病毒学-微生物学-医学微生物学实验五

微生物学实验内容实验一 . 显微镜的使用及细菌的简单染色实验二 . 细菌的革兰氏染色实验三 . 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别实验四 . 酵母菌的数量测定实验五 . 酵母菌的大小测定实验六 . 微生物菌落的观察实验实验七 . 霉菌的形态观察实验八 . 培养基的制备与灭菌实验九 . 放线菌的形态及菌落特征的观察实验十 . 微生物的纯种分离培养实验一 . 普通光学显微镜的使用一、目的要求1. 学习并掌握油镜的原理和使用方法。

2. 复习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。

二 . 显微镜的基本结构及油镜的工作原理现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。

它们由机械装置和光学系统两大部分组成。

在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。

而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。

与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，这主要有如下二方面的原因：1. 增加照明亮度油镜的放大倍数可达 100Χ，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。

从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。

所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的油镜（通常用香柏游，其折射率 n=1.52）。

2. 增加显微镜的分辨率显微镜的分辨率或分辨力 (resolution or resolving power) 是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。

从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为：（公式 P16 ）式中λ= 光波波长；NA=物镜的数值孔径值。

光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（ 0.4--0.7μm），而数值孔径值则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为： NA=n × sin α式中α为光线最大入射角的半数。

医学微生物学实验报告（本科）实验室：姓名：学号：班级：海南医学院微生物学与免疫学教研室编写二OO四年四月第一次实验【实验内容】实验一微生物的形态与结构的观察实验二微生物的分布【结果记录及判定】实验一微生物的形态与结构的观察1、细菌正常形态及特殊结构的观察及记录（示教）：绘图并描述形状：形状：排列：排列：染色性：特殊结构：霍乱弧菌破伤风梭菌芽胞形状：形状：排列：排列：特殊结构：特殊结构：肺炎链球菌荚膜伤寒沙门菌鞭毛形状：形状：排列：排列：特殊结构：特殊结构：炭疽杆菌脑膜炎球菌2、病毒包涵体观察及记录（示教）：绘图并描述描述：狂犬病毒包涵体（H-E染色）3、真菌的形态观察及记录（示教）：绘图并描述形状：形状：排列：排列：特殊结构：特殊结构：白假丝酵母菌皮肤癣菌4、革兰染色法结果观察及记录：绘图并描述形状：形状：排列：排列：染色性：染色性：葡萄球菌大肠埃希菌实验二微生物的分布结果记录：1、空气中的细菌种类（种）：数量（个）：2、水中细菌数检测（1）自来水中细菌的种类（种）：数量（个）：（2）污水中细菌的种类（种）：数量（个）：3、物品和手指上的细菌检查（记录本人结果）物品表面的细菌种类（种）：数量（个）：手指表面的细菌种类（种）：数量（个）：结论：成绩：_________________批改教师签名：____________批改时间：________________第二次实验【实验内容】实验三微生物的分离培养实验四抗菌药物敏感性试验实验五消毒、灭菌、除菌【结果记录及判定】实验三微生物的培养1、细菌分离培养方法（分区划线接种法），生长现象为：2、纯种细菌接种技术（1）琼脂斜面接种培养，大肠埃希菌生长现象：（2）液体培养基接种法，大肠埃希菌生长现象：（3）半固体培养基接种技术①标本名称：大肠埃希菌半固体培养基②标本名称：痢疾志贺菌半固体培养基穿刺线：穿刺线：培养基：培养基：结论：结论：3、沙保弱琼脂平板上的真菌菌落观察及描述（示教）：类酵母型菌落：丝状菌落：实验四抗菌药物敏感性试验实验五消毒、灭菌、除菌一、紫外线灭菌法（示教）玻璃盖遮住平板的一半现象：现象：分析：分析：二、机械除菌法（示教）：1、未经过滤的液体培养基培养后的现象：2、经过过滤的液体培养基培养后的现象：分析：成绩：_________________批改教师签名：____________第三次实验【实验内容】实验六细菌的致病性实验七化脓性感染的细菌学检查【结果记录及分析】实验六细菌的致病性一、透明质酸酶试验（示教，实验动物：家兔）测量试验侧与对照测的黑墨水扩散范围（cm×cm）：实验侧：对照侧：分析：二、破伤风外毒素的毒素作用（实验动物：小鼠）实验现象：实验侧：对照侧：分析：实验七化脓性感染的细菌学检查一、病原性球菌的形态观察（示教）：绘图并描述形状：形状：排列：排列：染色性：染色性：葡萄球菌链球菌形状：形状：排列：排列：染色性：染色性：脑膜炎奈瑟菌淋病奈瑟菌二、病原性球菌的鉴别：三、血清学试验抗“O”试验（乳胶凝集法）实验现象：阳性对照：阴性对照：标本1：标本2：结果判定：标本1为________，标本2为_________。

