转基因植物中报告基因GUS组织化学定位检测

报告基因●定义报告基因 (reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。

把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。

特征作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中本不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。

●应用在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因有以下几种：胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶基因(ocs)、新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、庆大霉素转移酶基因、葡萄糖苷酶基因、荧光酶基因等。

nos、ocs这两个基因是致瘤土壤农杆菌(Agrobacterium tumfaciens)的Ti质粒特有的，对Ti质粒进行改造，用相应的致瘤农杆菌转化植物体时，如果外源基因转入植物体中，则这两种报告基因在植物根茎叶中均能表达，不受发育调控，检测时直接用转化体提取液进行纸电泳，染色后在紫外光下观察荧光即可。

nptⅡ、cat及庆大霉素转移酶基因，均为抗生素筛选基因，相关的酶可以对底物进行修饰(磷酸化、乙酰化等)，从而使这些抗生素失去对植物生长的抑制作用，使得含有这些抗性基因的转化体能在含这些抗生素的筛选培养基上正常生长，也可以用转化体提取液体，外用同位素标记，放射自显影筛选转化体。

目前常用的一种报告基因是β-D-葡萄糖苷酶基因，该酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱、荧光等进行检测。

荧光酶基因(luc)是1985年从北美荧火虫和叩头虫cDNA 文库中克隆出来的，该酶在有ATP、Mg2＋、O2和荧光素存在下发出荧光，这样就可用转基因植物整株或部分直接用X-光片或专门仪器进行检测。

GUS报告基因范文GUS报告基因是一种用于筛选转基因植物的报告基因。

它在植物细胞内表达的酵素β-葡萄糖苷酶（β-Glucuronidase，GUS），能够将葡萄糖醛酸（X-Gluc）转化为蓝色产物。

通过观察和分析植物组织的GUS活性，可以判断是否发生了基因转化。

下面将详细介绍GUS报告基因的特点、应用以及实验方法。

1.GUS报告基因的特点（1）GUS基因来自于大肠杆菌，它很少在真核生物中表达，因此不会对植物正常生长发育产生影响。

（2）GUS基因编码的酵素活性能够方便、快速地用染色剂标记出来，实验结果直观可见。

（3）转GUS基因的步骤相对简单，转化率较高，且不需要使用昂贵的设备。

2.GUS报告基因的应用（1）植物转基因筛选：通过观察和分析转基因植物的GUS活性，可以确定哪些植株成功地转化了外源基因。

（2）基因调控研究：GUS报告基因可以用来研究目的基因的表达调控机制，例如在转基因植物中瞬时表达GUS基因，观察其在各种组织和发育阶段的表达情况，可以推测目的基因的启动子活性。

