常规病毒学实验技术
（一）病毒的培养
实验动物：家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠
主要用于：
①分离病毒，并借助感染范围试验鉴定病毒
②培养病毒，制造抗原和疫苗
③测定各毒株之间的抗原关系，（用实验动物作中和试验和交叉保护实验）
④制备免疫血清和单克隆抗体
⑤作病毒感染的实验研究，包括病毒毒力测定、建立病毒病动物模型等
注意：选择对目的病毒敏感的实验动物品种品系，以及适宜的接种途径和剂量。
鸡胚
（一）条件要求
SPF鸡、孵化温度38-39℃，湿度40-70%，通风。新鲜受精卵：产下后不超过10天并保存10℃左右。
（二）优点
组织分化程度低，可选择不同的日龄和接种途径，病毒易于增殖，感染病毒的组织和液体中含有大量病毒，容易采集和处理，而且来源充足，设备和操作简便易行。
（三）接种途径
1．绒毛尿囊膜接种（10-12日龄鸡胚）
主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖。
1）方法一（造人工气室）
①在胚胎附近近气室处，选择血管较少的部位，用电烙器在卵壳上烙一个直径约3-4mm的
烤焦圈。
②用碘酊和酒精消毒后，小心用刀尖撬起卵壳，造成卵窗。
③在气室端中央钻一个小孔。
④用针尖挑破卵窗中心的壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜。
⑤滴加滴生理盐水于刺破处，用橡皮乳头紧贴于气室中央小孔上吸气，造成气室内负压，
使卵窗部位的绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室，此时可见滴于壳膜上的生理盐水迅速渗入。
⑥用1ml注射器滴入2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。
⑦用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中，周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的
小孔用石蜡密封。
⑧鸡胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。
2）方法二
①在气室端的卵壳上开约1.5×1.5cm的口。
②用灭菌眼科镊子撕去一小片内壳膜。
③滴入接种物。
④用透明胶纸封闭开口。
2．尿囊腔接种（10-11日龄）
用于正粘病毒和副粘病毒（NDV）
1）画出气室和胚位
2）在气室接近胚位处涂沫碘酊和酒精消毒
3）用钢锥穿一小孔
4）将注射器针头沿此小孔插入0.5-1cm，注入接种物
5）用石蜡封口，置孵卵箱中孵育，每天翻卵1-2次
3．卵黄囊接种（6-8日龄）
主要用虫媒病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等的分离和增殖。
1）画出气室和胚位
2）垂直放置在卵座上，用碘酊和酒精消毒气室外端
3）以钢锥在气室中央锥一小孔
4）将注射器针头沿此小孔插入3cm，注入接种物
5）用石蜡封口，置孵卵箱中孵育，每天翻卵1-2次
4．其它接种途径
羊膜腔接种，正粘病毒和副粘病毒
静脉接种，蓝舌病毒
脑内接种，狂犬病毒
组织培养
原代细胞：应用胰酶等分散剂将动物组织消化成单个细胞悬液，适当洗涤以后，加入营养液，通常即可使其贴附于玻璃壁上，并生长增殖。
继代细胞：将原代细胞从玻璃瓶壁上消化下来再作培养。
传代细胞：由于遗传突变或者在理化学物质和致瘤病毒的作用下，组织培养细胞中有时出现恶性变细胞，也就是癌变细胞，这种病变细胞具有很高的增殖势能，而且几乎
可以无限地传代。
原代细胞培养（以鸡胚成纤维细胞为例）
1）在无菌条件下采取9-10日龄鸡胚，置灭菌平皿中，除去头（或仅除去喙和眼）、爪和内脏，并剪成块。
2）用Hanks液，充分冲洗后移入大号青霉素瓶或其它广口瓶中，用眼科剪剪成1mm3大小的碎块。
3）加入Hanks液，充分冲洗，并静置几分钟，待组织块下沉，吸弃上层液体，再加洗液。
如此反复冲洗2-3遍。
4）于沉淀组织块内加入约4倍量的0.25%胰酶，并调整pH至7.6-7.8，振荡混匀后置37℃水浴中感作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次。
5）取出，小心吸弃上层胰酶溶液，用洗液轻洗2次后，用大口径吸管反复吹打，使细胞游离。
6）用双层或三层纱布过滤，收集滤液于离心管中，以600rpm离心沉淀5-10min，吸弃上清液，按每个鸡胚5ml的量，加入营养液，并用吸管反复吹打，直至形成均匀的细胞悬液。7）细胞计数（培养时，使细胞达到5×105个/ml）
取细胞悬液0.5ml+2ml 0.1%结晶紫——构椽酸（0.1mol/L）溶液，室温或37℃温箱中5-10分钟，充分振荡后进行计数。
按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数（N）。每ml悬液中的细胞数（n）=N/4×10000×K（稀释倍数）。
传代细胞系培养
优点：1)可以无限的传代。
2)不少细胞系对病毒很敏感。
3)某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。
4)生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。
缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。
细胞分散剂
1．胰酶使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。
2．乙二胺四乙酸二钠（EDTA）
营养液
1．人工综合营养液
氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。
2．血清
1）动物血清中含有细胞生长所必须的各种营养因子。
2）促进细胞的贴壁和生长。
3）具有很强的酸碱缓冲作用。
（二）病毒感染力的滴定
LD50，EID50，TCID50
（TCID50的测定）
1．在青霉素瓶中将病毒作连续10倍的稀释，从10-1—10-10。
2．将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度作8孔，每孔接种100ul。3．然后在每孔加入细胞悬液100ul，使细胞量达到3×105个/ml。
4．设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。
5．逐日观察并纪录结果，一般需要观察5-7天。
6．结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法进行。
TCID50的计算方法：
高于50%的百分数-50% 91.6-50
距离比例= = =0.8
高于50%的百分数-低于50%的百分数 91.6-40
lgTCID50=距离此例X稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数