实验一培养基的制备与灭菌实验步骤：（一）伊红美蓝培养基（EMB，用成品，分离大肠杆菌用）每组1瓶，250 ml三角瓶×200 ml培养基。

按成品说明称量、放入搪瓷杯，加水，加热完全溶化，倒入三角瓶，塞棉花塞，牛皮纸封口，包扎，作标记（培养基名称、批次组别、日期，下同），灭菌。

（二）营养琼脂培养基（即牛肉膏蛋白胨培养基，用成品，分离芽孢杆菌用）每组1瓶，250 ml三角瓶×200 ml培养基，方法同上，灭菌。

（三）PDA培养基（即马铃薯蔗糖培养基，分离酵母菌、根霉用）每组1瓶，250 ml三角瓶×200 ml培养基。

培养基配方：马铃薯20%、蔗糖（白砂糖）2%、琼脂 2%，加水至所需体积，pH自然。

配制方法：马铃薯去皮，称量，切成小方块，放入搪瓷杯，加水适量，煮沸20 min，取汁液，补水至所需体积，加入蔗糖（白砂糖），加热溶化，最后加入琼脂（琼脂要预先单独用水浸泡，然后挤干再加入），加热至琼脂完全溶化，分装三角瓶，塞棉花塞，牛皮纸封口，包扎，灭菌。

培养基统一高压蒸汽灭菌（121℃25 min）。

（四）无菌平皿准备（下次实验倒平板用）每组10套，报纸包扎，高压蒸汽灭菌（121℃25 min）后，置干燥箱80℃烘干1 h。

（五）枯草样预处理及预培养（下次实验分离芽孢杆菌用）枯草样预处理：每组1瓶。

100 ml三角瓶＋自来水约50 ml，加5%可溶性淀粉，溶解。

枯草若干，剪短，浸入三角瓶水中，牛皮纸封口，包扎，置水浴中煮沸10 min，然后置培养箱30℃预培养3～7 d。

（六）葡萄样（或其它水果）酵母菌预培养（下次实验分离酵母菌用）每组1瓶。

葡萄（或其它水果）适量，捏碎，皮渣与汁液一起放入250 ml 三角瓶（装量1/2～2/3），封口，置培养箱25℃预培养3～7 d，观察自然发酵过程。

实验二微生物的分离与纯化实验步骤：（一）污水中大肠杆菌的分离（稀释倒平板法）1）用三角瓶取污水样适量。

实验五环境因素对微生物生长的影响（一）目的要求了解某些物理因素、化学因素和生物因素对微生物生长的影响及芽孢对不良环境的抵抗能力。

（二）基本原理环境因素(包括物理因素、化学因素和生物因素)，如温度、渗透压、紫外线、pH、氧气、某些化学药品及拮抗菌等对微生物的生长繁殖、生理生化过程产生影响。

不良的环境条件使微生物的生长受到抑制，甚至导致菌体的死亡。

但是某些微生物产生的芽孢，对恶劣的环境条件有较强的抵抗能力。

我们可以通过控制环境条件，使有害微生物的生长繁殖受到抑制，甚至被杀死；而使有益微生物得到发展。

（三）实验材料1. 菌种金黄色葡萄球菌。

2. 培养基肉膏蛋白胨培养基。

3. 其它物品培养皿、无菌圆滤纸片、镊子、无菌水、无菌滴管、水浴锅、紫外线灯、黑纸。

4. 药品青霉素、来苏儿水、新洁尔灭、甲醛、乙醇。

（四）实验步骤1. 物理因素对微生物生长的影响紫外线主要作用于细胞内的DNA，使同一条链DNA相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基正常配对，从而抑制DNA的复制，轻则使微生物发生突变；重则造成微生物死亡。

