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免疫抑制药的药物浓度检测原理及方法目前常用的免疫抑制药包括环孢素A和他克莫司等，具有免疫抑制作用，广泛用于器官移植后排斥反应和某些自身免疫性疾病的治疗。
由于该类药物有效浓度和中毒浓度接近，且生物利用度和药动学的个体差异大，药物的吸收和代谢速率在不同的疾病状态、器官移植类型及年龄上存在很大个体差异。
因此，应监测免疫抑制药物血药浓度，以便及时调整给药剂量，保证用药安全和有效。
一、环孢素A高效液相色谱法测定环孢素A血药浓度如下：1.原理全血破碎红细胞后用乙醚将环孢素A（cyclosporin A）提出，蒸干提取液，用流动相及正己烷重溶解后，进行高效液相色谱（HPLC）分析测定。
2.试剂与仪器（1）仪器：Hp1090M高效液相色谱仪。
（2）试剂：标准品环孢素A，内标环孢素D，乙醚，乙腈，甲醇，异丙醇，氟化钠及正己烷等。
环孢素A标准贮存液（1mg/ml）的配制：称取环孢素A 0.1g溶于100ml甲醇中。
内标贮存液（1mg/ml）配制：取环孢素D 0.1g溶于100ml甲醇。
内标应用液用甲醇稀释内标贮存液为10μg/ml。
（3）色谱条件：分析柱Spherisorb C18 4.6mm×200mm （7μm）不锈钢层析柱，流动相：乙腈∶水∶甲醇∶异丙醇按57∶18∶25∶1.5的比例配成。
进样量20μl，柱温65℃，流速1.4ml/min，检测波长为208nm。
3.操作取全血2ml加入16μl环孢素D内标液（10μg/ ml）及约1g氟化钠，漩涡混合30秒后加入乙醚5ml，振荡2.5分钟，离心（4000r/min），移取有机层4ml于另一试管，50℃空气流中吹干。
残渣中加入流动相150μl及正己烷400μl重溶解，取20μl进样。
环孢素A与环孢素D保留时间分别约为4.6分钟及5.5分钟。
4.计算以标准管环孢素A和环孢素D（内标）面积比及相应环孢素A浓度，建立回归方程。
根据待测标本的面积比，用上述方程求出标本中环孢素A浓度。
嗜肺军团菌生化鉴定结果
嗜肺军团菌生化鉴定结果通常包括以下几个方面：
1.革兰氏染色：嗜肺军团菌是一种革兰氏阴性杆菌，经过革兰氏
染色后呈红色。
2.氧化酶试验：嗜肺军团菌氧化酶试验结果为阳性，这是鉴定该
菌种的一个重要指标。
3.生长条件：嗜肺军团菌需要在特定的生长条件下才能生长繁殖，
例如在36℃左右的水环境中生存，且易通过气溶胶的形式传播。
4.培养特性：嗜肺军团菌需要在特定的培养基上培养才能获得较
好的生长效果，例如在人工水环境（如集中空调循环冷却水、
自来水、淋浴水、温泉浴池水、游泳池水、人造喷泉水）中容
易滋生。
5.抗药性：嗜肺军团菌对不同的抗生素有不同的抗药性，需要根
据药敏试验结果选择合适的抗生素进行治疗。
总之，通过以上几个方面的生化鉴定结果，可以确定是否为嗜肺军团菌感染，并采取相应的治疗措施。
测定几种抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）实验目的：通过采用常量稀释法, 检测几种抗菌药物对A8、A9、D5菌株的最小抑菌浓度( MIC) , 对临床诊断用药有指导作用。
【试剂与器材】1.试剂⑴主要仪器设备：三角烧瓶、高压灭菌器、内径90mm平皿、试管、0.5麦氏标准比浊管、天平、接种环、吸头、微量加样器、胶布、分光光度计、酒精灯等。
⑵试验药品：培养基基础粉（酸水解酪蛋白/酸水解酪素、牛肉浸膏粉、淀粉、琼脂）、纯水（蒸馏水）、电炉、牛皮纸、线、抗菌药物、无菌生理盐水、蒸馏水、pH6.0 0.1mol/L 磷酸盐缓冲液。
⑶试验菌株：A8、A9、D5菌株、标准株大肠杆菌。
在肉汤或琼脂中将抗菌药物进行一系列（对倍）稀释后定量接种待检菌，35℃孵育一定时间后，观察抑制待检菌肉眼可见生长的最低药物浓度，即为该药物对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）。
【试验方法】肉汤稀释法试管稀释法（常量稀释法）【原理】用MH肉汤将抗菌药物作不同浓度的稀释，再接种待检菌，定量测定抗菌药物抑制或杀灭待检菌的最低抑菌浓度（MIC）。
【操作步骤】①抗菌药物原液制备：配制抗菌药物原液的溶剂和稀释剂大多采用蒸馏水、pH6.0，0.1mol/L磷酸盐缓冲液等。
抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。
溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。
所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。
公式为：质量（mg）=溶剂（ml）x浓度（μg/mg）/分析效能（μg/ mg）表1 稀释法中常用的抗菌药物容积稀释法②药敏试验用抗菌药物浓度范围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。
表2常用药敏纸片试验方法：1.用记号笔在培养基上标记待检菌名。
2.在已分纯的待检菌培养基上取4个～5个菌落，接种在4ml～5ml水解酪蛋白（MH）肉汤中，置35℃培养4h～6h，链球菌、嗜血杆菌等需用加血的肉汤增菌并孵育过夜。
嗜肺军团菌单位是指用于测量或计数这种细菌的标准度量单位。
嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）是一种细菌，它是引起军团病（Legionnaires'disease）的主要病原体。
军团病是一种重型肺炎，病死率较高，尤其是在免疫力低下的患者中。
在微生物学和临床医学研究中，通常会用到以下几种单位来描述和计量嗜肺军团菌：
1.菌落形成单位：通常用CFU表示，是指在固体培养基上形成的一个可见的菌落，代表一个或多个细菌细胞的生长。
