般原则。 【熟悉】病毒学检验的质量控制；病毒学实验室的生物安全管理。 【了解】病毒学和病毒学检验的发展史。 第一篇病毒学检验技术 第一章细胞培养技术 （一）学时：1.5 （二）要求 【掌握】体外培养细胞的生物学特性；体外细胞培养的条件；组织培养的种类；细胞系和细胞株的概念；细胞培养方法；细胞培养中平衡盐、消化液和血清的作用；细胞检查方法；细胞的冻存。 【熟悉】用于病毒培养的细胞选择、细胞培养操作过程和细胞培养污染与监测。 【了解】细胞培养技术在病毒学研究中的发展；细胞系的鉴定。 第二章鸡胚接种技术 （一）学时：1.5 （二）要求 【掌握】鸡胚的结构；鸡胚的孵育与检查；接种途径与方法及其用途；病毒的检测；鸡胚接种技术的应用。 【熟悉】实验材料、器械与准备。 【了解】鸡胚的解剖与生理。 第三章动物实验技术 （一）学时：1.5 （二）要求 【掌握】实验动物的分类；普通动物、清洁动物、无特定病原体动物、无菌动物、悉生动物；近交系动物、封闭群动物、突变系动物、杂交群动物及其特点；常用实验动物种类及其品系；
实验一《科达电脑外部设备管理信息系统》、上机实验目的 1.了解使用软件开发一个小型信息系统的过程。 2.掌握使用软件保存数据、按使用者要求对数据进行处理输出信息的方法。 3.掌握查询、统计、输出、宏、打印等功能，能较好地使用软件开发信息系统为管理服 务。 、上机实验基本要求 1?在规定上机时间内完成信息系统的开发任务，由指导老师检查通过系统。 2.按时提交上机实验报告。 3.指出系统的创新之处（学生要说明系统的创新点及意义）。 三、开发系统资料 1.开发背景 科达电脑公司是一个销售电脑外部设备和组装电脑的小公司，但成长很快。该公司成立于1997年，由于销售量增长很快，公司考虑扩展其业务。 目前该公司电脑外部设备零售价格的计算依赖于7%?20%的成本加价率和10%的税率，即 成本价乘以成本加价率为税前价格，税前价格乘以（1+税率）为零售价格，零售价格如果有小 数则四舍五入。 2.开发系统资料 下表是该公司一部分外设的数据清单。 120049
3.系统开发基本需求 科达公司希望为该公司外设销售业务设计一个电脑外部设备管理信息系统，要求系统满足以下要求：（1）能输出销售发票（基于上表所列数据），发票上要有公司名称和地址、税务登记号、发票号码、客户名称和地址、以及日期。发票上还应包括商品明细部分，其内容为：商品编号、 商品名称、销售价格（含税），该部分至少能容纳5个条目（即该发票至少能填写5个商品）， 并要给出货款合计数（含税）和税款合计数。 （2）能对电脑外部设备的数据进行添加、删除、修改。 （3）能对电脑外部设备的一些相关数据进行查询。 四、开发任务具体要求 电脑外部设备管理信息系统要分为如下两个子系统。 1.《电脑外部设备数据编辑与查询子系统》 应满足以下要求： （1）有一个完整显示外设清单的数据表，如表1所示。外设清单数据表上应包括公司名称和“电脑外部设备价格表一2005年9月”。 （2）可以在数据表中进行添加、删除、修改数据的操作。 （3）在外设清单数据表中税前价格和零售价格（即最右边的两列）应由系统计算出来，这样可以维护数据的一致性，零售价格还应进行圆整。 （4）所有数据必须格式化，例如增加货币符号和百分号。 （5）未使用的栏目应保持空白，不得出现任何符号如或等。 （6）可以使外设清单数据表按升序排列。 （7）系统应能输出下列查询报告（使用中的自动筛选功能），在外设清单上添加宏操作 按钮，单击按钮可输出上述4个报告。?零售价格小于$500的所有外设
生物学实验常用技术一、分子方面 1、基因工程 1)PCR (Polymerase Chain Reaction) (二楼PCR仪器全部会用) 2)RT-PCR;Q-PCR 3)琼脂糖凝胶电泳;胶回收 4)酶切/链接 5)转化 6)固体/液体LB培养基配制 (高压蒸汽灭菌锅使用方法) 7)质粒大/小抽原理及步骤 (手提、溶液I、II、III作用) 8)基因组DNA抽提 9)RNA提取; 2、蛋白质工程 1)蛋白收集 (蛋白裂解液+PMSF; 1×Loading 裂解(推荐)) 2)SDS-PAGE(电泳胶的配制) 2)考马斯亮蓝染色,银染 3)Western blot 4)蛋白定量常用的方法及原理, 以及熟练操作Bradford法蛋 白定量 (TRIZOL法原理、注意事项及步骤) 二、细胞方面 1)细胞培养、传代 2)细胞冻存与复苏 冻存液配制: (1)DMSO:血清=1:9(推荐)
(2)DMSO:培养基:血清=1:3:6 均可 DMSO为细胞专用型;现用现配,效果最好;冻存时细胞在-80℃中不要超过一周,最好在24-48h内放入液氮罐中保存。 3)细胞培养基配制(过滤除菌)、胰酶配制(过滤除菌),PBS配制(灭菌);(不同培养基的区别;谷氨酰胺(提供氮源),2周补充一次) 4)转染 5)MTT原理及操作(检测细胞存活率或死亡率) 6)碱性磷酸酶实验(ALP,检测细胞分化) (5、6 需学会SPSS软件及graphpad prism5软件使用) 7)Hoechst染色 8)结晶紫染色(不推荐) 9)苏木精/伊红染色 (9可以替代8,以后实验推荐使用9,图片漂亮) 10)荧光显微镜的使用 11)激光共聚焦显微镜样品制备(细胞固定,染色,洗脱) (7、8、9、10、11需学会Photoshop常用工具处理数据) 12)流式细胞仪样品制备(包括:转染效率与细胞凋亡染色标记)以及仪器操作(需学会FlowJo软件分析流式结果) 三、动物实验 1)小鼠的定制: 常见的小鼠: ICR小鼠(正常),9元/只
