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细胞核常用荧光染料有：吖啶橙（Acridine Orange，AO）、溴化乙锭（Ethidium Bromide，EB）和碘化丙啶（Propidium Iodide，PI），DAPI、Hoechst染料、EthD III、7-AAD、RedDot1、2 等等。
透膜的染料如下：AO：具有膜通透性，能透过细胞膜，将核DNA和RNA分别染成绿色和红色，因此使细胞核呈绿色或黄绿色荧光。
EB：一种高度灵敏的荧光染色剂，在标准302nm处激发出橙红色信号。
DAPI：蓝色一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，其与DNA结合后可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，而与单链DNA结合无荧光的增强。
DAPI对双链DNA的染色灵敏度要高于EB和PI，荧光强度比Hoechst低，但光稳定性高于Hoechst。
Hoechst染料：蓝色一类在显微观察中标记DNA的荧光染料，最常见的两种是Hoechst33342和Hoechst33258。
这两种染料都在紫外350nm处被激发，在461nm处最大发射光附近发射青/蓝色荧光。
与DAPI相比，Hoechst33342加有乙基，具有更强的亲脂性，因此能更好的透过完整的细胞膜，并且细胞毒性更小。
RedDot 1染料：红色，超强的细胞核选择性，其光谱相似于Draq?5 和Draq?7。
RedDot?染料可被几种常见的激光激发并可在远红外区激发荧光。
RedDot? 的红色近红外荧光有效的与其他常用荧光探针区分开来。
不透膜的染料，如下：PI：不同通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。
PI作为红色荧光复染剂首选，PI经常与Calcein-AM或者FDA等荧光探针合用，区分死/活细胞。
EthD III、7-AAD、RedDot 2：不能透过细胞膜，但能将坏死细胞区分开来；更适合凋亡坏死实验的检测；细胞核荧光染料（PI DAPI Hoechst33342）细胞核荧光染料PI碘化丙啶（简称PI）是一种常用的细胞核荧光染色剂。
吖啶橙染色液吖啶橙染色液(1mg/ml)产品简介：吖啶橙(Acridine Orange, AO)属于三环杂芳香燃料，可以标记DNA、RNA，属于异染性荧光染料。
该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA 和RNA 染色。
因此AO 常用于细胞内DNA 和RNA 进行检测。
AO 与核酸结合方式主要有：1、插入性结合，AO 嵌入核酸双链的碱基对之间，这种结合方式主要为AO 与DNA 的结合，其荧光发射峰为530nm，激发后呈绿色荧光；2、静电吸引，带正电荷的AO 与单链核酸的磷酸根(带负电荷)产生静电间的吸引结合，这种结合方式主要为AO 与RNA 的结合，其荧光发射峰为640nm，激发后呈红色荧光，少量结合会呈桔黄色或桔红色荧光。
因此，吖啶橙嵌合到双链DNA 分子中显绿色，与DNA 单链或RNA 结合时发桔黄色或橙红色荧光。
(1mg/ml)为储存液，使用时应稀释到合适浓度后使用。
染色后在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。
吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。
吖啶橙染色常与EB 染色合用双染，因EB 只染死细胞使之产生桔黄色荧光，由此可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞。
自备材料：1、 荧光显微镜2、 低速离心机3、 PBS4、 细胞计数板5、 载玻片、盖玻片操作步骤(仅供参考)：1、 收集细胞(采用流式细胞仪检测时，应先固定细胞)，用PBS 清洗细胞1次，计数并调节细胞浓度至106/ml。
2、取适量的细胞悬液，加入Acridine Orange Stain(1mg/ml)，使AO终浓度为8.5～17μg/ml，轻轻混匀。
3、室温避光染色15～20ml，滴加于载玻片上并加盖玻片或上流式细胞仪分析。
4、荧光显微镜下观察(激发滤光片波长488nm，阻断滤光片波长515nm)，计数并拍照。
吖啶橙（Acridine Orange）是一种荧光染料，常用于细胞和组织的染色。
它可以与DNA和RNA结合，并发出绿色和橙色的荧光信号。
溶酶体是细胞内的一种细胞器，主要参与细胞内物质的降解和消化。
吖啶橙染色溶酶体的原理是，吖啶橙可以穿过细胞膜进入细胞内，并与溶酶体内的DNA结合。
在酸性环境下，吖啶橙与DNA结合的荧光信号会发生变化。
在弱酸性条件下，吖啶橙发出绿色荧光；而在强酸性条件下，吖啶橙发出橙色荧光。
通过观察细胞或组织中溶酶体的荧光颜色，可以了解溶酶体的酸性程度和功能状态。
正常情况下，溶酶体处于弱酸性状态，吖啶橙发出绿色荧光；而当溶酶体功能异常或酸性增加时，吖啶橙发出橙色荧光。
这种染色方法可以用于研究溶酶体相关的疾病，如溶酶体贮积病和溶酶体功能障碍等。
需要注意的是，吖啶橙染色溶酶体的原理是基于荧光信号的变化，因此在观察时需要使用荧光显微镜或其他荧光检测设备。
细胞凋亡染色方法
