吖啶橙溴化乙锭双荧光染色试剂盒

吖啶橙荧光染色法【实验原理】吖啶橙(acridine orange, A0)是最经典的极灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光。

其激发峰为492nm，荧光发射峰为530nm (DNA )、640 ( RNA )，它与双链DNA的结合方式是嵌入双链之间，而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上。

在蓝光( 502nm) 激发下，细胞核发亮绿色荧光(约530nm)，核仁和胞质RNA发橘红色荧光(>580nm)。

吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但细胞固定阻抑了这种结合，从而主要显示DNA、RNA两种核酸。

【实验用品】1、器材荧光显微镜、牙签、载玻片、盖玻片、滴管、吸水纸。

2、试剂(1)0.1mol/l pH7.0 PBS 液A 液：NaH2PO4・H2O 2.76g，加蒸馏水至100ml;B 液：Na2HPO4 • 7H2O 5.36g，加蒸馏水至100ml;取A 液16.5ml + B 液33.5ml + NaCl 8.5g，用蒸馏水稀释至100ml。

(2)1%吖啶橙原液取0.1g吖啶橙加蒸馏水稀释至100ml (临用时配制0.01%吖啶橙染液：将1%吖啶橙原液用pH7.0 PBS溶液稀释10倍)。

3、材料口腔黏膜上皮细胞临时制片或人肝癌BEL-7402细胞爬片。

(1 )取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上。

(2)95%乙醇溶液固定5min。

(3)滴加0.01%吖啶橙染液5min。

(4)盖上盖玻片，吸水纸吸去盖玻片周围多余液体，镜下观察。

【结果与观察】荧光显微镜下(选用蓝色激发滤片)，可见含DNA的细胞核显示黄绿色荧光，含RNA的细胞质及核仁显示橘红色荧光【注意事项】(1 )制片后一定要晾干玻片，在进行后续步骤，否则会导致细胞脱落。

(2)每种荧光染料，均有自己的最适pH,此时荧光最强。

当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的pH缓冲液中进行。

吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色AO / EB原理与流程zhongyisheng:1、原理：吖啶橙(AO)能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光。

溴乙锭(E仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。

凋亡的细胞呈现为染色增强，荧光更为明亮，均匀一致的圆状或固缩状、团块状结构。

非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。

二者形态迥然相异，很易判别。

在荧光显微镜下观察，可见四种细胞形态：活细胞(VN)，核染色质着绿色并呈正常结构；早期凋亡细胞(VA)，核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状；非凋亡的死亡细胞(NVN)，核染色质着橘红色并呈正常结构；晚期凋亡细胞(NVA)，核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状。

2、AO/EB染色及观察结果：取 20-100μl的1：100稀释的染色剂置于载玻片的贴壁细胞上室温下静置20min，PBS洗涤2-3遍，上覆盖玻片，荧光显微镜下观察结果并计数20-200个细胞。

ym1051:1、能否提供具体实验步骤?2、您在文中所说的"1：100稀释的染色剂"是怎样稀释的?如何在载玻片上种上贴壁细胞?zhongyisheng:1、用1mlEP管稀释时，先取微量的染色剂，然后再取稀释剂（如BSA）加入EP 管吹打即可。

2、消毒灭菌处理后的盖玻片平放入培养皿或中即可实验。

ym1051:我好像已明白具体过程了:首先要进行细胞爬片,然后将染色剂滴加在已爬有细胞的盖玻片上,温育后洗涤,再盖上盖玻片则可进行观察了.是这样吗?如果不经过爬片处理而将细胞进行消化,再将细胞和染色剂滴加在盖玻片上进行观察,行吗?zhongyisheng: 的确，不经过爬片而是将贴壁细胞消化下来一样可以进行进一步的实验。

这是悬浮细胞的典型方法。

当然，由于进行免疫组化染色进行的形态学检查经常考虑到细胞的原貌，在国际上比较通用，尤其是在进行动态检查时。

医琳师妹：我将我所作的方法与大家共享：吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色测定PC12细胞凋亡（acridine orange/ethidium bromide, AO/EB）：（1）细胞爬片：在6孔培养板中预先置入玻璃盖玻片，接种细胞悬液，干预后，予95%乙醇固定15分钟，微干，然后准备荧光染色。

吖啶橙染色液吖啶橙染色液(1mg/ml)产品简介：吖啶橙(Acridine Orange, AO)属于三环杂芳香燃料，可以标记DNA、RNA，属于异染性荧光染料。