2.每毫升：在液体培养基或样品中，细菌的数量常用每毫升CFU/mL）来表示。
3.光密度单位：通过光谱光度计测量细菌悬液的光密度，可以间接估算细菌的数量，单位通常是OD 光密度）值。
4.荧光强度单位：在使用荧光标记技术检测细菌时，荧光的强度可以用特定的单位来量化，例如相对荧光单位 RFU）。
5.基因拷贝数：在分子生物学研究中，有时会使用实时定量PCR 技术来量化细菌的基因拷贝数。
6.干重或湿重：通过称量一定体积细菌沉淀的重量来衡量细菌的总量，单位通常是毫克 mg）或微克 μg）。
了解嗜肺军团菌的单位对于研究其生物学特性、进行流行病学调查以及开发疫苗和治疗方法都是非常重要的。
在实验室中，研究人员会根据不同的实验目的选择合适的单位和方法来对嗜肺军团菌进行定量分析。
几种测定抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）方法1.1.常量肉汤稀释法1.1.1.抗菌药物贮存液制备抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。
溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。
抗菌药物直接购自厂商或相关机构。
所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。
例如：需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。
用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg。
根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。
制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。
配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过6个月。
1.1.2.药敏试验用抗菌药物浓度范围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。
1.1.3. 培养基NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。
需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。
在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。
嗜血杆菌属菌使用HTM 肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。
1.1.4.接种物的制备有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。
增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1~2×108CFU/ml。
二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养18~24h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。
嗜肺军团菌检测标准一、引言嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）是一种革兰氏阴性杆菌，是人类军团病的主要病原体。
军团病是一种由吸入含有嗜肺军团菌的气溶胶引起的急性呼吸道传染病。
为确保公共卫生安全，准确、快速地检测嗜肺军团菌成为防控军团病的关键环节。
本文将详细介绍嗜肺军团菌的检测标准，以期为相关领域提供有益的参考。
二、样本采集与处理1.样本采集：采集疑似军团病患者呼吸道分泌物、痰液、支气管肺泡灌洗液等样本。
采样时应遵循无菌操作原则，避免污染。
2.样本处理：将采集到的样本立即送至实验室，进行处理。
处理过程中，应对样本进行匀浆、离心等操作，以提取细菌。
三、实验室检测1.细菌培养：将处理后的样本接种于选择性培养基上，如BCYE培养基。
在35-37℃、5%二氧化碳环境下培养3-10天，观察菌落形态。
2.生化试验：对疑似菌落进行生化试验，如氧化酶试验、尿素试验、马尿酸盐试验等，以初步鉴定嗜肺军团菌。
3.分子生物学检测：采用PCR（聚合酶链式反应）等分子生物学技术对疑似菌落进行核酸检测，以确定嗜肺军团菌的存在。
PCR检测具有较高的灵敏度和特异性，可用于嗜肺军团菌的快速诊断。
四、结果判定与报告根据实验室检测结果，结合患者临床表现和流行病学史，进行综合判断。
如细菌培养、生化试验和分子生物学检测结果均符合嗜肺军团菌特征，可判定为嗜肺军团菌感染。
检测报告应包括患者信息、样本信息、检测方法和结果等内容。
五、质量控制与注意事项1.质量控制：实验室应建立严格的质量控制体系，包括定期校准检测设备、验证检测方法的准确性、参加室间质评等，以确保检测结果的准确性和可靠性。
2.注意事项：在样本采集、运输、处理和检测过程中，应严格遵守生物安全规范，防止交叉感染和实验室感染。
同时，实验室人员应具备相应的专业技能和生物安全意识，确保检测工作的顺利进行。
六、总结与展望本文详细介绍了嗜肺军团菌的检测标准，包括样本采集与处理、实验室检测、结果判定与报告以及质量控制与注意事项等方面。
几种测定抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）方法1.1.常量肉汤稀释法1.1.1.抗菌药物贮存液制备抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。
溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。
抗菌药物直接购自厂商或相关机构。
所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。
例如：需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。
用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg。
根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。
制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。
配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过6个月。
1.1.2.药敏试验用抗菌药物浓度范围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。
1.1.3. 培养基 NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。
需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。
在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。
嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。
1.1.4.接种物的制备有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。
增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1~2×108CFU/ml。
二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养18~24h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。
测定抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）方法1.1.常量肉汤稀释法1.1.1.抗菌药物贮存液制备抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。
溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。
抗菌药物直接购自厂商或相关机构。
所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。
例如：需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。
用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg。
根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。
制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。
配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过6个月。
1.1.2.药敏试验用抗菌药物浓度范围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。
1.1.3.培养基NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。
需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。
在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。
嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。
1.1.4.接种物的制备有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。
增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1~2×108CFU/ml。
二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养18~24h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。
抗菌药物的疗效评价和药物治疗监测抗菌药物是治疗感染性疾病的重要工具，但由于药物抗性的出现，导致疗效不稳定。
因此，评价抗菌药物的疗效以及进行药物治疗的监测变得至关重要。
本文将就这一话题进行探讨。
一、抗菌药物的疗效评价抗菌药物的疗效评价是衡量药物疗效的重要指标，可以判断药物是否有效、对病原菌的抑制程度以及疗效的持续时间等。
以下是几种常用的抗菌药物疗效评价方法。
1. 最小抑菌浓度（MIC）测定最小抑菌浓度是指在体外条件下，抗菌药物能够抑制病原菌生长的最低药物浓度。
通过对细菌进行体外实验，可以确定不同细菌株对不同抗菌药物的敏感性，从而评价药物的疗效。
2. 致死动力学参数评估致死动力学参数是对抗菌药物疗效评价的另一种方法。
通过测定初始细菌数量、药物浓度以及时间的变化，可以明确药物对细菌的杀灭作用。
常见的参数包括最大细菌杀灭速度、最大细菌杀灭量和时间依赖性指数等。
3. 细菌生长曲线分析细菌生长曲线分析是一种定量评估抗菌药物疗效的方法。
