吖啶橙

细胞自噬预实验化学染色法1、试验目的通过化学染料吖啶橙（acridine orange，AO）染色木犀草素处理后的HepG2细胞判断木犀草素是否诱导HepG2细胞发生自噬。

2、试验原理3，6－（二甲胺基）吖啶盐酸盐，分子式C17H19N3 · HCl · ZnCl2, 分子量438.12g/mol,是一种荧光色素，其检测激发滤光片波长488nm,阻断滤光片波长515nm。

它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光，与DNA 结合量少发绿色荧光，与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。

该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。

AO也可以渗透进入酸性细胞器，例如自噬溶酶体，发生自噬的细胞经吖啶橙染色，在荧光显微镜下可观察到红黄色点状体，称为酸性小体，当PH值较低的时候，AO发出红色荧光，且强度与酸性程度相关。

所以在AO标记的细胞中，酸性囊泡细胞器结构可以通过荧光显微镜下观察到。

3、试验材料及试剂HepG2细胞株、DMEM培养基（含10%FBS、100U青霉素和链霉素）、PBS、0.25%胰蛋白酶、吖啶橙（AO）、木犀草素、6孔板、载玻片、盖玻片AO储备液：准确称量10mg吖啶橙融入10ml三蒸水中，配置成储备液。

实验前取5.0ml PBS溶解10ulAO储备液，配置成染色液。

4、试验方法1）取对数期生长的细胞按1-5×105个/ml的浓度接种在六孔板中，24h后加入终浓度为50uM、100uM、200uM的木犀草素及100uM的5-Fu，药物处理48h。

2）药物处理后，用PBS清洗2次，0.25%的胰酶消化细胞制成细胞悬液。

3）将细胞悬液1000rpm离心3min，去掉上清，加入PBS把细胞浓度调节到1--10×105个/ml，吹打混匀。

4）取300ul细胞悬液，加入染色液至终浓度为1ug/ml，37℃避光孵育15-30min 5）染色结束后用PBS清洗3次，1000rpm离心3min，涡旋震荡混匀6）最后一次离心后留下少量液体，取10ul染色后的细胞滴加在载玻片上，盖上盖玻片7）把临时装片放在荧光显微镜下观察，取对照组和药物组细胞数目相似的视野进行拍照。

吖啶橙染色液吖啶橙染色液(1mg/ml)产品简介：吖啶橙(Acridine Orange, AO)属于三环杂芳香燃料，可以标记DNA、RNA，属于异染性荧光染料。

该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA 和RNA 染色。

因此AO 常用于细胞内DNA 和RNA 进行检测。

AO 与核酸结合方式主要有：1、插入性结合，AO 嵌入核酸双链的碱基对之间，这种结合方式主要为AO 与DNA 的结合，其荧光发射峰为530nm，激发后呈绿色荧光；2、静电吸引，带正电荷的AO 与单链核酸的磷酸根(带负电荷)产生静电间的吸引结合，这种结合方式主要为AO 与RNA 的结合，其荧光发射峰为640nm，激发后呈红色荧光，少量结合会呈桔黄色或桔红色荧光。

因此，吖啶橙嵌合到双链DNA 分子中显绿色，与DNA 单链或RNA 结合时发桔黄色或橙红色荧光。

(1mg/ml)为储存液，使用时应稀释到合适浓度后使用。

染色后在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。

吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。

吖啶橙染色常与EB 染色合用双染，因EB 只染死细胞使之产生桔黄色荧光，由此可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞。

自备材料：1、 荧光显微镜2、 低速离心机3、 PBS4、 细胞计数板5、 载玻片、盖玻片操作步骤(仅供参考)：1、 收集细胞(采用流式细胞仪检测时，应先固定细胞)，用PBS 清洗细胞1次，计数并调节细胞浓度至106/ml。