紫外线照射的剂量与所用紫外光灯的功率(瓦数)、照射距离和照射时间有关。

当紫外光灯和照射距离固定，照射的时间越长则照射的剂量越高。

紫外线透过物质的能力弱，一层黑纸足以挡住紫外线的通过。

本实验是验证紫外线的杀菌作用及不同微生物对紫外线的抵抗能力。

(1) 取肉膏蛋白胨培养基平板3个，分别标明大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球等实验菌的名称。

(2) 分别用无菌移液管取培养18～20h的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌菌液0.1ml(或2滴)，加在相应的平板上，再用无菌涂棒涂布均匀，然后用无菌黑纸遮盖部分平板。

(3) 紫外灯预热10～15 min后，把盖有黑纸的平板置紫外灯下，打开培养皿盖，紫外线照射20 min(照射的剂量以平板没有被黑纸遮盖的部位，有少量菌落出现为宜)，取去黑纸，盖上皿盖。

微生物学实验报告（格式标准）(生命科学专业)*****目录索引实验一油镜的使用和细菌的简单染色法 3实验二细菌的革氏染色与芽孢染色 5实验三常用培养基的配制7实验四酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别8实验五、微生物大小的测定与显微计数10实验六环境中微生物的检测和分离纯化11实验七细菌鉴定中常用的生理生化反应12实验八（综合实验）化能异养微生物的分离与纯化13课程名称：微生物学实验班级：化生系生命科学本科实验日期：指导教师：黎勇实验一油镜的使用和细菌的简单染色法〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术；观察细菌的基本形态；学习观察细菌的运动性的基本方法。

〔基本原理〕1. N·A=n·sinα2. D=λ/2N.A3. 目镜可提高放大倍数，但有效放大率取决于镜口率。

已经分辨的物体不放大看不清，未分辨物放得再大也看不清。

4. 用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时，可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。

〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸；细菌、放线菌等固定装片；培养18小时左右的B.subtilis. S.arueus 菌斜面培养物；无菌水、生理盐水。

〔方法步骤〕：（一）油镜的使用镜检装片在中倍（或高倍镜）下找到目的物，并使位于视野正中聚光镜上升到最高位置，虹彩光圈开到最大，镜头转开成八字形在玻片的镜检部位（光斑处）滴一滴香柏油油镜转入正下方侧视小心上升载物台（缩短镜头与装片距离，镜头浸入油中，至油圈不扩大为止镜头几与装片接触）粗调器徐徐下降载物台（密切注视视野，当捕捉到物像时，立即用细调器校正）仔细观察并绘图取出装片，清洗油镜：擦镜纸拭去镜头上的香柏油擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留（用手指辅助，迅速拭擦一、二次）用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯（2-3次）。

（二）细菌的简单染色法：涂片干燥火焰固定染色水洗干燥油镜观察（三）细菌运动性的观察取洁净盖玻片，四周涂上凡士林滴加一小滴菌悬液凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上翻转观察〔结果分析〕1、画一圆圈表示视野，选取所观察的微生物绘图，注意特殊结构、形状和排列。

医学微生物学实验指导皖南医学院微生物学和免疫学教研室2006年5月微生物学实验的目的与要求医学微生物学的实验课是本课程学习中的重要环节。

医学微生物学实验课的目的：在于使学生加深和巩固对讲课内容的明白得和体会，并在系统学习理论的基础上，使学生学习并把握微生物学的差不多操作技术，培养独立摸索的能力，为今后的临床实践及科学研究工作打下良好的基础。