通过观察细菌在药物作用下的生长情况，可以评估药物对细菌生长的抑制能力。
二、药物治疗监测药物治疗监测是指在抗菌药物治疗期间，对患者进行定期监测，确保药物治疗的效果和安全性。
以下是几种常见的药物治疗监测方法。
1. 血药浓度监测血药浓度监测可以帮助确定患者体内药物的浓度，从而判断药物的疗效和副作用情况。
根据药物的半衰期和药代动力学参数，可以制定出合理的给药方案，以达到最佳治疗效果。
2. 肝肾功能监测抗菌药物的代谢和排泄主要依赖于肝脏和肾脏功能。
因此，在药物治疗期间，需要对患者的肝肾功能进行监测，确保药物的代谢和排泄正常，避免药物在体内积聚导致毒副作用。
3. 细菌培养和耐药基因检测细菌培养和耐药基因检测是判断药物疗效和抗菌药物选择的重要手段。
通过对细菌进行培养和基因检测，可以明确细菌的抗药性，从而选择出有效的抗菌药物。
结论抗菌药物的疗效评价和药物治疗监测是确保抗菌治疗有效性和安全性的重要环节。
细胞内抗嗜肺军团菌药物有效浓度测定【摘要】目的：探讨红霉素。
环丙沙星。
左氧氟沙星。
莫西沙星4种抗菌药物对细胞内嗜肺军团菌的抗菌活性。
方法：分别采用E-test法和有限稀释法测定上述4种药物对嗜肺军团菌ATCC 33152的细胞外抗菌活性,再用噻唑蓝比色法(MTT法)测定上述药物对嗜肺军团菌ATCC 33152的细胞内抗菌活性。
结果：细胞外抗菌活性E-test法:红霉素0.047 μg/mL。
环丙沙星0.38 μg/mL。
左氧氟沙星0.125 μg/mL。
莫西沙星0.125 μg/mL;有限稀释法:红霉素0.125μg/mL。
环丙沙星0.03 μg/mL。
左氧氟沙星0.016 μg/mL。
莫西沙星0.016μg/mL。
4种药物的细胞内抗菌活性分别为:红霉素0.25 μg/mL。
环丙沙星0.016 μg/mL。
左氧氟沙星0.016 μg/mL。
莫西沙星0.004 μg/mL。
结论：氟喹诺酮类药物在U937细胞模型中对嗜肺军团菌ATCC 33152具有很强的细胞内抗菌活性。
其中莫西沙星的细胞内抗菌活性最强。
MTT法是一种行之有效的用于检测药物对细胞内嗜肺军团菌抗菌活性的方法,可同时检测并对比各种药物样本的细胞内抗菌活性。
【关键词】嗜肺军团菌; U937细胞; 抗菌活性Abstract: Objective： To explore the intracellular antimicrobial activities of erythromycin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin against Legionella pneumophila. Methods： The minimum inhibition concentration (MIC) of each antibiotic was evaluated by E-test method and microdilution method respectively. The minimal extracellular concentration inhibiting intracellular multiplication (MIEC) of each antibiotic was evaluated by the MTT colorimetric assay system. Results： The MIC concentration for each drug by E-test method were: erythromycin, 0.047 μg/mL; ciprofloxacin, 0.38 μg/mL; levofloxacin, 0.125 μg/mL; moxifloxacin, 0.125 μg/mL, the MIC concentrations for each drug by microdilution method were: erythromycin, 0.125 μg/mL; ciprofloxacin, 0.03 μg/mL; levofloxacin, 0.016 μg/mL; moxifloxacin, 0.016 μg/mL. The MIEC concentration for each drug were: erythromycin, 0.25 μg/mL; ciprofloxacin, 0.016 μg/mL; levofloxacin, 0.016 μg/mL; moxifloxacin, 0.004 μg/mL. Conclusions： Fluoroquinolones have superior activity than erythromycin in U937 cells infected with L. pneumophila. Moxifloxacin is the most potent drug among the four tested antimicrobials. Our results indicated that the MTT assaysystem allows comparative and quantitative evaluations of the intracellular activities of antibiotics against L. pneumophila and efficient processing of a large number of samples.Key words: Legionella pneumophila; U937 cells; antimicrobial activities嗜肺军团菌(Legionella pneumophila,Lp)是一种兼性细胞内寄生菌,可在巨噬细胞和肺泡上皮细胞内存活并繁殖,并能导致具有潜在致死性的社区获得性肺炎和医院获得性肺炎。
