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转基因植物的筛选与鉴定随着植物转基因技术的不断进步，它对于分子遗传学研究和植物改良都具有特别重要的意义。
转基因植株的筛选在转基因技术中起着关键性的作用。
将含有35S启动子的基因载体PMDC150经农杆菌介导，利用农杆菌侵染拟南芥花序的方法转入拟南芥后得到T1代种子。
文章通过组织培养来筛选含有Kan抗性的转基因植株。
标签：拟南芥；转基因植物；筛选1 文献综述1.1 转基因植物的研究进展植物的遗传转化是指利用重组DNA，细胞组织培养等方法，将外源基因导入到植物的组织或细胞中，获得转基因植物的技术[1]。
从转基因植株成功之后，转基因技术飞速发展，如今，植物在抗病、抗虫和抗药等方面都有了转基因植株。
这种技术对改进农作物品质、提高产量等方面都有非常大的帮助。
1.2 基因转化技术随着人们对基因转化技术不断地深入研究和探索，现已发现多种基因转化的方法，例如农杆菌介导的基因转化、花粉管通道法等。
相比较其他植物基因的转化方法，农杆菌介导法有着减少成本、容易操作等优点，但对宿主细胞有着严格的要求。
每种方法都有其优缺点，所以根据植物的不同种类，我们要选择合理的转化方法，达到理想的转化效果。
1.3 本论文的目的和意义植物的转基因技术日新月异迅速发展，已经成为许多国家重点发展的新目标新领域，它所产生的巨大的社会和经济效益促使各个国家对其进行更加深入的研究，由其产生的巨大的生产潜能一定会推动社会的进步，改善人类现有的生产、生活质量以及健康水平。
本文以拟南芥为主要研究对象，通过转化后的农杆菌侵染拟南芥花序的方法及组织培养的方法进行了轉基因植物的筛选。
借由本次实验研究，可深入了解基因工程等相关领域的理论，可熟练掌握相关技术例如无菌操作技术、植物转基因技术、植物组织培养技术等等。
2 转基因植物的筛选与鉴定2.1 实验材料2.1.1 植物材料拟南芥2.1.2 载体与菌株重组表达载体PMDC150-35S（由实验室提供）、农杆菌菌株GV31012.1.3 主要试剂75%酒精、84消毒液、侵染缓冲液、限制性内切酶、卡那霉素、壮观霉素（重组表达载体含有的抗性）、利福平2.1.4 培养基LB培养基：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，15g/L琼脂（只固体培养基添加）1/2MS培养基2.2 实验方法2.2.1 拟南芥种植：将种子放在浸过水的滤纸上，放在4℃的冰箱中，不见光培养24小时，然后取出种子种在营养土里，在光照强度8000Lux，温度25℃的培养箱中经过光照16小时/黑暗8小时培养[2]。
植物遗传转化步骤植物遗传转化是指通过外源DNA的导入，使植物细胞或组织发生基因改变，从而获得具有特定性状的转基因植物。
这一技术在农业、医学和工业等领域有着广泛的应用。
下面将介绍植物遗传转化的基本步骤。
步骤一：选择外源DNA在植物遗传转化中，首先需要选择外源DNA，也就是我们要导入到植物细胞中的目标基因。
这个目标基因可以来自于其他物种，也可以是人工合成的。
目标基因的选择取决于我们希望在转基因植物中表达的特定性状。
步骤二：构建转化载体将目标基因导入植物细胞需要使用载体。
载体是一种专门设计用于植物遗传转化的DNA分子。
通常，载体由多个组成部分组成，包括启动子、终止子、选择标记和目标基因。
这些组成部分的功能是确保目标基因能够在植物细胞中正确表达。
步骤三：转化载体导入植物细胞一旦构建好转化载体，接下来就需要将其导入到植物细胞中。
目前，有多种方法可以实现这一步骤，包括农杆菌介导转化、基因枪法和电穿孔法等。
这些方法都可以有效地将外源DNA导入植物细胞，使其成为转基因细胞。
步骤四：筛选转基因细胞一旦植物细胞被导入外源DNA，我们需要对其进行筛选，以确定哪些细胞成功地获得了目标基因。
为了实现这一步骤，常常会在转化载体中加入选择标记基因，如抗生素抗性基因。