该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA 和RNA 染色。

因此AO 常用于细胞内DNA 和RNA 进行检测。

AO 与核酸结合方式主要有：1、插入性结合，AO 嵌入核酸双链的碱基对之间，这种结合方式主要为AO 与DNA 的结合，其荧光发射峰为530nm，激发后呈绿色荧光；2、静电吸引，带正电荷的AO 与单链核酸的磷酸根(带负电荷)产生静电间的吸引结合，这种结合方式主要为AO 与RNA 的结合，其荧光发射峰为640nm，激发后呈红色荧光，少量结合会呈桔黄色或桔红色荧光。

因此，吖啶橙嵌合到双链DNA 分子中显绿色，与DNA 单链或RNA 结合时发桔黄色或橙红色荧光。

(1mg/ml)为储存液，使用时应稀释到合适浓度后使用。

染色后在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。

吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。

吖啶橙染色常与EB 染色合用双染，因EB 只染死细胞使之产生桔黄色荧光，由此可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞。

自备材料：1、 荧光显微镜2、 低速离心机3、 PBS4、 细胞计数板5、 载玻片、盖玻片操作步骤(仅供参考)：1、 收集细胞(采用流式细胞仪检测时，应先固定细胞)，用PBS 清洗细胞1次，计数并调节细胞浓度至106/ml。

2、取适量的细胞悬液，加入Acridine Orange Stain(1mg/ml)，使AO终浓度为8.5～17μg/ml，轻轻混匀。

3、室温避光染色15～20ml，滴加于载玻片上并加盖玻片或上流式细胞仪分析。

4、荧光显微镜下观察(激发滤光片波长488nm，阻断滤光片波长515nm)，计数并拍照。

吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色试剂盒简介：细胞凋亡(Apoptosis)的检测方法有形态学、生物化学、DNA片段化检测方法以及TUNEL等标记片段化DNA方法，但从细胞凋亡概念产生的历史及准确性方面考虑，使用显微镜进行的形态学观察也是很重要的。

细胞死亡的检测可以通过荧光色素染色区分活细胞、死细胞，测定细胞代谢活性和形态学观察。

这些方法都是利用细胞凋亡这种情况进行测定的，因而不一定反映实际情况。

MTT法是测定线粒体中特有酶的活性，反映细胞数目的变化，其结果与细胞死亡的数目未必完全一致。

吖啶橙(Acridine Orange, AO)属于三环杂芳香燃料，可以标记DNA、RNA,属于异染性荧光染料，AO常用于细胞内DNA和RNA进行检测。

AO与核酸结合方式主要有：1、插入性结合，AO嵌入核酸双链的碱基对之间，这种结合方式主要为AO与DNA的结合，其荧光发射峰为530nm，激发后呈绿色荧光；2、静电吸引，带正电荷的AO与单链核酸的磷酸根(带负电荷)产生静电间的吸引结合，这种结合方式主要为AO与RNA的结合，其荧光发射峰为640nm，激发后呈红色荧光，少量结合会呈桔黄色或桔红色荧光。

因此，吖啶橙嵌合到双链DNA分子中显绿色，与DNA单链或RNA结合时发橙红色荧光。

溴化乙锭(Ethidium Bromide,EB)嵌合到双链DNA或RNA的碱基对中，无碱基特异性，发红色荧光。

吖啶橙可透过活细胞膜，EB不能通过与活细胞膜具有相同通透性的细胞膜。

组成：自备材料：1、荧光显微镜2、PBS3、细胞计数板4、载玻片、盖玻片操作步骤(仅供参考)：1、AO/EB工作液的配制：取试剂(A)、试剂(B)、试剂(C)，试剂(A):试剂(B):试剂(C)按照一定的比例稀释成AO/EB工作液。