（3）信号传导途径研究：通过构建GUS基因的操纵，可以研究植物信号传导途径中特定基因的表达情况，进而了解信号传导途径的效率和调节机制。

3.实验方法以下是GUS报告基因实验的一般步骤：（1）构建GUS载体：将GUS基因与适合的植物表达载体进行连接，形成GUS转化载体。

（2）遗传转化：将GUS转化载体导入要进行转基因植物研究的植物细胞中，使用适当的生物技术方法（如冲击法、农杆菌介导法）实现遗传转化。

（3）植物筛选：选择经过转化的植株进行分析，通常可以通过PCR、Southern blot、Western blot等技术检测GUS基因的存在。

（4）组织切片染色：收集不同部位的植物组织，例如叶片、根、花等，制作切片。

使用X-Gluc作为底物加入切片中，观察蓝色染色产物的形成。

（5）定量分析：通过测定GUS活性，使用亲合素、含有底物的液体培养基等方法，可以 quantitatively 地测定GUS酶活性。

gus报告基因GUS报告基因。

GUS报告基因是一种用于植物基因表达研究的重要工具。

它是由β-葡萄糖苷酶（β-glucuronidase）基因构建而成，可以被广泛地应用于植物遗传转化和表达分析中。

GUS报告基因的研究对于理解植物基因表达及其调控机制具有重要意义。

首先，GUS报告基因可以用于植物遗传转化的研究。

通过将GUS报告基因导入植物细胞，可以观察到该基因在植物体内的表达情况。

这对于研究外源基因在植物中的表达特点以及转基因植物的遗传稳定性具有重要意义。

通过对GUS报告基因的研究，可以更好地了解植物转基因技术的应用前景及其潜在风险。

其次，GUS报告基因也可以用于植物基因表达分析。

通过将GUS报告基因与目标基因进行融合，可以观察到目标基因在植物体内的表达情况。

这对于研究目标基因在不同组织和发育阶段的表达模式，以及其受到外界环境因素影响的调控机制具有重要意义。

通过对GUS报告基因的研究，可以更好地了解植物基因表达调控的分子机制及其在植物生长发育过程中的作用。

此外，GUS报告基因还可以用于植物转基因技术的研究与应用。

通过对GUS报告基因的表达情况进行定量和定位分析，可以更好地评估转基因植物的表达效率和稳定性。

这对于改良转基因植物的遗传背景和表达性能具有重要意义。

通过对GUS报告基因的研究，可以更好地指导植物转基因技术的开发和应用，为农业生产和生物技术研究提供有力支持。

综上所述，GUS报告基因在植物基因表达研究中具有重要的应用价值。

通过对GUS报告基因的研究，可以更好地理解植物基因表达及其调控机制，促进植物遗传转化和基因功能研究的进展，为植物生物技术的发展和应用提供重要支持。

因此，对GUS报告基因的深入研究具有重要的理论和实际意义，值得进一步深入探讨和应用。

GUS活性的定量检测目的：定量检测转基因植株中报告基因GUS的表达水平用途：比较某个启动子在不同组织中的表达强度，比较不同启动子在同一组织中的表达强度。

试剂：①磷酸缓冲液母液：0.2M Na2HPO4：71.64g/L Na2HPO4·12H2O0.2M NaH2PO4：31.21g/L NaH2PO4·2H2O②GUS抽提液（1L）：PH=7.00.2M Na2HPO4152.5mL0.2M NaH2PO497.5mL14.3M β-ME 700uLNa2-EDTA·2H2O 3.72gTriton-X 100 1mL③10mM 4-MUG（10×）：105.6mg 4-MUG溶于30mL GUS抽提液中，4℃避光保存。

（注意：存放时间越久本底信号越强，尽量现配现用）。

④0.2M Na2CO3反应终止液（1L）：21.2g Na2CO3溶于1000mL ddH2O。

⑤BSA母液（4ug/ul）：40mgBSA溶于10mL ddH2O⑥4-MU母液（10mM）：17.6mg 4-MU溶于10mL 0.2M Na2CO3中，4℃避光保存。

⑦Protein Assay Buffer（5×，Bio-Rad cat.no.500-0006）：使用前要用ddH2O稀释成1×工作液仪器及用品：酶标仪TECAN Infinite M200酶标板（Nunclon 96 Flat Transparent和Greiner 96 Flat Black）操作步骤与注意事项：1.材料于液氮中研磨成粉末，取适量粉末加入3倍体积的GUS抽提液，充分混匀，置冰上。

（注意，尽量保证每个样品所取的粉末量都比较一致，这样抽提出来的总蛋白浓度比较接近，方便后续操作。

）2.10000g 4℃离心10min，上清液转移到新的1.5mL离心管，则得到总蛋白粗提液（可于4度短期保存或于-70℃长期保存；但不要存于-20℃，该温度下GUS不稳定）。

GUS组织化学染色GUS组织化学染色GUS组织化学染色1. 实验原理适宜的反应条件下，β-葡聚糖苷酶（GUS）可将X-Gluc水解成蓝色物质，因此具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点，可用肉眼或显微镜观察到。

2．实验材料1）转基因烟草叶片或试管苗2）非转基因烟草的叶片或试管苗（阴性对照）3．药品试剂1) X-Gluc，用N-N-二甲基酰胺配成20mM的贮存液，分装成每管100L，保存于-20℃。