只有携带了目标基因的细胞才能存活下来，而其他细胞则会被筛选掉。
步骤五：培养和再生转基因植物筛选出的转基因细胞可以通过培养和再生来获得完整的转基因植物。
这一过程通常需要在培养基上进行，通过提供适当的营养物质和激素来促进细胞分裂和分化。
经过一段时间的培养，转基因细胞可以发展成为转基因植物。
步骤六：鉴定转基因植物需要对获得的转基因植物进行鉴定，以确认其是否成功地获得了目标基因。
这一步骤通常需要使用分子生物学技术，如PCR和Southern blot等，来检测目标基因的存在和表达。
只有经过鉴定的转基因植物才能用于进一步的研究或应用。
总结：植物遗传转化是一项复杂的技术，需要经历多个步骤才能成功。
转基因植物的方法转基因植物是指通过人工手段将外源基因导入植物细胞中，使其产生新的性状或改善原有性状的植物。
转基因植物的方法主要包括以下几个步骤：1. 基因克隆基因克隆是指将所需的基因从外源生物中分离出来，并将其插入到载体DNA中。
载体DNA是一种能够自我复制的DNA分子，通常采用的载体有质粒、噬菌体等。
基因克隆的过程需要利用限制性内切酶切割DNA，将所需的基因与载体DNA连接起来，形成重组DNA分子。
2. 转化转化是指将重组DNA分子导入植物细胞中，使其成为植物细胞的一部分。
转化的方法有多种，包括农杆菌介导转化、基因枪法等。
其中，农杆菌介导转化是最常用的方法。
农杆菌是一种能够感染植物的细菌，通过将重组DNA分子导入农杆菌中，再将农杆菌接种到植物体内，使其将重组DNA分子导入植物细胞中。
3. 选择选择是指通过筛选，将转化成功的植物细胞筛选出来。
为了使转化成功率更高，通常会在重组DNA分子中加入一些标记基因，如抗生素抗性基因等。
在转化后，将植物细胞培养在含有抗生素的培养基上，只有转化成功的细胞才能够生长下去，从而筛选出转化成功的植物细胞。
4. 培育培育是指将转化成功的植物细胞培养成完整的植物。
在培育过程中，需要对植物进行筛选和鉴定，以确保其具有所需的性状。
同时，还需要对植物进行基因检测，以确保其基因组稳定性和安全性。
转基因植物的方法虽然可以为人类提供更多的食品和药品，但也存在一定的风险。
因此，在进行转基因植物研究和开发时，需要严格遵守相关法律法规，确保其安全性和可控性。
同时，还需要加强对转基因植物的监管和管理，以保障公众的健康和安全。
转基因植物的检测与鉴定宫雪超于丽杰高金秋哈尔滨师范大学环境与生命科学院黑龙江哈尔滨摘要对植物转基因过程中报告基因的种类和应用范围转基因植物的检测和鉴定方法转基因植物检测和鉴定方法的评价进行了综述关键词转基因植物检测鉴定评价中图分类法文献标识码文章编号植物转基因实验因受体系统的限制外源基因的转化频率较低为了达到转化目的必然要获得大量的转化材料如何在数以千万计的转化植株或细胞中快速有效地检测出转基因阳性植株或细胞外源基因是否整合到植物染色体上整合的方式如何整合到染色体上的外源基因是否正确表达等问题就成为重要的研究课题根据外源基因表达的不同水平对外源基因的检测和鉴定可以分为三个水平进行整合水平转录水平和翻译水平本文从外源基因表达的不同水平阐述转基因植物的检测与鉴定外源基因整合水平的鉴定检测外源基因是否转化成功首先是对报告基因进行检测必要时再进行目的基因的检测检测目的基因需要采用分子杂交方法报告基因报告基因必须具有两大特点一是表达产物和产物的类似功能在未转化的植物细胞内并不存在二是便于检测目前植物基因工程中使用的报告基因一般是编码酶的基因大致分为两类抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因现在常用的报告基因主要有基因基因冠瘿碱合成酶基因H基因基因基因荧光素酶基因二氢叶酸还原酶基因等近年来绿色荧光蛋白基因作为一种新型的报告基因在植物基因转化及基因表达调控中得到应用并显示出较其他几个报告基因更大的优越性基因的检测基因具有以下优点①适用于各种生物的基因转化②检测方法简便无