为了提高实验课的成效，应做到以下几点：一、每次实验前作好预习，明确实验目的，内容，操作中注意点及其理论依据，幸免或减少错误发生。

二、在实验过程中，应持严肃认确实科学态度，并要注意合理地分配和利用时刻。

三、在微生物学的整个实验过程中，应严格加强“无菌观念”的培养和训练。

四、实验结果须真实记录，进行分析，得出结论。

如实验结果与理论不符，应探讨缘故，训练科学思维的能力。

实验完成后，要写出实验报告。

微生物学实验室规则微生物学实验的对象大多是病原微生物，因此必须严格贯彻“无菌观念”，防止实验中自身感染和环境污染是微生物学实验室的最重要原则。

一、尽量不带个人一辈子活、学习用品入实验室，必要的用具带入后，应放在远离操作的位置。

二、进入实验室后穿上工作衣，离室时脱下反叠带走。

在实验室内应保持安静、整洁、有秩序，不得高声谈笑，随便走动或拆卸仪器、搬弄标本。

三、实验室内严禁吸烟、进食、饮水，严禁用嘴吸移液及润湿标签，尽量不要用手触摸头面部及躯体其他暴露部位。

四、如遇不慎而打破菌种管或使有菌材料污染皮肤、衣物、桌面等情形，应赶忙报告指导教师，切勿隐瞒或自行处理。

五、被污染过且需要回收的吸管、滴管、试管、玻片等物应用完后赶忙投入已预备的消毒液中，不得放在桌面上或水槽内。

六、爱护公物，节约试剂材料，不得将实验室任何物品私自带走。

如遇仪器、用品损坏，应报告指导教师并按规定予以赔偿。

七、实验完毕，整理桌面，值日生打扫室内卫生，最后离开的同学应注意关好水电、门窗，洗手后离室。

实验一自然界与人体的微生物检查实验目的：了解微生物在空气、物体表面及正常机体表面的分布，增强消毒及无菌操作的观念。

临床医学检验技士-微生物学检验(五)(总分：68.00，做题时间：90分钟)一、一(总题数：61，分数：61.00)1.细菌在半固体培养基生长时，可看到细菌只沿穿刺线生长，请问此细菌可能是( )∙A．单毛菌∙B．双毛菌∙C．丛毛菌∙D．周毛菌∙E．无鞭毛的细菌（分数：1.00）A.B.C.D.E. √解析：2.沙眼衣原体直接涂片碘液染色，镜检可看到上皮细胞内包涵体的颜色为( )∙A．棕色∙B．银灰色∙C．深褐色∙D．黄色∙E．蓝色（分数：1.00）A.B.C. √D.E.解析：[解析] 沙眼衣原体直接涂片碘液染色，因包涵体内的基质含有丰富的糖原，被碘染成褐色，而细胞的其他部分呈黄色。

3.钩端螺旋体的传播途径主要是( )∙A．呼吸道吸入∙B．粪-口途径∙C．破损的皮肤入侵∙D．昆虫媒介叮咬∙E．母婴垂直传播（分数：1.00）A.B.C. √D.E.解析：4.下列说法何者正确( )∙A．肺炎支原体可在无细胞的培养基中生长∙B．肺炎支原体亦称为“典型性肺炎”∙C．鹦鹉热衣原体主要引起鹦鹉疾病∙D．肺炎衣原体可在无细胞的培养基中生长肺炎衣原体主要引起沙眼∙E．肺炎衣原体主要引起沙眼（分数：1.00）A. √B.C.D.E.解析：5.根据流感病毒核蛋白抗原性的不同，流感病毒又可分为几型( )∙A．1型∙B．2型∙C．3型∙D．4型∙E．5型（分数：1.00）A.B.C. √D.E.解析：6.242关于螺旋体，下列何种叙述不正确( )∙A．行二分裂繁殖∙B．具有鞭毛∙C．具有脂多糖结构∙D．运动活跃∙E．原核细胞型微生物（分数：1.00）A.B. √C.D.E.解析：[解析] 螺旋体是一类细长柔软、弯曲呈螺旋状，运动活泼的原核细胞型微生物，基本结构与细菌类似，有细胞壁、原始核，以二分裂方式繁殖。

7.支原体不具有以下何种特征( )∙A．具有细胞壁∙B．高度多态性∙C．可通过滤器∙D．原核细胞型微生物∙E．能营独立生活（分数：1.00）A. √B.C.D.E.解析：8.钩端螺旋体感染可发生黄疽现象，其原因是由于( )∙A．细胞毒因子作用∙B．溶血素作用∙C．脂多糖∙D．外膜蛋白∙E．鞭毛（分数：1.00）A.B. √C.D.E.解析：[解析] 钩体的致病作用由大量繁殖的病原菌及其死亡后的毒素、酶或其他代谢产物所引起，其中溶血素是一种毒素，其作用类似磷脂酶，能使红细胞发生溶解，产生黄疸。