凭借着在巨噬细胞内生长的特性,Lp能够逃逸机体免疫防御作用。
治疗Lp感染的关键是选用能在吞噬细胞内达到有效抑菌浓度的抗菌药物。
红霉素曾被推荐用以治疗Lp感染,但用红霉素治疗往往疗程长。
副作用大。
近年来,有报道称氟喹诺酮类。
新大环内酯类药物更适合治疗Lp感染且副作用更少[1-2]。
我们注意到,必须将药物的细胞外抗菌活性测定(即MIC测定)和细胞内抗菌活性测定结合起来才能更准确的评估药物对Lp的临床疗效[3]。
然而在药物的细胞内抗Lp活性测定方面,现有的试验方法常需耗费大量的时间和材料用于裂解细胞并将裂解液进行培养及计算菌落的个数[4],若要同时测定多种药物的细胞内抗Lp活性并对比其疗效时,现有方法的缺点就更加明显。
因此需要一种适于评价多种药物对细胞内Lp抗菌活性的方法。
在本研究中,我们提供了一种基于U937细胞模型的测定系统,可以同时对多种药物的细胞内抗Lp 活性进行快速。
定量的分析。
1 材料与方法1.1 菌株Lp菌株ATCC 33152(解放军301医院临床药理研究所,王睿教授惠赠),由中山大学附属第三医院细菌室保存。
将细菌解冻后挑取适当菌液接种于缓冲活性炭酵母浸液琼脂(buffered charcoal yeast extract,BCYE)平板(广州迪景公司),置37 ℃细菌培养箱内培养2 ~ 3 d至长出肉眼可见的灰白色菌落,挑取单个菌落,用缓冲酵母浸液(buffered yeast extract-。
琢,BYE-。
琢) 培养液将菌液调整至0.5号麦氏管浓度标准(1.5 × 108/mL)。
置于摇菌仪内摇菌过夜(12 ~ 18 h),再以3 000 r/min(r = 18 cm)离心20 min收集细菌,用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)调整浓度为1 × 107/mL,备用。
1.2 细胞U937细胞(武汉,中国典型培养物保藏中心),用90%RPMI 1640培养液(添加1.5 g/L碳酸氢钠。
4.5 g/L葡萄糖。
10 mmol/L HEPES。
1.0 mmol/L丙酮酸钠)加上100 mL/L胎牛血清为培养液,置于细胞培养箱中培养。
根据细胞密度规律传代,传代超过10代之细胞即弃去不再使用。
试验前向细胞培养液中加入终浓度为20 ng/mL的佛波酯(PMA)对U937细胞进行诱导,置于细胞培养箱中继续培养48 h后,用37 ℃预热的RPMI 1640培养液轻轻冲洗培养物3遍以洗去剩余的PMA和未贴壁的细胞,剩下的贴壁细胞即为不再分化,具有巨噬细胞表型特性的类巨噬细胞,备用。
1.3 主要试剂及抗菌药物环丙沙星(ciprofloxacin, CI)。
莫西沙星(moxifloxacin,MO)购自北京拜耳医药保健有限公司,左氧氟沙星(levofloxacin,LE)购自北京第一制药有限公司,红霉素(erythromicin,EM)。
MTT购自北京鼎国生物技术有限责任公司。
1.4 细胞病理效应测定通过MTT法测定感染Lp后存活的U937细胞数来反映细胞病理效应(cytopathic effect,CPE)。
首先,为了解吸光值和存活的细胞数目之间的对应关系,将诱导后的U937细胞连续稀释后铺入96孔板,加入50 。
滋L的MTT溶液(5 mg/mL),在37 ℃下孵育4 h。
弃去上清,每孔加入150 。
滋L的二甲基亚砜(DMSO)后充分振荡,将培养板置于酶标仪下读数(以DMSO为对照)。
由于活细菌也被认为可以和MTT反应而呈色[5],既往研究表明细菌浓度至少需达到108/mL才能影响吸光值,而本研究中所用的细菌浓度不曾达到该浓度,因此细菌和MTT溶液的反应不会影响到实验数据的可靠性。
将诱导后的U937细胞铺入96孔板中并以不同浓度的细菌去感染它,加入含有50 μg/mL庆大霉素的培养液继续培养2 h,洗涤细胞后加入100 。
滋L培养液,之后在各个时间点加入上述MTT溶液,并用酶标仪在570 nm处读取各孔的吸光值D(570 nm)。
CPED50定义为导致50%细胞死亡的细菌数目。
为了精确测定该值,我们将试验用细胞分为2组,其中一组为非感染组(即未加干预措施的对照组,视为不产生CPE效应),另一组为0.1%皂苷处理组(由于皂苷可导致细胞死亡,该组即为最大CPE对照组),2个对照组在570 nm处吸光值的平均值被定义为CPED50,如此便可推算出导致CPED50的Lp浓度。
1.5 细胞外抗菌活性MIC测定分别采用E-test法和有限稀释法测定试验所用药物对Lp ATCC 33152的最低抑菌浓度(MIC)值。
具体如下:E-test法:取培养48 h的菌落数个,混悬于生理盐水中,调整浓度至1.5 × 108/mL。
均匀接种于BCYE平板。
将E-test试纸条贴于琼脂表面。
置37 ℃培养箱48 h后观察结果,抑菌椭圆环与试条交界处的刻度即为最小抑菌浓度MIC。
有限稀释法:抗菌药物和BYE-α培养液制备同普通肉汤稀释法。
①MIC板制备:将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液分别加到灭菌的96孔板中,第1至第11孔加药液,每孔10 μL,第12孔不加药作为生长对照,冰冻干燥后密封,-20 ℃保存备用。
②接种物制备:将细菌悬液浓度调整至0.5麦氏比浊管标准,经BYE-α培养液1 ∶ 1 000稀释后,向每孔中加100 μL,密封后置37 ℃培养箱,48 h判断结果。
此时,第1孔至第11孔药物浓度分别为128。
64。
32。
16。
8。
4。
2。
1。
0.5。
0.25。
0.125 μg/mL。
③结果判断:以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。
当阳性对照孔(即不含抗生素)内细菌明显生长试验才有意义。