需底物酶辅因子等物质只要有紫外光或蓝光照射其表达产物就可以发出绿色荧光这对转化细胞的检测极为有利③便于活体检测十分有利于活体内基因表达调控的研究④检测时可获得直观信息有利于转基因植物安全性问题的研究及防范若此报告基因通过自然杂交扩散到其他栽培植物或杂草中时很容易通过光照获得直观信息基因的检测基因也是广泛用作转基因植物细菌和真菌的报告基因尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化试验中基因应用的最多基因端与其他结构形成的融合基因能正常表达所产生的融合蛋白仍具有活性这为研究外源基因表达的具体细胞部位及组织部位提供了条件这是它的一大优点但是需要注意的是有一些植物在胚胎状态时能产生内源活性在转基因和代的子叶花粉和胚珠中检测到活性随着组织的成熟衰老表达逐渐停止在实验过程中要设定严格的阴性对照活性的检测方法有很多包括组织化学法色谱法荧光法等其中植物切片组织化学定位分析是分辨组织中不同细胞个体和不同的细胞类型基因表达差异的一种有效方法转基因植株的检测聚合酶链式反应是首选的转基因产品检测方法技术能够有效地扩增低拷贝的靶片段可以检测到每克样品含有～的转化基因成分对转基因产品大分子量检测的灵敏度可以达到样品含量的因为的高度特异性及检测所需的模板量仅为以内所以为外源基因整合的检测提供了便利条件尤其是在转化材料少又需及早检测的时候现在已经利用该技术对欧美杨番茄辣椒葡萄豆瓣菜小麦等转基因植物进行鉴定是转基因植物鉴定中最简单最常用的方法检测具有用量少操作简单成本低耗时少不需要同位素等优点但检测也存在缺点由于扩增十分灵敏有时会出现假阳性扩增因此检测只能作为初步结果杂交证明外源基因在植物染色体上整合情况的最可靠方法是杂交只有经过分子杂交鉴定为阳性的植株才可以称为转基因植物年第期牡丹江师范学院学报自然科学版总第期收稿日期利用杂交~可以确定外源基因在植物中的组织结构和整合位置~拷贝数以及转基因植株世代外源基因的稳定性]分子杂交是进行核酸序列分析~重组子鉴定及检测外源基因整合表达的强有力手段~它具有灵敏性高~特异性强的特点~是当前鉴定外源基因整合及表达的权威方法杂交可以清除操作过程中的污染以及转化愈伤组织中质粒残留所引起的假阳性信号~准确度高~但杂交程序复杂~成本高~且对实验技术条件要求较高根据杂交时所用的方法~核酸分子杂交又可分为印迹杂交<>~斑点<>杂交或狭缝<>杂交和细胞原位<>杂交等现在已在水稻]~玉米~大白菜]~豆瓣菜]~马铃薯~杏~烟草等植物中得到广泛应用外源基因转录水平的鉴定转录水平上的检测方法主要就是杂交~它以和探针杂交的技术检测基因在转录水平上的表达杂交杂交和杂交相比~更接近性状表现~更具有现实意义~被广泛用于转基因植物的检测~]~现已用于杨树~豆瓣菜~马铃薯~草莓~烟草等转基因植物的检测中但提取条件严格~在材料内含量不如高~不适于大批量样品的检测检测<>也是检测外源在植物体内转录表达的一种方法如果从细胞总提取物中得到特异的扩增条带~则表明外源基因实现了转录此法简单~快速~但对外源基因转录的最后决定~还需与杂交的实验结果结合外源基因表达蛋白的检测外源基因编码的蛋白在转基因植物中能够正常表达并表现出应有的功能是植物基因工程的最终目的杂交杂交是集蛋白质电泳~印迹和免疫测定为一体的检测方法它具有很高的灵敏性~可以从植物细胞总蛋白中检出的特异蛋白质~若是提纯的蛋白质~可检出～杂交检测目的基因在翻译水平的表达结果~可得知被检植物细胞内目的蛋白是否表达~表达的浓度大小及大致的分子量能直接显示目的基因在转化体中是否经过转录~翻译最终合成蛋白而影响植株的性状表现一般来讲~杂交的结果与性状表现有直接关系~]检测<酶联免疫吸附法>是一种利用免疫学原理检测抗原~抗体的技术由于酶的放大作用~使测定的灵敏度极高~可检测出的目的物~同时酶反应还具有很强的特异性除了可溶性抗原<抗体>之外~还可以检测含表面抗原的细胞该方法已用于辣椒~水稻~烟草~番茄~]等转化植株的鉴定工作中的检测虽