第一章绪论 一、病的发展简史： A 病毒的发现时期 1.科赫法则内容： 1 .在每一病例中都出现相同的微生物，且在健康者体内不存在； 2 .要从寄主分离出这样的微生物并在培养基中得到纯培养（pure culture）； 3 .用这种微生物的纯培养接种健康而敏感的寄主，同样的疾病会重复发生； 4 .从试验发病的寄主中能再度分离培养出这种微生物来。 B 病毒的化学时期 C 病毒研究的细胞水平时期 D 分子病毒学的研究时期 亚病毒定义subvirus：只含有核酸或蛋白质的病毒，称为亚病毒。包括类病毒、拟病毒（或病毒卫星）、朊病毒。 二、分子病毒学研究的主要内容： （1）病毒基因组的结构与功能 1、双义(ambisense)RNA：即基因组的一部分为正极性，另一部分为负极性。 2、病毒基因组的结构与功能 病毒基因组的核苷酸组成及其排列顺序 基因组中开放阅读框架(ORFs)的数量、位置及其功能 病毒基因组中重复序列元件、调节元件对病毒基因表达和基因组复制的影响 阐明病毒结构基因、调节基因及其编码产物在病毒复制循环中的作用，以及它们与细胞基因及其编码产物的相互作用关系等 （2）病毒表达的调控机理 通过对病毒增强子(enhancer)、启动子(promoter)、衰减子(attnuator)和转座子(transposon)等调控元件的研究，可以阐明病毒基因表达的调控原理。 转座子：用插入序列进行整合的遗传单位（能够重复插入到基因组中许多位点的特殊片段）。衰减子：特定的DNA片段，可以减慢、阻止或停止转录 （3）病毒感染的分子机制 （4）病毒致癌的分子机理 病毒癌基因定义：致癌病的所携带的一段基因，侵染敏感细胞使细胞癌变，转化为癌细胞，生长失去控制，无限分裂增殖。 （5）抗病毒活性物质 1. 抗病毒多肽物质 干扰素是一类能够抑制病毒增殖的重要细胞素。具有很强的抗病毒能力，还有免疫调节和肿瘤抑制的作用。利用DNA重组技术，可以在大肠杆菌中生产出干扰素 2. 淋巴因子：重组克隆生产的IL-1、IL-2肿瘤坏死因子TNF 3. 反义RNA(antisense RNA) 定义：指天然存在的或人工合成的一类RNA分子，它不能编码蛋白质，但它的核苷酸顺序可与相应的RNA或DNA互补配对，从而使蛋白质合成受阻。 将反义RNA与其相应的病毒mRNA或DNA杂交，可以使病毒mRNA编码合成蛋白的功能受阻，从而破坏病毒的复制循环。反义技术：利用反义RNA封闭某个基因的技术。
管理信息系统实验 第一章某学校考试管理信息系统项目规划 一、开发背景介绍 随着现代信息技术和通讯工具的不断更新，基于网络化和数字化的电子文化发展给传统的书本文化带来巨大的冲击，更使得教育领域的教学手段、课堂模式、学习方法、课程教材等面临严峻的挑战。在错综复杂的网络与信息技术面前，如何高效、便捷的利用现代信息技术和网络技术成为一个应用者、管理者应该思考的问题。为了统计学生考试信息，学校通过开发考试管理信息系统可以给出学生在校期间的各种信息及其变化，以及对这些信息的各种统计分析，使管理者能从不同角度对学生个体和群体的成绩情况做出快速准确的分析判断。同时考试也是教学工作的重要组成部分，通过对学生学习质量的分析，还可以为综合评价教师的教学质量，提供依据及时提供所需资料，并以此带动学校信息化管理的步伐，提高教师素质；从学生角度来讲，也可以及时的了解自己的学习情况。 二、项目概况：系统的目标（功能、服务范围和质量） 功能：教学管理人员可以通过该系统添加学院、专业、科目信息、查询修改信息、查询学生成绩；普通教师录入、修改、查询学生成绩；学生只能查询自己的成绩。该系统可以实现包括教学管理人员登陆信息、班级信息、学生信息、老师信息的录入、修改、删除等，考试成绩查询、分析功能等。 服务范围：教务处管理人员、班主任、任课老师、学生、家长