最常见的一种是吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）双染色法。
这个方法就像是给细胞穿上了不同颜色的小衣服来区分它们的状态。
AO可以嵌入双链核酸，让正常细胞和凋亡细胞的细胞核都呈现绿色荧光。
而EB呢，它只能进入那些膜完整性被破坏的细胞，像凋亡晚期细胞，这些细胞的核就会被染成橙红色荧光。
咱们把细胞一染，放在荧光显微镜下看，就可以很清楚地区分正常细胞、凋亡早期细胞（只有绿色荧光）和凋亡晚期细胞（绿色加橙红色荧光）啦，是不是很神奇 ？
还有一种是Annexin V - FITC/PI双染法。
Annexin V是个很聪明的小蛋白，它对磷脂酰丝氨酸（PS）有很高的亲和力。
在细胞凋亡早期，细胞膜的PS会从膜内侧翻转到外侧，这时候Annexin V - FITC就能结合上去，发出绿色荧光。
PI呢，它和EB有点像，是不能进入活细胞和早期凋亡细胞的，只有当细胞死亡，细胞膜完全破损了，它才能进去把细胞核染成红色。
这样通过双染，我们就能准确地检测到凋亡细胞啦，就像给细胞们做了个精准的小体检 。
另外，TUNEL染色法也很厉害哦。
这个方法主要是检测细胞凋亡时断裂的DNA。
细胞凋亡的时候，内源性核酸内切酶会被激活，把染色体DNA在核小体间切断，产生180 - 200bp整数倍的寡核苷酸片段。
TUNEL法就是利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）把生物素或地高辛等标记的dUTP连接到3' - OH末端，然后再用相应的荧光标记的抗体或者酶标抗体去检测这些标记的dUTP，这样凋亡细胞就能被染上色啦，在显微镜下就可以看到那些凋亡的小细胞们啦，是不是感觉像在细胞世界里玩侦探游戏一样 ？。
吖啶橙染色原理
吖啶橙是一种双碱性染料，具有两个氨基和两个芳香环结构。
它可以与DNA
和RNA结合，通过静电作用和氢键作用，与核酸中的腺嘌呤和胞嘧啶基团结合，
从而实现对核酸的染色。
吖啶橙的结构中含有芳香环和氨基，使其具有较强的荧光性能，能够在紫外光下产生橙色荧光。
在细胞或组织染色实验中，吖啶橙可以通过渗透染色或者固定染色的方式，将
其加入到待染细胞或组织中，与核酸结合形成吖啶橙-核酸复合物。
当使用荧光显
微镜观察时，激发波长为紫外光，吖啶橙-核酸复合物会发出橙色荧光信号，从而
实现对核酸的观察和检测。
吖啶橙染色的原理基于其与核酸的结合特性，通过与核酸的特异性结合，实现
对核酸的染色和检测。
由于吖啶橙具有较强的荧光性能，能够产生明亮的橙色荧光信号，因此在细胞生物学和分子生物学研究中得到了广泛的应用。
吖啶橙染色原理的了解对于科研工作者在实验设计和数据解读中具有重要意义。
在细胞和组织的荧光染色实验中，科研人员需要根据样本的特点和实验要求，选择合适的染色方法和条件，合理设计实验方案，以确保获得准确可靠的实验结果。
总之，吖啶橙作为一种重要的荧光染料，在生物学和医学领域发挥着重要作用。
了解其染色原理，可以帮助科研人员更好地应用吖啶橙进行细胞和组织的荧光染色实验，为科研工作提供有力支持。
希望本文对吖啶橙染色原理有所帮助，同时也希望科研人员能够在实验中充分
发挥吖啶橙的优势，取得更多有意义的研究成果。
吖啶橙染色法检测细胞凋亡
实验试剂、仪器：
吖啶橙，稀释液PBS（磷酸缓冲液pH7.0～7.2），1％吖啶橙贮存液，细胞爬片，载玻片，盖玻片，荧光显微镜。
吖啶橙：3，6－（二甲胺基）吖啶盐酸盐，分子式C17H19N3·HCl ·ZnCl2, 分子量438.12g/mol,是一种荧光色素，其检测激发滤光片波长488nm,阻断滤光片波长515nm。
它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光，与DNA结合量少发绿色荧光，与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。
该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。
因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。
吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。
吖啶橙染液有毒，操作时要戴手套，需避光。
实验步骤：
1.配置吖啶橙贮存液（1%）：300mg吖啶橙溶解于30mlPBS缓冲液中，滤过，4
度避光保存。
2.染色时，稀释100倍至终浓度为0.01%。
取300微升的PBS缓冲液，加3微
升的吖啶橙贮存液混匀，室温避光染色5min。
3.在荧光显微镜下选520nm的激发光观察。
实验结果：
正常细胞核的DNA为黄色或黄绿色均匀荧光，细胞质和核仁的RNA为桔黄或桔红荧光。
出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿色荧光，甚至见黄绿色碎片。
细胞坏死时，细胞质内黄绿色或桔黄色荧光均减弱或消失。
吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色AO / EB原理与流程zhongyisheng:1、原理：吖啶橙(AO)能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光。
溴乙锭(E仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。