然很灵敏~但容易出现本底过高的问题~应予以充分的注意蛋白检测试纸蛋白检测试纸是一种基于的改进方法或者~用于转基因植物表达量的检测]先将特异性抗体吸附在膜上~将膜蘸入样品溶液~蛋白质随着液相扩散~遇到抗体~发生抗原抗体反应~通过阴性对照筛选阳性结果~给出转基因成分含量的大致范围此方法操作简单~费用低~耗时少<～>原位杂交检测原位杂交技术目前在植物基因工程研究中已成为外源基因在染色体上整合定位及在组织细胞内表达定位的主要方法原位杂交技术主要有同位素原位杂交和荧光原位杂交<>~使用放射性同位素标记~放射自显影检出该方法灵敏性强~对于单拷贝的序列检出非常有效原位杂交可以分为三个层次:①染色体原位杂交~可以确定外源基因在染色体上的整合位置及整合方式~还可以研究外源基因的整合方式对外源基因遗传稳定性~外源基因表达的影响~以及不同的转化方式与外源基因整合方式的关系等重大机理问题;②组织细胞原位杂交~对特定的基因表达的进行组织细胞分布的空间定位~获得外源基因在植物组织细胞内表达情况<是否表达~表达位置~表达量等>;③外源基因表达蛋白的组织细胞免疫定位~指利用外源基因表达蛋白的抗体~通过免疫反应确定表达蛋白在转基因植物组织及细胞中的分布该方法也是研究转基因植物中外源基因功能~外源蛋白稳定性及功能蛋白含量的重要手段检测方法的评估用提取方法对目的基因进行检测方法简便~适合大批量样品的分析~又能检测目的基因的完整性~是早期检测的较好方法]~~杂交分别从整合~转录~翻译水平检测外源基因~是检测外源基因最经典~最可靠的方法虽然现在出现了一些像~等功能类似~方便快捷的检测技术~然而由于其技术本身的原因~还不能取代以上技术在转基因植物检测和鉴年第期牡丹江师范学院学报!自然科学版"# !总第期"定上的权威地位随着科学技术的发展 各种新的检测方法也在不断涌现 例如生物传感器筛选法 远红外线光谱法 定量 实时基因芯片等 每种检测方法都有其自身的优点和不足 应该根据不同的检测目的和要求 选择合适的方法 在实际工作中把几种方法结合运用 可获得外源基因不同表达水平的信息 是准确检测转基因植物产品的合理策略参考文献王学聘 卞祖娴 张晋华 等 欧美杨转基因植物的 检测 林业科学 朱新产 导入外源 对小麦基因表达的影响 西北植物学报 刘建强 孙仲序 赵春芝 转基因植物鉴定方法的研究概况 山东林业科技 李乃坚 袁四清 卡那霉素胁迫对转基因烟草种子发芽的影响 广东农业学报毛慧珠 唐惕 曹湘玲 等 抗虫转基因甘蓝及其后代的研究 中国科学 辑编辑 琳莉收稿日期 基金项目 黑龙江发展高新技术产业专项资金无基质喷雾栽培法生产脱毒小薯的研究于洪涛黑龙江省农业科学院绥化研究所 黑龙江绥化摘要 研究了无基质喷雾栽培法生产马铃薯脱毒小薯过程中不同品种 不同苗来源及不同收获方式对块茎产量的影响 结果表明 无基质喷雾栽培法生产马铃薯小薯以扦插苗分期收获效果最佳 无基质喷雾栽培比较适合栽培早熟品种以早大白最佳 关键词 无基质 马铃薯 脱毒小薯 中图分类法 文献标识码 文章编号在马铃薯良种繁育体系中 原种的生产是关键环节 其质量的高低和数量的多少直接影响马铃薯的生产 无基质喷雾栽培法是一种极有前途的核心种薯生产方法 其主要技术是将适于马铃薯不同发育时期的营养液适时适量地喷于保持在黑暗状态下的马铃薯植株根际 使马铃薯根际获得充分的养分 促进马铃薯块茎的生长 马铃薯喷雾栽培技术在我国尚属起步阶段 提高其生产效率是生产实践中亟待解决的问题 为此 本试验对无基质喷雾栽培法生产马铃薯脱毒小薯过程中不年第 期牡丹江师范学院学报 自然科学版总第 期转基因植物的检测与鉴定作者：宫雪超， 于丽杰， 高金秋， GONG Xuechao， YU Lijie， GAO Jinqiu作者单位：哈尔滨师范大学环境与生命科学院,黑龙江,哈尔滨,150025刊名：牡丹江师范学院学报（自然科学版）英文刊名：JOURNAL OF MUDANJING TEACHERS' COLLEGE(NATURAL SCIENCES EDITION)年，卷(期)：2007(1)被引用次数：3次1.Datta S K;A Petew 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转基因植物的分子检测与鉴定方法及进展随着分子生物学和植物基因工程的不断发展，越来越多的育种工作者开始利用转基因技术获得常规育种技术难以得到的新种质和新品种。