质量：该系统操作简单，使用灵活方便，可以从很大程度上节约学生信息管理的所需的人力、财力，降低管理成本，使学校的学生信息管理更加科学化，提高管理的效率，同时为学校考核学生的综合素质提供必要的、及时的数据支持。 三、可行性分析（从技术、时间、资源、人员方面进行分析） 人员方面：本系统简单易懂，伴随着电脑的普及，普通职员所掌握的高级办公自动化、VB等电脑知识足以应对，日常使用中并不需要专业性很强的人员。 技术方面：本系统采用Microsoft Office Access和Microsoft Office Vi sio软件进行开发，这两个软件是微软公司推出的开发环境，是目前流行的Win dows平台应用程序开发环境。 资源方面：系统开发部不需要很多的资金投入，硬件依靠学校的计算机设备即可，开发人员可由学校内相关技术人员担任，只需支付相关人员工资，不许再耗费其他费用。所以在资源上完全可行。 时间方面：该系统的开发必然需要一定的时间，并且后期的调试运行也会延迟系统的交付使用，可以通过加强系统开发人员与使用者的交流，尽量一次性满足使用要求，减少返工。 综上所述，该信息系统的开发是必要和可行的，可以进行开发。 四、约束条件分析 本系统虽然简洁简单，但依然有部分数据存在冗余，信息更新不及时等不足之处，而且界面不能使用户随时能够掌握任务的进展情况，容错功能一般，容易造成误操作、按键连击等导致数据误录。成绩录入时没有成绩的批量录入，使得
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
病毒得特点: 1、形体微小,能通过细菌滤器,用电子显微镜才能观察到。 2、无细胞结构,其主要成分就是核酸与蛋白质 3、每种病毒只含有一种类型得核酸(RNA或DNA) 4、因缺乏完整得酶系统与能源,故只能寄生于活细胞内,依靠宿主细胞得代谢系统合成蛋白质与核酸 5、病毒以其基因为模板,在宿主细胞内复制出新得病毒颗粒 6、为了在生物界保存其种属,病毒具备从一个宿主转移到另一个宿主得能力,并具有对敏感宿主得侵染性与复制性 7、在宿主体外,能以大分子状态存在,并可长期保持其侵染能力 8、有些病毒得核酸能整合到宿主细胞得基因组中,并能诱发潜伏感染 体外细胞培养得基本条件: 1、条件要求高,培养液组分复杂,需要添加血清才能满足生长需要 2、避免微生物污染,需要在培养液中加入抗生素。 3、体外细胞培养得基本要求主要包括细胞接种(尽量选择对数期细胞接种)、 4、培养液营养成分、 5、酸碱度(能耐受得ph范围为 6、6- 7、8,依靠缓冲系统调节)、 6、气体条件(细胞生长需要CO2 ,大规模培养需要有足够得氧气)、 7、温度(最适温度为35-37。C)、 8、水得纯度(一般要求去离子水或三蒸水)、 9、无菌条件等 实验动物得微生物控制分类: 1、普通动物,一级动物,要求不携带动物烈性传染病与人兽共患病病原 2、清洁动物,二级动物,在一级动物要求上,不携带对动物危害大、对实验干扰大得病原 体,外观健康,主要器官不得有组织病理学病变 3、无特定病原体动物,三级动物,除普通动物、清洁动物不得携带病原体外,还要求排除 潜在感染或条件致病菌得感染 4、无菌动物,四级动物,要求在体内外不得检出其它生命体 实验动物得遗传学分类 1、近交系,指经过连续20代以上全同胞或亲子交配培育得动物品系 2、封闭系,不从外界引入新得血缘,非近亲交配方式得实验动物群体 3、突变系,由于遗传基因发生突变而具有某些特殊形状得动物 4、杂交群动物,由不同品系杂交所产生得后代 5、转基因动物,插入外源基因后能正常繁殖得动物 大鼠、小鼠得采血方法 1、剪尾采血,动物麻醉后,将尾端剪去约5mm,待血液流出采集,小鼠可每次采血0、1ml, 大鼠约0、4ml 2、眼眶后静脉丛采血,拇指及食指抓住鼠两耳之间得皮肤固定,轻轻压迫颈部两侧,使眼 球充分外凸。采血管插入眼角与眼球之间,向眼底方向刺入,切开静脉丛,血流即流入取血管。 3、颈(股)动脉或颈(股)静脉采血,麻醉动物,剪去被毛,作颈静脉或劲动脉分离术后采血 4、摘眼球采血,采血时,用左手固定动物,压迫眼球,尽量使眼球凸出,右手用弯头镊子摘 除眼球,迅速采集血液 病毒得纯化方法:
洛阳理工学院 课：实验报告 课程名称_____________ 管理信息系统___________________ 设计题目_____________ 实验三：系统设计_______________ 专业______________ 工程管理______________________ 班级_______________ B150703 __________________ 学号________________ B15070314 ________________ 姓名________________ 肖志涵______________________ 完成日期___________ 2017年11月17日________________ 一、实验目的或要求 1、熟练掌握数据流程图的绘制
2、编制数据字典 3、熟悉管理信息系统的代码设计 4、设计系统的功能结构图 二、主要设备 DELL optiplex 380 , Winxp、Word 2010 三、实验内容 1、请根据以下要求画出数据流程图：读者到图书馆还书，图书馆工作人员 根据读者文档和图书文档的数据办理还书处理。如果还书时所还书已过期，则计 算罚款，并办理罚款手续或记入罚款文档。同时检查预约文档中有无其它读者预约此 书，若有则根据预约数据发到书通知。 2、根据下述情况制出表格分配图。 采购部门准备的采购单为一式四份：第1张送供货方；第Z张送交收货部门， 用丁登入待收货登记册；第3张交会计部门作应付款处理，记人应付账；第4 张留在采购部门备查。 3、某企业负责处理订货单的部门每大能收到40份左右的来自顾客的订货单，订货单上的项目包括订货单编号、顾客编号、产品编号。数量、订货日期、交货日期等。试根据这一业务情况，写出数据字典中的“订货单”数据流定义。 4、设计出学校教学管理信息系统的代码，内容包括学号，院系编号，专业编号,班级编号,课程编号，教师代码，教室代码。说明相关代码的含义。