2) 底物溶液（染色液）：3) 1mM X-Gluc加入100mM磷酸钠缓冲液（pH=7.0）,缓冲液中含10mM EDTA-Na2，1-5mM K3[Fe(CN)6](铁氰化钾)，1-5mM K4[Fe(CN)6](亚铁氰化钾)，0.001%（V/V）Triton X-100 4．实验器材小药瓶，培养皿，培养箱（37℃），微量移液器5．实验步骤1) 将准备好的叶片放入小药瓶，加入染色液浸没试材，封好盖子；2) 37℃培养箱中温育1小时至过夜；3) 将浸染过的试材转入70%或95%乙醇中脱色2-3次（除去叶绿素），至阴性对照材料呈白色为止。

6．结果叶片上GUS活性的部位或位点呈现蓝色或蓝色斑点。

先用DMSO溶解X-GLUC 好像是100mg/2ml PBF 94ML+X-GLUC 0.1ML+***** X-100 2ML +FE2+ 2ML+ FE3+ 2ML Gus staining1. Excise root and leaf segments, wash with 100mM potassiumphosphate buffer (pH7.0) for 3 times.GUS组织化学染色2. Immerse in the Gus substrate solution, 37C, dark, 12-24h3. Rinse in phosphate buffer4. Fix for 4h or longer5. Rinse in the same buffer6. Observe as whole specimens or as sections.1M potassium phosphate buffer (pH7.0)K2HPO4: 34.8g ---200mlKH2PO4: 27.2g----200ml184.5ml K2HPO4+115.5ml KH2PO4---- 300ml 1M potassium phosphate buffer(pH7.0)Gus substrate solutionVolume(500ml)Final concentrationPotassium ferricyanide82mg0.5mMPotassium ferrocyanide105.6mg0.5mMPotassium phosphate buffer (pH7.0, 1M)50ml100mMStore at -20C. Add 1mM x-gulc (MW521.8~~0.5mg/ml) freshly when use.Fix solution2.5% glutaraldehyde200mM sodium cacodylate, pH7.2GUS组织化学染色共培养后愈伤的瞬时表达、抗性愈伤的鉴定以及转基因植株的鉴定用GUS组织化学法测定.将待测定的材料,如愈伤或叶片,浸入适量X-Gluc溶液,于37 ℃保温过夜后,在体视显微镜下观察,拍照记录.若将加有X-Gluc溶液的材料抽真空,染色效果将更好.如材料存在色素干扰问题,染色后用酒精脱色,使色素的颜色褪掉而使染成的蓝色保存.X-Gluc染色液：（20*）0.2 mol/L Na3PO4缓冲液(62 mL 0.2 mol/L Na2HPO4;38 mL 0.2 mol/L NaH2PO4)，pH 7.0；0.1 mol/L K3［Fe(CN)6］;0.1 mol/L K4［Fe(CN)6］.3H2O;1.0 mol/L Na2EPTA;0.1% X-Gluc.1000mlx-gluc 1000mg （20ml dmso）Na2HPO4: 620*0.2*M=0.620*0.2*358（12H2O）=44NaH2PO4: 380*0.2*M=0.358*0.2*156（2H2O）=11K3［Fe(CN)6:1000*0.01*M=329．26*0.01=3.3K4［Fe(CN)6]:1000*0.01*M=422．39（3H2O）*0.01=4.2Triton 1MLNa2EPTA:1000*0.1*M=372.24(2H2O)=371. 取 5 mg X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide)溶於100 l DMSO於中.2. 加入10 ml reaction buffer (10 mM Na2EDTA, 100 mM NaH2PO4H2O, 0.1% Triton, 0.5 mM potassium ferricyanide, 0.5 mM potassium ferrocyanide, pH 7.0).3. 混合均匀后分装於eppendorf tube中,保存於-20℃冰箱内.100ml x-gluc染液配制x-gluc 50mg加入溶入1ml dmso1ml triton 100Na2EDTA (20mM) 10mM 5ml ; K3Fe(CN)6 (0.1M) 5mM 0.5ml K4Fe(CN)6 (0.1M) 5mM 0.5ml ; Na2HPO4 (0.2M) 100mM 3.1ml。