2、取适量的细胞悬液，加入Acridine Orange Stain(1mg/ml)，使AO终浓度为8.5～17μg/ml，轻轻混匀。

3、室温避光染色15～20ml，滴加于载玻片上并加盖玻片或上流式细胞仪分析。

4、荧光显微镜下观察(激发滤光片波长488nm，阻断滤光片波长515nm)，计数并拍照。

吖啶橙（Acridine Orange）是一种荧光染料，常用于细胞和组织的染色。

它可以与DNA和RNA结合，并发出绿色和橙色的荧光信号。

溶酶体是细胞内的一种细胞器，主要参与细胞内物质的降解和消化。

吖啶橙染色溶酶体的原理是，吖啶橙可以穿过细胞膜进入细胞内，并与溶酶体内的DNA结合。

在酸性环境下，吖啶橙与DNA结合的荧光信号会发生变化。

在弱酸性条件下，吖啶橙发出绿色荧光；而在强酸性条件下，吖啶橙发出橙色荧光。

通过观察细胞或组织中溶酶体的荧光颜色，可以了解溶酶体的酸性程度和功能状态。

正常情况下，溶酶体处于弱酸性状态，吖啶橙发出绿色荧光；而当溶酶体功能异常或酸性增加时，吖啶橙发出橙色荧光。

这种染色方法可以用于研究溶酶体相关的疾病，如溶酶体贮积病和溶酶体功能障碍等。

需要注意的是，吖啶橙染色溶酶体的原理是基于荧光信号的变化，因此在观察时需要使用荧光显微镜或其他荧光检测设备。

acridine orange
吖啶橙，化学名称为3,6-二(二甲基胺)吖啶、溶剂橙15，是一种有机化合物，化学式为C17H19N3，是一种荧光色素，主要用作荧光指示剂，与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光，与DNA结合量少发绿色荧光，与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光，该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。

因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。

吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。

吖啶橙AO 常与溴化乙啶EB合用双染，因EB只染死细胞使之产生桔黄色荧光，由此可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞，它还可以用作移码突变的诱变剂，能镶嵌于两个相邻的碱基对之间，这样在DNA复制过程中，会使DNA链增加或缺失一个碱基，造成移码突变。

2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，吖啶橙在3类致癌物清单中。

细胞凋亡染色方法
最常见的一种是吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）双染色法。

这个方法就像是给细胞穿上了不同颜色的小衣服来区分它们的状态。

AO可以嵌入双链核酸，让正常细胞和凋亡细胞的细胞核都呈现绿色荧光。

而EB呢，它只能进入那些膜完整性被破坏的细胞，像凋亡晚期细胞，这些细胞的核就会被染成橙红色荧光。

咱们把细胞一染，放在荧光显微镜下看，就可以很清楚地区分正常细胞、凋亡早期细胞（只有绿色荧光）和凋亡晚期细胞（绿色加橙红色荧光）啦，是不是很神奇 ？
还有一种是Annexin V - FITC/PI双染法。

Annexin V是个很聪明的小蛋白，它对磷脂酰丝氨酸（PS）有很高的亲和力。

在细胞凋亡早期，细胞膜的PS会从膜内侧翻转到外侧，这时候Annexin V - FITC就能结合上去，发出绿色荧光。

PI呢，它和EB有点像，是不能进入活细胞和早期凋亡细胞的，只有当细胞死亡，细胞膜完全破损了，它才能进去把细胞核染成红色。

这样通过双染，我们就能准确地检测到凋亡细胞啦，就像给细胞们做了个精准的小体检 。

另外，TUNEL染色法也很厉害哦。

这个方法主要是检测细胞凋亡时断裂的DNA。

细胞凋亡的时候，内源性核酸内切酶会被激活，把染色体DNA在核小体间切断，产生180 - 200bp整数倍的寡核苷酸片段。

TUNEL法就是利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）把生物素或地高辛等标记的dUTP连接到3' - OH末端，然后再用相应的荧光标记的抗体或者酶标抗体去检测这些标记的dUTP，这样凋亡细胞就能被染上色啦，在显微镜下就可以看到那些凋亡的小细胞们啦，是不是感觉像在细胞世界里玩侦探游戏一样 ？。