2020智慧树知到《病毒学检验》章节测试 题【完整答案】 2020智慧树知到《病毒学检验》章节测试答案 绪论 1、用于测量病毒大小的单位是： A.μm B.nm C.pm D.fm E.am 答案: nm 第一章 1、PCR反应的引物需要2条。 A:对 B:错 答案: 对 2、甲型肝炎病毒归属于嗜肝DNA病毒科 A:对 B:错 答案: 错 3、病毒只含有一种核酸，DNA或RNA A:对
B:错 答案: 对 4、乙肝大三阳时，以下哪些项应为阳性 A:HBsAg B:HBeAg C:HBcAg D:抗HBc E:抗HBs 答案: HBsAg,HBeAg,抗HBc 第二章 1、可传播HIV的途径有 A:分娩 B:共用牙刷、剃须刀等 C:输血、血浆及血液制品 D:手术器械 E:皮肤接触 答案: 分娩,共用牙刷、剃须刀等,输血、血浆及血液制品,手术器械 2、狂犬病防治措施有 A:捕杀病犬加强家犬管理 B:人被咬伤后应及时处理伤口 C:动物咬伤后应及时接种狂犬病疫苗
D:及时足量注射丙种球蛋白 E:对可疑患者或严重咬伤者在作用疫苗前注射抗狂犬病病毒血清 答案: 捕杀病犬加强家犬管理,人被咬伤后应及时处理伤口,动物咬伤后应及时接种狂犬病疫苗,对可疑患者或严重咬伤者在作用疫苗前注射抗狂犬病病毒血清 第三章 1、DNA的Tm值大小与下列哪个因素有关 A:温度的升高 B:酸碱度的改变 C:DNA的均一性 D:化学试剂 E:缓冲液 答案:B 2、下列哪项决定了PCR特异性与产量( ) A:变性温度 B:退火温度 C:延伸温度 D:循环次数 E:二价阳离子 答案:B 3、基因分型的传统方法是( )
试题 1 一、选择题 【A型题】 1．关于病毒基本性状叙述错误的是： A ．体积微小，无细胞结构 B．只能在活细胞中增殖 D．对干扰素敏感 E．耐冷不耐热 2．用于测量病毒大小的单位是： A．微米(μm) C．微微米(pm) D．毫微微米(fm) E．微微微米(am) 3．关于病毒结构叙述错误的是： A．核酸和衣壳组成核衣壳 C．衣壳由壳粒构成 D．病毒包膜表面可有刺突 E．各种病毒壳粒数目不相同 4．可称为病毒体的结构是： B．核酸 C．衣壳 D．包膜 E．壳粒 5．呈二十面体立体对称的DNA病毒是： B．风疹病毒 C．正粘病毒 D．弹状病毒 E．脊髓灰质炎病毒 6．呈螺旋对称型的RNA病毒是： B．腺病毒 C．痘类病毒 D．疱疹病毒 E．脊髓灰质炎病毒 7．决定病毒具有感染性的是： B．衣壳 C．包膜 D．神经氨酸酶 E．血凝素 8．病毒的增殖方式是： B．二分裂 C．分枝 D．减数分裂 E．芽生 9．下述与病毒蛋白质无关的作用是： A．吸附作用 B．保护核酸作用 C．病毒包膜的成分 E．免疫原性 10．病毒所合成的晚期蛋白的功能是： A．抑制宿主细胞蛋白质的合成 B．合成包涵体的基质蛋白 D．抑制宿主细胞核酸的合成 E．合成子代核酸所需要的DNA多聚酶 11．以破胞方式从细胞向外释放的病毒是： A．流感病毒 B．麻疹 D．腮腺炎病毒 E．呼吸道合胞病毒 12．以“出芽”方式从细胞释放的病毒是： A．ECHO病毒 C．柯萨奇病毒 D．腺病毒 E．脊髓灰质炎病毒 13．对病毒抵抗力叙述错误的是： A．大多数病毒60℃30分钟可被灭活 B．大多数病毒在－70℃下可存活 C．紫外线能灭活病毒 D．甲醛能使病毒灭活，但保留抗原性 14．一种病毒所产生的衣壳或包膜包在另一种 病毒基因组外，这种变异称之为 A．突变 B．基因重组 C．加强作用 E．互补作用 15．下述哪种属于病毒基因突变： A．交叉复活 B．多重复活 D．互补作用 E．表型混合 16．病毒与立克次体相同的特点是： A．含有DNA和RNA C．含有核蛋白体 D．以二分裂方式进行繁殖 E．对抗生素敏感 17．病毒不同于衣原体的特点是： A．能通过细菌滤器 C．可引起机体多部位感染 D．严格地细胞内寄生 E．在感染细胞内可形成包涵体 18．无包膜的病毒是： A．疱疹病毒 B．披膜病毒 C．流感病毒 E．狂犬病病毒 【B型题】 A 衣壳 B 核酸 C 包膜 D 核衣壳 E 壳粒 19．储存病毒遗传信息的是：B 20．保护病毒核酸的是：A 21．无包膜病毒完整病毒体的是：D 22．电镜下可见的病毒形态学最小单位是：E 23．含有宿主细胞成分的是：C A 裸露20面体对称型 B 裸露螺旋对称型 C 有包膜20面体对称型 D 有包膜螺旋对称型 E 复合对称型 24．流感病毒是：D 25．肠道病毒是：A 26．噬菌体：E 27．单纯疱疹病毒：C A 有包膜RNA病毒 B 无包膜RNA病毒 C 有包膜DNA病毒 D 无包膜DNA病毒 E 缺陷病毒： 28．流行性乙型脑炎病毒： A 29．丁型肝炎病毒：E 30．乙型肝炎病毒：C 31．腺病毒： 32 戊型肝炎病毒：B A 正粘病毒科 B 副粘病毒科 C 披膜病毒科 D 肝DNA病毒科