2、每份细胞样品中加入AO/EB工作液，混合均匀。

3、低速离心：离心，弃上清。

4、用AO/EB Dilution Buffer重悬细胞，细胞计数，将细胞密度调整。

吖啶橙区分活细胞DNA和RNA的荧光组织化学染⾊法吖啶橙区分活细胞DNA和RNA的荧光组织化学染⾊法吖啶橙《acridine oran。

AO)属于三环杂芳⾹类异嗜性阳离⼦荧光染料，主要以两种⽅式与核酸结合，⼀是嵌⼊核酸双链的碱基对之间；⼆是与单链核酸的磷酸发⽣静电相互作⽤。

当吖啶橙与DNA或RNA结合时，最⼤发射波长分别为525nm或650nm，产⽣绿⾊荧光或橙红⾊荧光，因此，吖啶橙是研究核酸的⼀种常⽤荧光组织化学染料。

下⾯介绍应⽤吖啶橙区分活细胞和原位组织细胞DNA和RNA荧光组织化学染⾊法。

1．溶液配制(1)吖啶橙浓缩液(4℃、避光，可保存数⽉)双蒸⽔ 50ml吖啶橙 50mg(2)甲液双蒸⽔ 200mlHCl 16mlNaCl 1．74gTriton X-100 0．2ml(3)⼄液0．2mol／LNa2HP04／0．1mol／L枸橼酸缓冲液(pH 6．0)双蒸⽔ 100mlNa2 HP04?12H20 4．51g枸橼酸(⽆⽔柠檬酸) 0．71g溶解后，依次加⼊以下试剂和吖啶橙浓缩液NaCl(0．15mol／L) 0．87gEDTA-Na(1mmol／1) 0．037g吖啶橙浓缩液 0．6ml加⼊吖啶橙浓缩液后，应尽早使⽤。

2．操作程序(1)取0．2ml含10％⼩⽜⾎清的细胞悬液，再与0．4ml冷“甲液”混合，振荡15秒；(2)加⼊l.2ml"⼄液”，充分混匀；(3)于10分钟内，荧光显微镜观察，激发波长为488nm。

结果：DNA为黄绿⾊荧光，⽽RNA为橘红⾊荧光。

如果同时进⾏DNA和RNA染⾊时，需⽤鳌合剂处理，使双链RNA变性，确保所有的RNA均为单链，⽽双链DNA不受影响，增加结果的可信性。

鳌合剂以⼄⼆胺四⼄酸(EDTA)为佳。

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实验技术吖啶橙/溴乙锭双荧光染色检测细胞凋亡的形态学方法南京医科大学第一附属医院临床实验研究室(南京210029)汪承亚　盛瑞兰　汪　凡　丁小健　邱宁雷 细胞凋亡(apoptosis)是不同于细胞坏死的一种细胞主动性死亡,近年已引起人们广泛重视。

Kerr等[1]首先用电子显微镜检描述凋亡细胞核浓缩、密度增高,细胞膜、细胞器相对完整等形态特征。

之后Wyllie[2]等提取凋亡细胞的DNA作电泳分析,见到相差为180～200bp 整倍数的DNA梯状条带,成为鉴定细胞凋亡的经典方法。

近期文献报道应用流式细胞仪测定受检细胞群体中凋亡细胞的百分率。

然而,电子显微镜,流式细胞仪非一般实验所能装备,操作较为复杂。

DNA电泳分析则不能估计细胞凋亡的发生率。

最近,我们在研究人结肠肿瘤细胞的细胞凋亡时,采用吖啶橙(acridine orange,AO)/溴乙锭(ethidium bromide,E B)双荧光染色,在荧光显微镜下观察凋亡细胞核的形态学改变[3,4]。

结果表明这是一种简单可行的检测细胞凋亡的方法。

既可早期发现凋亡细胞,又可分析细胞凋亡的发生率。

结果可靠,适于一般实验室开展。

材　料　与　方　法 一、受检细胞的收集:人结肠肿瘤细胞株Vaco330等系贴壁培养细胞株。

培养条件同前[3,4]。

收集脱落在培养液中的悬浮细胞为受检细胞。

经1500r/min 离心5min,细胞再悬于适量培液中,使悬浮细胞浓度达109/L左右。

立即作荧光染色形态学检测。

抽提细胞DNA时,受检细胞用PBS洗涤3次,立即提取DNA,或保存细胞于-80℃,供以后提取DNA之用。

二、AO/E B双荧光染色及荧光显微镜观察: 用PBS配制AO(Sigma A-6014)/EB(Sigma E-8751)各为100mg/L的混合染液,避光保存于室温或4℃,可使用半年以上。

取100μL受检细胞悬液,加4μL上述荧光染色液,轻轻打匀后,取细胞悬液一滴滴在洁净玻片上,加盖玻片后立即置荧光显微镜下观察。

吖啶橙荧光染色试剂盒产品简介：吖啶橙(Acridine Orange,AO)属于三环杂芳香燃料，可以标记DNA 、RNA ，属于异染性荧光染料。

该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA 和RNA 染色。

因此AO 常用于细胞内DNA 和RNA 进行检测。

AO 与核酸结合方式主要有：1、插入性结合，AO 嵌入核酸双链的碱基对之间，这种结合方式主要为AO 与DNA 的结合，其荧光发射峰为530nm ，激发后呈绿色荧光；2、静电吸引，带正电荷的AO 与单链核酸的磷酸根（带负电荷）产生静电间的吸引结合，这种结合方式主要为AO 与RNA 的结合，其荧光发射峰为640 nm ，激发后呈红色荧光，少量结合会呈桔黄色或桔红色荧光。

