吖啶橙荧光染色法

吖啶橙染色液吖啶橙染色液(1mg/ml)产品简介：吖啶橙(Acridine Orange, AO)属于三环杂芳香燃料，可以标记DNA、RNA，属于异染性荧光染料。

该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA 和RNA 染色。

因此AO 常用于细胞内DNA 和RNA 进行检测。

AO 与核酸结合方式主要有：1、插入性结合，AO 嵌入核酸双链的碱基对之间，这种结合方式主要为AO 与DNA 的结合，其荧光发射峰为530nm，激发后呈绿色荧光；2、静电吸引，带正电荷的AO 与单链核酸的磷酸根(带负电荷)产生静电间的吸引结合，这种结合方式主要为AO 与RNA 的结合，其荧光发射峰为640nm，激发后呈红色荧光，少量结合会呈桔黄色或桔红色荧光。

因此，吖啶橙嵌合到双链DNA 分子中显绿色，与DNA 单链或RNA 结合时发桔黄色或橙红色荧光。

(1mg/ml)为储存液，使用时应稀释到合适浓度后使用。

染色后在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。

吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。

吖啶橙染色常与EB 染色合用双染，因EB 只染死细胞使之产生桔黄色荧光，由此可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞。

自备材料：1、 荧光显微镜2、 低速离心机3、 PBS4、 细胞计数板5、 载玻片、盖玻片操作步骤(仅供参考)：1、 收集细胞(采用流式细胞仪检测时，应先固定细胞)，用PBS 清洗细胞1次，计数并调节细胞浓度至106/ml。

2、取适量的细胞悬液，加入Acridine Orange Stain(1mg/ml)，使AO终浓度为8.5～17μg/ml，轻轻混匀。

3、室温避光染色15～20ml，滴加于载玻片上并加盖玻片或上流式细胞仪分析。

4、荧光显微镜下观察(激发滤光片波长488nm，阻断滤光片波长515nm)，计数并拍照。

吖啶橙荧光染色试剂盒产品简介：吖啶橙(Acridine Orange,AO)属于三环杂芳香燃料，可以标记DNA 、RNA ，属于异染性荧光染料。

该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA 和RNA 染色。

因此AO 常用于细胞内DNA 和RNA 进行检测。

AO 与核酸结合方式主要有：1、插入性结合，AO 嵌入核酸双链的碱基对之间，这种结合方式主要为AO 与DNA 的结合，其荧光发射峰为530nm ，激发后呈绿色荧光；2、静电吸引，带正电荷的AO 与单链核酸的磷酸根（带负电荷）产生静电间的吸引结合，这种结合方式主要为AO 与RNA 的结合，其荧光发射峰为640 nm ，激发后呈红色荧光，少量结合会呈桔黄色或桔红色荧光。

因此，吖啶橙嵌合到双链DNA 分子中显绿色，与DNA 单链或RNA 结合时发桔黄色或橙红色荧光。

Jimei 吖啶橙染色试剂盒（Acridine Orange Detection Kit ）主要由AO Stain 、AO Stain Buffer 组成，常用于细胞凋亡的检测。

染色后在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。

吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。

吖啶橙染色常与EB 染色合用双染， EB 只染死细胞使之产生桔黄荧光，由此可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞。

自备材料：1、 荧光显微镜2、 低速离心机3、 PBS4、 细胞计数板5、 载玻片、盖玻片操作步骤（仅供参考）：（一） AO 单独染色1、 收集细胞（采用流式细胞仪检测时，应先固定细胞），用AO Stain Buffer （1×）清洗细胞1次，加入适量的AO Stain Buffer （1×）重悬细胞，计数并调节细胞浓度至106/ml 。

2、 取适量的细胞悬液和AO Stain ，按照细胞悬液和5μl AO Stain=19：1的比例混合，轻轻混匀。

细胞凋亡染色方法
最常见的一种是吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）双染色法。

这个方法就像是给细胞穿上了不同颜色的小衣服来区分它们的状态。

AO可以嵌入双链核酸，让正常细胞和凋亡细胞的细胞核都呈现绿色荧光。

而EB呢，它只能进入那些膜完整性被破坏的细胞，像凋亡晚期细胞，这些细胞的核就会被染成橙红色荧光。

咱们把细胞一染，放在荧光显微镜下看，就可以很清楚地区分正常细胞、凋亡早期细胞（只有绿色荧光）和凋亡晚期细胞（绿色加橙红色荧光）啦，是不是很神奇 ？
还有一种是Annexin V - FITC/PI双染法。