病毒的特点是：1、形体微小，能通过细菌滤器，用电子显微镜才能观察到。2、无细胞结构，其主要成分是核酸和蛋白质3、每种病毒只含有一种类型的核酸（RNA或DNA）4、因缺乏完整的酶系统和能源，故只能寄生于活细胞内，依靠宿主细胞的代谢系统合成蛋白质和核酸5、病毒以其基因为模板，在宿主细胞内复制出新的病毒颗粒6、为了在生物界保存其种属，病毒具备从一个宿主转移到另一个宿主的能力，并具有对敏感宿主的侵染性和复制性7、在宿主体外，能以大分子状态存在，并可长期保持其侵染能力8、有些病毒的核酸能整合到宿主细胞的基因组中，并能诱发潜伏感染 细胞培养技术：是对由组织分散成的单个细胞或某一型细胞群进行的体外培养方法，即模拟体内的生理环境条件，提供细胞适宜的营养条件和温度，在无菌操作的基础上，使离体组织细胞生长增殖并进行传代的技术 二、单层细胞培养： 用于培养病毒的细胞有原代细胞、传代细胞（二倍体细胞株和传代细胞系） 三、鸡胚的接种途径：1、羊膜腔接种2、绒毛尿囊膜接种3、尿囊腔接种4、卵黄囊接种 四、 间接计数在病毒检验过程中较为常用，是判定病毒感染性的定量方法，常用的有：空斑形成单位法，50%终点法，血凝试验和干扰测定 空斑形成单位（PFUs）试验：是将不同稀释倍数的动物病毒与平铺于平板表面的宿主细胞混合，当病毒颗粒在一大片宿主细胞上引发感染时，会造成细胞被溶解而形成空斑，每个空斑系由一个病毒颗粒所造成，计算空斑数目再乘以稀释倍数，即可得知原来的病毒感染单位的浓度 凡事能在细胞培养物中产生CPE的病毒都可用空斑技术来测定其滴度。 50%终点法：是将病毒悬浮液经一系列稀释后，接种至动物、鸡胚或培养成单层的细胞，将每个稀释度造成的动物、鸡胚致死量或细胞病变做曲线，找出造成50%动物、鸡胚死亡或病变的终点稀释度。 LD50：为造成50%动物或鸡胚死亡的病毒含量 ID50：即是指可造成50%动物或鸡胚感染的剂量 CCID50：造成50%细胞培养产生病变效应的剂量 五、病毒纯化的一般原则：1、释放病毒至细胞外2、去除细胞碎块3、病毒悬液浓缩 六、病毒的保存：1、用低温（-60~25℃）、超低温（-70以下）冰箱或液氮罐（-196~150）保存 2、冷冻干燥保存 七、血清学实验的方法很多，最常用的是中和试验、补体结合试验、红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验 中和试验：是在体外适当条件下孵育病毒与特异性抗体的混合物，使病毒与抗体相互反应，再将混合物接种到敏感的宿主体内，然后测定残存的病毒感染力的一种方法。 中和抗体：凡是能与病毒结合，并使其失去感染力的抗体称为中和抗体 中和试验必须在敏感的动物体内（包括鸡胚）和细胞培养中进行
智慧树知到《病毒学检验》章节测试答案绪论 1、用于测量病毒大小的单位是： A．μm B．nm C．pm D．fm E．am 答案: nm 第一章 1、PCR反应的引物需要2条。 A:对 B:错 答案: 对 2、甲型肝炎病毒归属于嗜肝DNA病毒科 A:对 B:错 答案: 错 3、病毒只含有一种核酸，DNA或RNA A:对 B:错 答案: 对
4、乙肝大三阳时，以下哪些项应为阳性 A:HBsAg B:HBeAg C:HBcAg D:抗HBc E:抗HBs 答案: HBsAg,HBeAg,抗HBc 第二章 1、可传播HIV的途径有 A:分娩 B:共用牙刷、剃须刀等 C:输血、血浆及血液制品 D:手术器械 E:皮肤接触 答案: 分娩,共用牙刷、剃须刀等,输血、血浆及血液制品,手术器械 2、狂犬病防治措施有 A:捕杀病犬加强家犬管理 B:人被咬伤后应及时处理伤口 C:动物咬伤后应及时接种狂犬病疫苗 D:及时足量注射丙种球蛋白 E:对可疑患者或严重咬伤者在作用疫苗前注射抗狂犬病病毒血清 答案: 捕杀病犬加强家犬管理,人被咬伤后应及时处理伤口,动物咬伤后应及时接种狂犬病疫苗,对可疑患者或严重咬伤者在作用疫苗前注射抗狂犬病病毒血清
第三章 1、DNA的Tm值大小与下列哪个因素有关A:温度的升高 B:酸碱度的改变 C:DNA的均一性 D:化学试剂 E:缓冲液 答案:B 2、下列哪项决定了PCR特异性与产量（）A:变性温度 B:退火温度 C:延伸温度 D:循环次数 E:二价阳离子 答案:B 3、基因分型的传统方法是（） A:反向杂交 B:质谱 C:基因芯片技术 D:焦磷酸测序技术 E:超深度焦磷酸测序 答案:A