gus染色技术在遗传学实验教学中的应用Gus染色技术是一种常用的植物细胞组织活性染色技术，它可以用来
观察植物细胞中酵素表达的变化情况。

在遗传学实验教学中，Gus染色技
术被广泛应用，它可以帮助学生更好地了解植物基因表达的过程，同时也
可以培养他们的实验操作能力和科学思维能力。

以下是Gus染色技术在遗传学实验教学中的几个应用场景：
1.观察基因表达的时空特点。

Gus染色是一种靶向不同时间和组织区域检测基因表达的方法，可以
在植物发育早期就对各种组织部位的基因表达进行检测。

学生可以通过观
察Gus染色结果来探索基因表达的时空特点，并分析影响基因表达的因素。

2.研究转基因植物的表达情况。

Gus染色技术是一种便捷而又经济的评价转基因植物表达情况的方法。

学生可以借助Gus染色法观察转基因植物中Gus基因的表达情况，从而研
究转基因植物在不同条件下的表达情况和转基因效率。

3.分析基因调控。

Gus染色技术还可以用于研究基因调控，尤其是在探讨转录因子对基
因表达的影响时。

学生可以将GUS基因与某些特定基因的启动子结合，以
便对基因表达的调节进行详细的观察和研究。

4.探究物种间的基因表达差异。

Gus染色技术可以用于探究不同物种之间基因表达的差异。

学生可以
通过比较不同物种的Gus染色结果，了解它们的遗传差异和进化关系，并
深入探究这些差异引起的生物学功能变化。

总之，Gus染色技术在遗传学实验教学中具有重要的应用和意义，它可以帮助学生深入了解植物基因表达的机制，掌握实验操作技能，并启发他们的科学思维和能力。

、原理Gus (b-glucuronidase)基因作为一种报告基因，在植物遗传转化研究中有广泛的用途。

Gu s基因来自于大肠杆菌，编码b—葡聚糖苷酶(一种水解酶)，可催化底物5—溴—4—氯—3 —吲哚葡聚糖醛酸苷(5 —bromo-4-chloro-3-indolyl-glucronide ，缩写为X —Gluc)分解，产生肉眼可见的深兰色化合物，借此用来观察转基因植物中外源基因的表达情况，鉴定转基因植株。

二、目的了解转基因植物中基因表达的器官、组织和细胞的特异性，掌握Gus报告基因表达的组织化学定位的方法。

三、材料与试剂1、转基因植物的组织、器官、种胚或幼苗。

t2、同种非转化植物的组织、器官、种胚或幼苗。

3、50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)。

4、染色液：100mM K3[Fe(CN) 6], 100mM a[Fe(CN) 6] 10mM Na 2EDTA , 0.001% (v/v) triton X-100, 20% 甲醇，0.5mg/ml X-Gluc,磷酸缓冲液(50mM, pH 7.0)。

5、70 %乙醇。

四、操作步骤1、将准备好的材料冲洗干净，用吸水纸吸干，浸在上述染色液中37 C恒温条件下保温过夜。

2、转入70%乙醇中脱色2 —3次，去除叶绿素，至阴性对照材料呈白色时为止。

3、肉眼或显微镜下观察，白色背景上的兰小点即为Gus基因表达的位点。

4、83 %、95 %、100 %乙醇中脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。

5、常规石蜡切片法切片，番红染色。

6、显微镜下观察、拍照。

五、说明1、要设立严格的阴性对照，即用同样的未转化的材料按相同的方法同时进行染色。

如阴性对照显示兰色，其原因可能是：A）材料和试剂被细菌感染； B ）保温时间过长。

2、染色液中的甲醇可抑制细菌生长，长时间染色可加入0.02% NaN3或100mg/ml的氯霉素，短时间染色也可以不加。

3、叶绿体含量高的材料染色后要进行脱色。