因此，吖啶橙嵌合到双链DNA 分子中显绿色，与DNA 单链或RNA 结合时发桔黄色或橙红色荧光。

Jimei 吖啶橙染色试剂盒（Acridine Orange Detection Kit ）主要由AO Stain 、AO Stain Buffer 组成，常用于细胞凋亡的检测。

染色后在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。

吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。

吖啶橙染色常与EB 染色合用双染， EB 只染死细胞使之产生桔黄荧光，由此可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞。

自备材料：1、 荧光显微镜2、 低速离心机3、 PBS4、 细胞计数板5、 载玻片、盖玻片操作步骤（仅供参考）：（一） AO 单独染色1、 收集细胞（采用流式细胞仪检测时，应先固定细胞），用AO Stain Buffer （1×）清洗细胞1次，加入适量的AO Stain Buffer （1×）重悬细胞，计数并调节细胞浓度至106/ml 。

2、 取适量的细胞悬液和AO Stain ，按照细胞悬液和5μl AO Stain=19：1的比例混合，轻轻混匀。

细胞凋亡染色方法
最常见的一种是吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）双染色法。

这个方法就像是给细胞穿上了不同颜色的小衣服来区分它们的状态。

AO可以嵌入双链核酸，让正常细胞和凋亡细胞的细胞核都呈现绿色荧光。

而EB呢，它只能进入那些膜完整性被破坏的细胞，像凋亡晚期细胞，这些细胞的核就会被染成橙红色荧光。

咱们把细胞一染，放在荧光显微镜下看，就可以很清楚地区分正常细胞、凋亡早期细胞（只有绿色荧光）和凋亡晚期细胞（绿色加橙红色荧光）啦，是不是很神奇 ？
还有一种是Annexin V - FITC/PI双染法。

Annexin V是个很聪明的小蛋白，它对磷脂酰丝氨酸（PS）有很高的亲和力。

在细胞凋亡早期，细胞膜的PS会从膜内侧翻转到外侧，这时候Annexin V - FITC就能结合上去，发出绿色荧光。

PI呢，它和EB有点像，是不能进入活细胞和早期凋亡细胞的，只有当细胞死亡，细胞膜完全破损了，它才能进去把细胞核染成红色。

这样通过双染，我们就能准确地检测到凋亡细胞啦，就像给细胞们做了个精准的小体检 。

另外，TUNEL染色法也很厉害哦。

这个方法主要是检测细胞凋亡时断裂的DNA。

细胞凋亡的时候，内源性核酸内切酶会被激活，把染色体DNA在核小体间切断，产生180 - 200bp整数倍的寡核苷酸片段。

TUNEL法就是利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）把生物素或地高辛等标记的dUTP连接到3' - OH末端，然后再用相应的荧光标记的抗体或者酶标抗体去检测这些标记的dUTP，这样凋亡细胞就能被染上色啦，在显微镜下就可以看到那些凋亡的小细胞们啦，是不是感觉像在细胞世界里玩侦探游戏一样 ？。

吖啶橙染色原理
吖啶橙是一种双碱性染料，具有两个氨基和两个芳香环结构。

它可以与DNA
和RNA结合，通过静电作用和氢键作用，与核酸中的腺嘌呤和胞嘧啶基团结合，
从而实现对核酸的染色。

吖啶橙的结构中含有芳香环和氨基，使其具有较强的荧光性能，能够在紫外光下产生橙色荧光。

在细胞或组织染色实验中，吖啶橙可以通过渗透染色或者固定染色的方式，将
其加入到待染细胞或组织中，与核酸结合形成吖啶橙-核酸复合物。

当使用荧光显
微镜观察时，激发波长为紫外光，吖啶橙-核酸复合物会发出橙色荧光信号，从而
实现对核酸的观察和检测。

吖啶橙染色的原理基于其与核酸的结合特性，通过与核酸的特异性结合，实现
对核酸的染色和检测。

由于吖啶橙具有较强的荧光性能，能够产生明亮的橙色荧光信号，因此在细胞生物学和分子生物学研究中得到了广泛的应用。

吖啶橙染色原理的了解对于科研工作者在实验设计和数据解读中具有重要意义。

在细胞和组织的荧光染色实验中，科研人员需要根据样本的特点和实验要求，选择合适的染色方法和条件，合理设计实验方案，以确保获得准确可靠的实验结果。

总之，吖啶橙作为一种重要的荧光染料，在生物学和医学领域发挥着重要作用。

了解其染色原理，可以帮助科研人员更好地应用吖啶橙进行细胞和组织的荧光染色实验，为科研工作提供有力支持。

希望本文对吖啶橙染色原理有所帮助，同时也希望科研人员能够在实验中充分
发挥吖啶橙的优势，取得更多有意义的研究成果。