第一章供应链基础设置功能概述 用友供应连接管理系统是一个通用系统，其中包含面向不同企业对像的解决方案。而不同企业所属不同，管理模式不同，业务处理也有一定差异。那么，如何将通用系统与企业特色相结合，构造适合与企业管理特点的供应链管理系统呢？一般来说，企业应该经大量调剂，对本行业本企业的生产经营特点进行具体深入的分析，并结合供应链管理系统所提供的管理功能，来确定企业个性化应用方案。 供应量管理系统的建立工作是系统管理中完成的。系统管理的主要功能是对用友ERP-U8.72管理系统的各个产品进行统一的操作管理和数据维护，包括以下内容。 .帐套管理：帐套指的是一组相互关联的数据，每一个企业（或每一个独立核算部门）的数据在系统内部都体现为一个帐套，帐套管理包括帐套的建立、修改、引入和输出等 .年度账管理：在用友ERP-U8.72管理系统中，每个账套李都存放企业不同年度的数据，成为年度帐。年度账管理包括年度账的建立、引入、输出和转账上年数据，清空年度数据等。 .操作员及其权限的集中管理：为了保证系统数据的安全与保证，系统管理提供了操作员及期权先集中管理功能。通过对系统操作分工和权限的管理，一方面可以避免与业务无关的人员进人系统，另一方面可以对系统所包含的各个子系统的操作进行协调，以保证各负其责。操作员和其权限的管理主要包括设置用户、定义角色及设置用户权限。
一个帐套可以有多个子系统组成，这些子系统共享公共的基础信息。再起用新帐套时，根据企业的实际情况和业务要求，先手工整理传一份基础材料，而后将这些材料按照系统的要求录入到系统中，以便完成系统的初始建账工作。基础设置的内容较多，主要包括部门档案、职员档案。 客户分类、客户档案、供应商分类及供应商档案等。 实验目的与要求 系统地学习系统管理和基础设置的主要内容与操作方法。要求掌握系统管理中设置操作员、建立账套和设置操作员权限的方法，掌握基础设置的内容和方法，熟悉账套输出和引入的方法。 教学建议 供应链基础设置是学习和使用的ERP供应链管理系统的基础。 建议本章讲授4课时，上机操作4课时。 实验一系统管理 实验准备 已经安装用友ERP-U8.72供应链管理软件。分析本企业所在行业、经济类型和生产经营特点，了解企业管理核算和管理要求，确认企业个性化的应用方案。 实验要求 。增加操作员 。建立核算账单账套（暂时不启用任何系统） 。对操作员进行授权 。启用供应链及其相关子系统
病毒的特点： 1、形体微小，能通过细菌滤器，用电子显微镜才能观察到。 2、无细胞结构，其主要成分是核酸和蛋白质 3、每种病毒只含有一种类型的核酸（RNA或DNA） 4、因缺乏完整的酶系统和能源，故只能寄生于活细胞内，依靠宿主细胞的代谢系统合成蛋白质和核酸 5、病毒以其基因为模板，在宿主细胞内复制出新的病毒颗粒 6、为了在生物界保存其种属，病毒具备从一个宿主转移到另一个宿主的能力，并具有对敏感宿主的侵染性和复制性 7、在宿主体外，能以大分子状态存在，并可长期保持其侵染能力 8、有些病毒的核酸能整合到宿主细胞的基因组中，并能诱发潜伏感染 体外细胞培养的基本条件： 1、条件要求高，培养液组分复杂，需要添加血清才能满足生长需要 2、避免微生物污染，需要在培养液中加入抗生素。 3、体外细胞培养的基本要求主要包括细胞接种（尽量选择对数期细胞接种）、 4、培养液营养成分、 5、酸碱度（能耐受的ph范围为6.6-7.8，依靠缓冲系统调节）、 6、气体条件（细胞生长需要CO2 ，大规模培养需要有足够的氧气）、 7、温度（最适温度为35-37。C）、 8、水的纯度（一般要求去离子水或三蒸水）、 9、无菌条件等 实验动物的微生物控制分类： 1、普通动物，一级动物，要求不携带动物烈性传染病和人兽共患病病原 2、清洁动物，二级动物，在一级动物要求上，不携带对动物危害大、对实验干扰大的 病原体，外观健康，主要器官不得有组织病理学病变 3、无特定病原体动物，三级动物，除普通动物、清洁动物不得携带病原体外，还要求 排除潜在感染或条件致病菌的感染 4、无菌动物，四级动物，要求在体内外不得检出其它生命体 实验动物的遗传学分类 1、近交系，指经过连续20代以上全同胞或亲子交配培育的动物品系 2、封闭系，不从外界引入新的血缘，非近亲交配方式的实验动物群体 3、突变系，由于遗传基因发生突变而具有某些特殊形状的动物 4、杂交群动物，由不同品系杂交所产生的后代 5、转基因动物，插入外源基因后能正常繁殖的动物 大鼠、小鼠的采血方法 1、剪尾采血，动物麻醉后，将尾端剪去约5mm，待血液流出采集，小鼠可每次采血 0.1ml，大鼠约0.4ml 2、眼眶后静脉丛采血，拇指及食指抓住鼠两耳之间的皮肤固定，轻轻压迫颈部两侧， 使眼球充分外凸。采血管插入眼角与眼球之间，向眼底方向刺入，切开静脉丛，血流即流入取血管。