植物转基因技术最大的好处在于可以打破自然界物种间原有的生殖隔离，促进基因在不同物种间的交流，极大地丰富变异类型，增大遗传多样性，为植物新品种的培育提供丰富的育种资源。
通过对基因功能的研究，筛选m目的基因，还可实现植物性状的定向改良。
因此该技术自1983年首次获得转基因植物以来，便深受育种工作者青睐，得到了蓬勃地发展。
至今已有30多科约200多种植物转基因成功；国际上相继有30多个国家批准3 000多例转基因植物进入田间试验，并且在美国、加拿大、中国等20多个国家成功进行了商品化生产…。
到2006年止，全球转基因作物的商业种植面积达1．02亿hm2，比2005年增长13％，是1996年的62倍。
转基因作物品种在农业生产中日益显现出巨大潜力。
植物转基因操作中，除利用抗生素抗性和除草剂抗性等选择基因排除非转化细胞而留存转化细胞，以及利用Gus和CFP等报告基因显示转基因成功外，更重要的是从分子水平鉴别出阳性转化体，明确目的基因在转基因植株中的拷贝数和转录与表达情况。
本文就常用的转基因植株检测与鉴定方法作一概述，并对近期发展起来的新方法做简要介绍。
1 外源基因整合与否及其整合拷贝数的鉴定1．1 PCR(p01 ymera se chain reaction)检测1．1．1 常规PCRPCR技术对目的片段的快速扩增实际上是一种在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下利用DNA聚合酶的酶促反应，通过3个温度依赖性步骤(即变性、退火和延伸)完成的反复循环。
经PCR扩增所得目的片段的特异性取决于引物与模板DNA间结合的特异性。
根据外源基因序列设计出一对引物，通过PCR反应便可特异性地扩增出转化植株基因组内外源基因的片段，而非转化植株不被扩增，从而筛选出可能被转化的植株。
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定Company number：【WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998】植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定〖实验目的〗1．了解创建烟草突变体库的方法；2．理解每种方法的基本原理；3．掌握农杆菌介导的转基因方法以及转基因产物筛选和鉴定的基本过程。
〖实验原理〗随着越来越多植物的全基因组测序工作的完成，在此基础上开展功能基因组的研究是目前的核心研究内容之一。
植物插入突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容，在此基础上也能进行正向遗传学及反向遗传学的研究。
在创制突变体的策略上，传统方法是使用物理或化学诱变方法获得，其优点是可在尽可能短的时间内获得饱和突变体。
与传统的物理和化学诱变方法相比，生物诱变(T-DNA和转座子插人诱变)通常可标记突变基因，从而较为容易地分离鉴定靶基因。
最近数年，通过农杆菌介导的T-DNA插入突变已成为国际公认的植物功能基因组学的主要研究方法之一。
烟草是植物基因组研究的一种模式植物，其突变体库的创建是烟草功能基因组学研究中的重要内容，其目的是通过大规模的突变体库平台快速全方位的了解基因组中各个基因的功能。
突变体的创制是遗传学研究的基础，也是分离基因和基因功能鉴定的最要途径。