凋亡的细胞呈现为染色增强，荧光更为明亮，均匀一致的圆状或固缩状、团块状结构。
非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。
二者形态迥然相异，很易判别。
在荧光显微镜下观察，可见四种细胞形态：活细胞(VN)，核染色质着绿色并呈正常结构；早期凋亡细胞(VA)，核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状；非凋亡的死亡细胞(NVN)，核染色质着橘红色并呈正常结构；晚期凋亡细胞(NVA)，核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状。
2、AO/EB染色及观察结果：取 20-100μl的1：100稀释的染色剂置于载玻片的贴壁细胞上室温下静置20min，PBS洗涤2-3遍，上覆盖玻片，荧光显微镜下观察结果并计数20-200个细胞。
ym1051:1、能否提供具体实验步骤?2、您在文中所说的"1：100稀释的染色剂"是怎样稀释的?如何在载玻片上种上贴壁细胞?zhongyisheng:1、用1mlEP管稀释时，先取微量的染色剂，然后再取稀释剂（如BSA）加入EP 管吹打即可。
2、消毒灭菌处理后的盖玻片平放入培养皿或中即可实验。
ym1051:我好像已明白具体过程了:首先要进行细胞爬片,然后将染色剂滴加在已爬有细胞的盖玻片上,温育后洗涤,再盖上盖玻片则可进行观察了.是这样吗?如果不经过爬片处理而将细胞进行消化,再将细胞和染色剂滴加在盖玻片上进行观察,行吗?zhongyisheng: 的确，不经过爬片而是将贴壁细胞消化下来一样可以进行进一步的实验。
这是悬浮细胞的典型方法。
当然，由于进行免疫组化染色进行的形态学检查经常考虑到细胞的原貌，在国际上比较通用，尤其是在进行动态检查时。
医琳师妹：我将我所作的方法与大家共享：吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色测定PC12细胞凋亡（acridine orange/ethidium bromide, AO/EB）：（1）细胞爬片：在6孔培养板中预先置入玻璃盖玻片，接种细胞悬液，干预后，予95%乙醇固定15分钟，微干，然后准备荧光染色。
将100mg/L溶于PBS的吖啶橙和100mg/L溶于PBS的溴化乙锭各5μl（临用前混合加入，加样量宜小，有时各2μl-5μl足够，量太大容易形成细胞凋亡的假阳性），在照相前混匀后加入，轻轻吹打，30秒后用激光共聚焦显微镜观察照相。
（有人用15mg吖啶橙溶于100ml pH6.8的PBS中过滤，避光保存）计取5个视野，共100个细胞中凋亡细胞百分数。
（2）如制成细胞悬液：取100μl PBS稀释的细胞悬液，加2μl的染色液，其中AO/EB，各含100μg/ml，加入染料30秒后观察摄像。
（有人用PBS配制吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）混合液，各含100μg/ml。
细胞离心，悬液于PBS中，取100μl细胞悬液加4μl荧光染色液，轻轻吹打，滴至载玻片上，加盖玻片后立即置荧光显微镜下观察。
）fffwu: 请问:请评价AO/EB法观察细胞凋亡的方法! 哪里有相关图片!jmtang: 尤其第一篇文献！1.Critical evaluation of techniques to detect and measure cell death –study in a model of UV radiation of the leukaemic cell line HL60Marina Leite A1, Margarida Quinta-Costa A1, Pedro Simas Leite A1, José Eduardo Guimarães A1A1 IPATIMUP, Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da Universidade do Porto, PortugalAbstract:The reliability of eight distinct methods (Giemsa staining, trypan blue exclusion, acridine orange/ethidium bromide (AO/EB double staining for fluorescence microscopy and flow cytometry, propidium iodide (PI) staining, annexin V assay, TUNEL assay and DNA ladder) for detection and quantification of cell death (apoptosis and necrosis) was evaluated and compared. Each of these methods detects different morphological or biochemical features of these two processes. The comparative analysis of the 8 techniques revealed that AO/EB (read in fluorescence microscopy) provides a reliable