常规病毒学实验技术 （一）病毒的培养 实验动物：家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠 主要用于： ①分离病毒，并借助感染范围试验鉴定病毒 ②培养病毒，制造抗原和疫苗 ③测定各毒株之间的抗原关系，（用实验动物作中和试验和交叉保护实验） ④制备免疫血清和单克隆抗体 ⑤作病毒感染的实验研究，包括病毒毒力测定、建立病毒病动物模型等 注意：选择对目的病毒敏感的实验动物品种品系，以及适宜的接种途径和剂量。 鸡胚 （一）条件要求 SPF鸡、孵化温度38-39℃，湿度40-70%，通风。新鲜受精卵：产下后不超过10天并保存10℃左右。 （二）优点 组织分化程度低，可选择不同的日龄和接种途径，病毒易于增殖，感染病毒的组织和液体中含有大量病毒，容易采集和处理，而且来源充足，设备和操作简便易行。 （三）接种途径 1．绒毛尿囊膜接种（10-12日龄鸡胚） 主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。 1）方法一（造人工气室） ①在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm的 烤焦圈。 ②用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳，造成卵窗。 ③在气室端中央钻一个小孔。 ④用针尖挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜。 ⑤滴加滴生理盐水于刺破处，用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成气室内负压， 使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理盐水迅速渗入。 ⑥用1ml注射器滴入2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。 ⑦用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的 小孔用石蜡密封。 ⑧鸡胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。 2）方法二 ①在气室端的卵壳上开约1.5×1.5cm的口。 ②用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜。 ③滴入接种物。 ④用透明胶纸封闭开口。 2．尿囊腔接种（10-11日龄） 用于正粘病毒和副粘病毒（NDV）
管理信息系统设计与实践 实验教程 陈继红编著 计算机科学与技术学院
第1章实验的目的与基本要求 一、实验目的 学习设计与开发管理信息系统的基本方法和技能，进一步加深管理信息系统的设计原理及方法的理解，熟练掌握用C++ Builder开发管理信息系统方法。为毕业设计打下坚实的基础。 二、实验要求 1. 上机前要做好充分的准备，包括设计方案、程序框图、源程序清单、调试步骤、测试方法、对运行结果的分析等。 2. 上机时要遵守实验室的规章制度，爱护实验设备。要熟悉与实验有关的系统软件、开发环境的使用方法。在程序的调试过程中，有意识地学习及掌握集成环境调试程序的方法及技巧。 为了更好地进行上机管理，要求用硬盘储存程序，并建立和使用子目录，以避免文件被别人删除。 3．程序调试完后，须由实验指导教师在机器上检查运行结果。每个实验完成后，应写出实验报告。实验报告的要求如下： ①设计说明：用来说明设计的内容。它包括：程序名、功能、原理及算法 说明、程序及数据结构、主要符号名的说明等。 ②调试说明：便于学生总结经验提高编程及调试能力。它包括：调试情况， 如上机时遇到的问题及解决办法，观察到的现象及其分析，对程序设计 技巧的总结及分析等；程序的输出结果及对结果的分析；实验的心得体 会等。 ③程序框图。 ④程序清单。
第2章主窗体的设计与实现 一、实验目的与要求 1．熟悉C++ Builder开发环境。 2．掌握主窗体的设计方法。 二、实验内容 新建一个工程，完成主窗体的设计。主窗体包括菜单栏、工具栏及状态栏。运行界面如图所示： 三、设计步骤 1．新建一个工程，方法为：File → New → Application。 2 3．在窗体中加入MainMenu、ImageList、ToolBar、StatusBar控件各一个，分别设置各控件属性：
第三篇病毒学实验技术 实验学时计划：实验一实验须知6小时；实验二细胞培养用水的制备及检验15小时；实验三组织培养技术20小时；实验四病毒的分离及其理化性质的测定20小时；实验五病毒提纯技术15小时。 实验一实验须知 一、实验室注意事项 1．凡参加病毒学实验的人员均应接种与实验有关的病毒疫苗。 2．实验室内，特别是组织培养操作室，须经常保持干燥、清洁。在进行病毒接种或无菌操作前后，均应用紫外线照射灭菌，必要时可用3～5%的酚或煤酚皂溶液擦拭或喷雾消毒。 3．进入操作室，须先洗净双手并用消毒药水严格消毒；更换拖鞋，戴口罩和帽子，穿消毒的实验服。 4．病毒实验操作完毕后，将所穿戴实验服、口罩、帽子和拖鞋等物，出操作室前须更换；两手须经消毒药水严格浸洗后方能外出。 5．一个接种操作室，严禁同时进行两株病毒株的传种；吸取病毒材料时，勿于悬空吹出或打出。 6．凡沾病毒材料的吸管、试管等器具，须随时投入5%煤酚皂或1%盐酸溶液内，浸泡过夜，或煮沸消毒后才能进行洗涤。 7．凡带有感染性的鸡胚或动物尸体，须立即投入炉内焚化或进行煮沸消毒，或盛入容器内进行高压消毒后，方能携出室外进行处理。 8．工作人员要随时注意安全操作，以免发生事故；如发生意外，应迅速采取有效措施补救。 二、病毒材料收集、运送和保存 （一）材料的收集 分离病毒的成功率与采集材料有密切的关系。采集病料必须在适当的部位和时间内进行，前者与各种传染的发病机理有关，后者常规在疾病早期，因为通常在疾病刚出现时病毒的滴度高。各种病毒感染所采适宜病料参见图1和图2。 由于许多病毒的不稳定性，欲作病毒分离的材料，都应尽快的冷藏。－30℃保存的病毒材料（除少数例外），至少可以活存几个月以上；而－70℃保存的病毒，甚至几年不见毒力降低。有些病毒需在潮湿环境下保存，有的则需干燥环境（如Orf virus）。