课程名称：医学微生物学实验实验内容：1. 其他微生物的形态观察(阅片)自阅片：钩体示教片：支原体菌落、梅毒螺旋体、沙眼衣原体包涵体、恙虫病立克次体2. 钩体显微凝集试验(示教)3. 变形杆菌动力观察(自做)授课对象：本科临床、口腔、麻醉、影像、急诊、五官、肿瘤；船本临床、麻醉等实验方式：讲授＋自做实验教材：一、实验目的与要求：1、熟悉钩端螺旋体、支原体菌落、梅毒螺旋体、沙眼衣原体包涵体、恙虫病立克次体形态与染色性；2、熟悉钩体的显微镜凝集实验原理及观察方法。

二、实验内容及时间分配（分钟）：1．讲授30 min2．其他微生物的形态观察（阅片）40 min自阅片：钩体示教片：支原体菌落、梅毒螺旋体、沙眼衣原体包涵体、恙虫病立克次体3．钩体显微镜凝集试验（示教）20 min4．变形杆菌动力观察30 min5．小结10 min三、重点：钩体显微镜凝集实验原理四、思考题1、支原体与细菌L型的鉴别要点有哪些？2、原体与始体的区别。

五、作业：绘示教图一、支原体：支原体(Mycoplasma)是一类没有细胞壁，呈高度多形态性，能通过0.45um滤菌器,胞膜富含固醇，含DNA与RNA，呈二分裂繁殖的原核细胞型微生物；支原体是目前所知能在无生命培养基中繁殖的最小的原核细胞型微生物。

支原体对营养物质的要求高于一般细菌，除基础营养物质外还需加入10%～20%人或动物血清以提供胆固醇与其它长链脂肪酸。

大部分支原体繁殖速度比细菌慢，在合适环境中孵育，约3～4h繁殖一代，在琼脂含量较少的固体培养基上，2~7d长出直径约10～600μm的典型的“荷包蛋样”菌落。

低倍镜下观察菌落呈圆形，中心致密隆起，深入琼脂，外周由一层薄的透明颗粒包绕。

支原体菌落，Diense染色，×100支原体有许多特性与细菌L型相似，如无细胞壁、呈多形性、能通过滤菌器、对低渗敏感、“油煎蛋”样菌落，但细菌L型在无抗生素等诱导因素作用下易返祖为原菌，支原体则在遗传上与细菌无关。

微生物学实验实验一实验室环境和人体表面微生物的检查实验二油镜的使用和细菌的简单染色实验三细菌的革兰氏染色和芽孢染色实验四微生物大小的测定和酵母菌死活细胞的鉴定实验五培养基的配制与消毒灭菌实验六土壤微生物的分离纯化与鉴定实验七食品微生物检验 (一)细菌总数测定实验八食品微生物检验（二）大肠菌群数测定实验九大肠杆菌生长曲线的测定实验十IMViC与硫化氢试验实验一、实验室环境和人体表微生物的检查1.一、目的：1.比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量与类型；2.观察不同类型微生物的菌落形态特征；3.体会无菌操作的重要性。

2.二、原理：1.微生物无孔不入，无处不在。

2.微生物→营养琼脂平板→菌落或菌苔。

（37 ℃倒置培养24 h）3.描述：菌落的大小、表面光滑或粗糙、干燥或湿润、隆起或扁平、边缘整齐或锯齿状、菌落透明或不透明、颜色以及质地均匀与否、疏松或紧密等，以便检查环境中细菌的类?秃褪 俊?4.细胞、放线菌、酵母菌和霉菌四大类型都可能存在，本实验重点观察细菌。

3.三、器材：1.培养基：营养琼脂平板（牛肉膏蛋白胨培养基）2.器具：无菌水、灭菌棉签、接种环（针）、酒精灯等。

4.四、步骤：1.标记。

组号/姓名、日期、样品来源。

2.接种。

3.倒置培养，37℃ 24 h4.观察结果。

5.五、结果6.样品来源菌落数菌落类型特征描写本实验室（流动空气30 min）1 大小形态干湿扁/隆透明度颜色边缘23接种室（不流动空气30min）洗手前洗手后头发屑指甲垢实验台门把1.六、思考题：1.人多的实验室与少人走动的实验室比较，平板上的菌落数和菌落类型有区别吗？试解释。

2.通过本实验，在防止培养物的污染和防止细菌的扩散方面，你有何体会？3.4.实验二油镜的使用和细菌的简单染色一、实验目的1、学习和掌握油镜的原理和使用技术。

2、学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法。

二、实验原理1．油镜使用原理：光镜的几种物镜中以油镜的放大倍数最大，尤其适用于微生物学研究。