吖啶橙染色原理
吖啶橙是一种双碱性染料，具有两个氨基和两个芳香环结构。

它可以与DNA
和RNA结合，通过静电作用和氢键作用，与核酸中的腺嘌呤和胞嘧啶基团结合，
从而实现对核酸的染色。

吖啶橙的结构中含有芳香环和氨基，使其具有较强的荧光性能，能够在紫外光下产生橙色荧光。

在细胞或组织染色实验中，吖啶橙可以通过渗透染色或者固定染色的方式，将
其加入到待染细胞或组织中，与核酸结合形成吖啶橙-核酸复合物。

当使用荧光显
微镜观察时，激发波长为紫外光，吖啶橙-核酸复合物会发出橙色荧光信号，从而
实现对核酸的观察和检测。

吖啶橙染色的原理基于其与核酸的结合特性，通过与核酸的特异性结合，实现
对核酸的染色和检测。

由于吖啶橙具有较强的荧光性能，能够产生明亮的橙色荧光信号，因此在细胞生物学和分子生物学研究中得到了广泛的应用。

吖啶橙染色原理的了解对于科研工作者在实验设计和数据解读中具有重要意义。

在细胞和组织的荧光染色实验中，科研人员需要根据样本的特点和实验要求，选择合适的染色方法和条件，合理设计实验方案，以确保获得准确可靠的实验结果。

总之，吖啶橙作为一种重要的荧光染料，在生物学和医学领域发挥着重要作用。

了解其染色原理，可以帮助科研人员更好地应用吖啶橙进行细胞和组织的荧光染色实验，为科研工作提供有力支持。

希望本文对吖啶橙染色原理有所帮助，同时也希望科研人员能够在实验中充分
发挥吖啶橙的优势，取得更多有意义的研究成果。

吖啶橙/溴化乙锭双‎荧光染色AO / EB原理与‎流程zhong‎y ishe‎n g:1 原理：吖啶橙(AO)能透过胞膜‎完整的细胞‎，嵌入细胞核‎D NA，使之发出明‎亮的绿色荧‎光。

溴乙锭(E仅能透过‎胞膜受损的‎细胞，嵌入核DN‎A，发橘红色荧‎光。

凋亡的细胞‎呈现为染色‎增强，荧光更为明‎亮，均匀一致的‎圆状或固缩‎状、团块状结构‎。

非凋亡细胞‎核呈现荧光‎深浅不一的‎结构样特征‎。

二者形态迥‎然相异，很易判别。

在荧光显微‎镜下观察，可见四种细‎胞形态：活细胞(VN)，核染色质着‎绿色并呈正‎常结构；早期凋亡细‎胞(VA)，核染色质着‎绿色呈固缩‎状或圆珠状‎；非凋亡的死‎亡细胞(NVN)，核染色质着‎橘红色并呈‎正常结构；晚期凋亡细‎胞(NVA)，核染色质为‎橘红色并呈‎固缩状或圆‎珠状。

2 AO/EB染色及‎观察结果：取 20-100μl‎的1：100稀释‎的染色剂置‎于载玻片的‎贴壁细胞上‎室温下静置‎20min‎，PBS洗涤‎2-3遍，上覆盖玻片‎，荧光显微镜‎下观察结果‎并计数20‎-200个细‎胞。

ym105‎1: 1.能否提供具‎体实验步骤‎?2.您在文中所‎说的"1：100稀释‎的染色剂"是怎样稀释‎的?如何在载玻‎片上种上贴‎壁细胞?zhong‎y ishe‎n g:1 用1mlE‎P管稀释时‎，先取微量的‎染色剂，然后再取稀‎释剂（如BSA）加入EP管‎吹打即可。

2 消毒灭菌处‎理后的盖玻‎片平放入培‎养皿或中即‎可实验。

ym105‎1:我好像已明‎白具体过程‎了:首先要进行‎细胞爬片,然后将染色‎剂滴加在已‎爬有细胞的‎盖玻片上,温育后洗涤‎,再盖上盖玻‎片则可进行‎观察了.是这样吗?如果不经过‎爬片处理而‎将细胞进行‎消化,再将细胞和‎染色剂滴加‎在盖玻片上‎进行观察,行吗?zhong‎y ishe‎n g:的确，不经过爬片‎而是将贴壁‎细胞消化下‎来一样可以‎进行进一步‎的实验。