1 系统概述 1.1选题来源 大学生面对购买生活学习的物品，有网购、从商店超市购买等渠道。但其中弊端很多。大学生学生最深的体会就是，宿舍里放着很多已经对自己无用的物品，无论是在校大学生或是即将毕业的大学生都有很多二手货品留着没什么用，弃之可惜。如：课本书籍、自行车、座椅等。所以大学生很需要一个二手货交易平台。 1.2研究的目的和意义 目的：帮助需要销售二手货的同学快捷方便的找到买家，帮助需要购买物品的同学快捷准确的找到便宜实惠想要买的物品，节省生活开销。 意义：节省时间，不浪费物资，促使整个校园形成节约环保、互帮互助的好风气。 1.3系统的目标和管理需求 本系统需要设计客户端和管理端，其中客户端包括公共信息浏览、公共信息查询、个人信息管理、购物信息、前台订单处理（结账）。管理端包括用户管理、公告消息管理、商品管理、后台订单处理等。 大学生二手货交易平台系统目标是为了在校学生提供一个良好的交易平台。本系统基于Visual Basic和Microsoft SQL Server开发出来的，如今的电子商务网站也越来越多，此交易平台将传统的交易逐步引向网络中。
1.4系统开发的可行性 （1）管理的可行性 交易平台学校可以指派学生进行维护，而且由于只对学校的学生，老师开放的平台维护起来相对方便而且安全性也容易保证，例如学生可以用学号注册，由于用户特点比较统一各项管理措施可以比较有针对性。 （2）技术的可行性 大学生二手货交易平台主要通过Visual Basic编程技术对其进行开发和实现的。本系统所需要设计的功能难度不大，加上还有有指导老师和查找相关参考文献，所以在技术上是可以完成的。 （3）经济的可行性 广大大学生具有收入单一、消费多样化和消费观念开放等独特的生活忙时和消费心理，毕业生不可能将留存的东西带走，宿舍空间有限，大学生有很多无用物品无法处理，大学生对校内二手货物品需求量大等。使得二手货交易平台更受大学生欢迎 （4）用户使用可行性 所开发的软件系统是基于微型计算机图形界面的操作，所以会一般的计算机操作即可使用本系统。系统管理员要求有计算机的专业知识。对系统管理员将进行专业培训，使其能够对熟练管理本系统。
2006 年《分子生物学实验技术》实验内容 RT-PCR （一）总 RNA的提取 实验安排：每两人抽提一管。为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。 操作步骤： TM（苯冰预冷的900μlLS -Biotragents液体样品加入 1.5ml Ep管中，再加入1、将100μ l 酚和异硫氰酸胍的混合物）。 2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。 3、加入200μl 氯仿，颠倒Ep 管混和两次，并剧烈振荡混和10s。 4、在4℃条件下，以10000×g 离心15min。 5、将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。 6、在4℃条件下，以10000×g离心15min 后，小心并尽可能地去除全部上清夜。 7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁。 8、将RNA 沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl 无RNase污染的水（RNase- Free Water）将RNA 溶解并于-20℃保存。 注意事项： 1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr 或更长时间。 2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC 水浸泡过夜。 3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr 以上。然后用高压灭 菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC 处理过的无菌双蒸水 配制，然后经0.22μm 滤膜过滤除菌。 4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。 二）反转录 实验安排： 每人做一管反应体系（20μ l）：按下列顺序加样 μl4 5× Buffer