method to measure cells in different compartments (or pathways) of cell death though it is very time consuming. PI staining and TUNEL assay were also sensitive in detecting very early signs of apoptosis, but do not allow precise quantification of apoptotic cells. These threemethods were concordant in relation to induction of apoptosis and necrosis in HL60 cells with the various UV irradiation time periods tested. Both AO/EB (read by flow cytometry) and annexin V-FITC/PI failed to detect the same number of early apoptotic cells as the other three methods. Trypan blue is valueless for this purpose. Giemsa and DNA ladder might be useful as confirmatory tests in some situations.2.Zhang JH, Yu J, Li WX, Cheng CP. Related Articles, LinksEvaluation of Mn2+ stimulated and Zn2+ inhibited apoptosis in rat corpus luteal cells by flow cytometry and fluorochromes staining.Chin J Physiol. 1998 Jun 30;41(2):121-6.中华血液学杂志 1998年第1期 No.1 JANUARY 1998细胞凋亡与肿瘤的发生和治疗之间的关系是近年来国际上研究的热点，目前细胞凋亡的检测方法有DNA凝胶电泳法、电子显微镜法、染料透过法、TUNEL法和流式细胞仪法等。
我们用染料透过检测法［1］测定阿糖胞苷(Ara-C)诱导的HL-60细胞凋亡，取得了满意的结果，现报道如下。
材料和方法1.原理吖啶橙(AO)能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光。
溴乙锭(EB仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。
凋亡的细胞呈现为染色增强，荧光更为明亮，均匀一致的圆状或固缩状、团块状结构。
非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。
二者形态迥然相异，很易判别。
在荧光显微镜下观察，可见四种细胞形态：活细胞(VN)，核染色质着绿色并呈正常结构；早期凋亡细胞(VA)，核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状；非凋亡的死亡细胞(NVN)，核染色质着橘红色并呈正常结构；晚期凋亡细胞(NVA)，核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状。
细胞凋亡率由以下公式计算：2.材料细胞来源：HL-60细胞株，由南京铁道医学院血液科研究室提供。
AO/EB染料: 精确称取AO(Fluka产品)、EB(Fluka产品 )各1mg，分别溶于10ml pH7.2 PBS中使之配成100μg/ml的储备液，用前等量混合，备用。
3.方法3.1 HL-60细胞培养：将1×106/ml HL-60细胞接种于含20％小牛血清的RPMI 1640培养液中，加Ara-C终浓度为10μg/ml，置37℃、5％CO2浓度及饱和湿度的恒温培养箱中悬浮培养，孵育后分别于3，6，12，24及48小时观察结果。
3.2 AO/EB染色及观察结果：取细胞悬液 100μl，加入AO/EB染料4μl混匀，置1滴于载玻片，上覆盖玻片，荧光显微镜下观察结果并计数200个细胞。
3.3 DNA抽提及电泳：用酚、氯仿、异戊醇抽提DNA，1.5％琼脂糖凝胶电泳(0.5×TBE缓冲液，电压30V，电泳7～8小时)，在紫外透射仪下观察结果并拍照。
结果Ara-C诱导HL-60细胞凋亡，在0，3，6，12，24和48小时其凋亡率分别为1.5%，14%，57.5%，66%，70.5%和60.5%。
实验显示于第6小时开始，随诱导时间延长，其凋亡率增高，但观察至48小时，凋亡率却减低，此时显微镜下可见许多细胞碎片(附表)。
DNA电泳在Ara-C诱导6小时后均见梯形条带。
讨论Ara-C是作用于细胞S期的特异性抗代谢药物，临床上用于各种白血病的治疗，过去认为其作用机制是杀细胞性的，但近年来认为小剂量Ara-C有诱导分化作用。
本实验显示Ara-C的作用机制是诱导细胞凋亡，且诱导作用在24小时内随诱导时间延长，其凋亡率逐渐增高，而经药物作用48小时后细胞凋亡率反而减低，并且在显微镜下可见较多的细胞碎片，考虑为细胞凋亡后继发性坏死所致，由于碎片无法计数，故导致计数时凋亡细胞相对减少，凋亡率相对下降。