Annexin V是个很聪明的小蛋白，它对磷脂酰丝氨酸（PS）有很高的亲和力。

在细胞凋亡早期，细胞膜的PS会从膜内侧翻转到外侧，这时候Annexin V - FITC就能结合上去，发出绿色荧光。

PI呢，它和EB有点像，是不能进入活细胞和早期凋亡细胞的，只有当细胞死亡，细胞膜完全破损了，它才能进去把细胞核染成红色。

这样通过双染，我们就能准确地检测到凋亡细胞啦，就像给细胞们做了个精准的小体检 。

另外，TUNEL染色法也很厉害哦。

这个方法主要是检测细胞凋亡时断裂的DNA。

细胞凋亡的时候，内源性核酸内切酶会被激活，把染色体DNA在核小体间切断，产生180 - 200bp整数倍的寡核苷酸片段。

TUNEL法就是利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）把生物素或地高辛等标记的dUTP连接到3' - OH末端，然后再用相应的荧光标记的抗体或者酶标抗体去检测这些标记的dUTP，这样凋亡细胞就能被染上色啦，在显微镜下就可以看到那些凋亡的小细胞们啦，是不是感觉像在细胞世界里玩侦探游戏一样 ？。

吖啶橙染色法检测细胞凋亡
实验试剂、仪器：
吖啶橙，稀释液PBS（磷酸缓冲液pH7.0～7.2），1％吖啶橙贮存液，细胞爬片，载玻片，盖玻片，荧光显微镜。

吖啶橙：3，6－（二甲胺基）吖啶盐酸盐，分子式C17H19N3·HCl ·ZnCl2, 分子量438.12g/mol,是一种荧光色素，其检测激发滤光片波长488nm,阻断滤光片波长515nm。

它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光，与DNA结合量少发绿色荧光，与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。

该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。

因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。

吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。

吖啶橙染液有毒，操作时要戴手套，需避光。

实验步骤：
1.配置吖啶橙贮存液（1%）：300mg吖啶橙溶解于30mlPBS缓冲液中，滤过，4
度避光保存。

2.染色时，稀释100倍至终浓度为0.01%。

取300微升的PBS缓冲液，加3微
升的吖啶橙贮存液混匀，室温避光染色5min。

3.在荧光显微镜下选520nm的激发光观察。

实验结果：
正常细胞核的DNA为黄色或黄绿色均匀荧光，细胞质和核仁的RNA为桔黄或桔红荧光。

出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿色荧光，甚至见黄绿色碎片。

细胞坏死时，细胞质内黄绿色或桔黄色荧光均减弱或消失。

细胞凋亡染色种类
细胞凋亡染色有多种方法，包括以下几种常见的染色种类：
1. HE染色：这是一种常用的细胞凋亡染色方法，使用苏木素-伊红染料对细胞进行染色。

在光学显微镜下观察，凋亡细胞会呈现圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状的现象。

2. Giemsa染色：Giemsa染色也是一种常见的细胞凋亡染色方法。

正常细胞的核色泽均一，而凋亡细胞的染色质会浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状和凋亡小体等。

3. AO/PI双染色法：吖啶橙(AO)是一种荧光染料，能透过细胞膜使核DNA和RNA染色。

在荧光显微镜下观察，活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。

凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。

碘化丙啶(PI)是一种DNA 结合性染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而将细胞核染红。

因此，通过AO/PI双染色法可以区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。

4. Hoechst染色：Hoechst染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。

在紫外光激发下，活细胞核呈均匀淡蓝色荧光，凋亡细胞则呈现亮蓝色，或核呈分叶状、边集的荧光。

5. TUNEL染色：这是一种检测细胞凋亡中DNA断裂的方法。

在细胞凋亡过程中，会激活DNA内切酶，导致DNA断裂。

TUNEL 染色可以标记这些断裂的DNA，从而检测细胞凋亡。

以上信息仅供参考，如需了解更多关于细胞凋亡染色的信息，建
议查阅专业书籍或咨询相关领域的专家。

斑马鱼胚胎吖啶橙（Acridine Orange，AO）染色（from 黄春筱师姐）：
1.原理：
吖啶橙（Acridine Orange，AO）是一种核酸选择性染料，它能够掺入DNA分子或者与RNA分子通过静电吸引作用相结合。

掺入了AO染料的DNA分子在525 nm的紫外光照射下，能够激发出绿色荧光。

利用这一原理，AO染料被广泛地用于细胞凋亡的检测。

我们实验中，利用AO染料分别处理24 hpf、48 hpf、72 hpf和96 hpf斑马鱼胚胎，检测注射miR-462/731 Morpholinos的胚胎（MO组）、共注射miR-462/731 Mopholinos和Duplex 的胚胎（挽救组）以及Uninjected Control的胚胎（对照组）的ICM区域（24 hpf）、AGM区域（48hpf）和CHT区域（72hpf-96hpf）的细胞凋亡情况。

2.操作步骤：
2.1 试剂配制：
1)AO染液工作液：
AO染液工作液浓度为5 μg/ml；
首先配制AO贮存液浓度为5 mg/ml，使用时1:1000稀释到工作浓度。

2.2 染色步骤：
1)将斑马鱼胚胎（24hpf，48 hpf，72 hpf，96 hpf）手动剥除卵膜，并用超纯水清洗2次。

2)将斑马鱼胚胎转移到含有5 μg/ml AO染料的培养皿中，28.5°C培养15-30 min（避光）。

3)用新鲜的暴气超纯水（超纯水在28.5°C培养箱中放置一会）替换AO染液，摇床轻摇10 min洗涤胚胎，重复2次。

4)胚胎用0.02% MS-222麻醉后，在荧光显微镜下观察、拍照。