通过诱导培养，使烟草产生愈伤组织，利用土壤农杆菌感染愈伤组织，实现T-DNA标签在烟草愈伤组织基因组中大量随机插人，利用植物细胞的全能性，经过抗性筛选，诱导分化，从抗性愈伤组织获得烟草突变体再生植株，获得各突变体的纯合材料，从而建立烟草突变体的数据库，然后分析突变性状与T-DNA的共分离关系，存在共分离的材料用适当的Tail-PCR克隆技术获得T-DNA的侧翼基因组序列，用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析（图实验4-1）。
T-DNA 载体构建转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子筛选T2，获突变子，应为3:1分离确定T-DNA与突变型共分离的个体产生纯合后代克隆T-DNA两侧的植物DNA（Tail PCR)利用侧翼DNA序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因基因功能的验证（遗传互补测验，分离的野生基因转化突变体，回复功能）图实验4-1 T-DNA标签克隆基因的基本流程TAIL-PCR分离法是利用多个嵌套的T-DNA插入序列特异性引物（根据T-DNA中靠近右边界处的核苷酸序列设计的引物，Tm值57-62℃和一个短的随机简并引物（AD，Tm值44-46℃）组合，以突变体基因组DNA为模板，进行多次PCR反应，采取高温特异性扩增与低温随机扩增相间进行的方法，最后获得T-DNA插入侧翼区特异性扩增片段（实验图4-2），可作为探针，筛选分离基因。
TAIL-PCR分离法可以降低非侧翼区特异产物的背景，同时它可以产生2个以上嵌套的目的片段，与其它方法相比TAIL-PCR方法具有简便、特异、高效、快速和灵敏等特点，已经在拟南芥和水稻等植物中获得了成功及广泛的应用。
实验图4-2 TAIL-PCR反应流程图本实验用含T-DNA载体质粒pCAMBIA1301的LBA4404农杆菌菌株转染烟草愈伤组织，让T-DNA随机插入烟草的基因组中形成T-DNA突变体，通过PCR特异扩增HPT基因片段来鉴定转基因烟草，以TAIL-PCR法获得转基因烟草突变体的侧翼基因片段，测序后将获得侧翼基因片段的序列与GeneBank 中的已知序列对比，获得功能基因的全序列。
〖仪器、材料和试剂〗（一）仪器高速冷冻离心机，PCR仪，超净工作台，恒温摇床，隔水式恒温培养箱，光照培养箱，紫外可见分光光度计，凝胶成象仪或Dark Reader，恒温水浴锅，微孔加热器，电泳仪，水平板电泳槽，天平，酸度计，旋涡混合器。
（二）材料烟草幼苗，含T-DNA载体质粒pMD83rc的LBA4404农杆菌菌株，Ex-taq DNA 聚合酶，DNA 1kb laddeer，GoldView核酸染料。
（三）试剂1. 2×CTAB提取液100mmol/L Tris-HCl2％（w/v）CTABL NaCl40mmol/L b-巯基乙醇20mmol/L EDTA2. TE缓冲液10mmol/L Tris-HCl1mmol/L EDTA3. 50′TAE电极缓冲液 1000mlTris 54g硼酸L EDTA 20ml4. 10％次氯酸钠5. 氯仿：异戊醇(V:V，24：1)6. 70％乙醇7. 溶液I：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L （），10 mmol/L EDTA（）100ml8. 溶液III：60ml 5mol/L乙酸钾，％冰乙酸，无菌水100ml9. 溶液II：分别配制 mol/L NaOH和2％SDS溶液（各30ml），用时1:1混合10. LB液体培养基配制每升培养基，应在950mL去离子水中加入：胰蛋白胨(bacto-typtone) 10g酵母提取物(bacto-yeast extract) 5gNaCl 10g摇动容器直至溶质完全溶解，加入200uL 5mol/L NaOH调节pH至，加入去离子水至总体积为1升，121℃高压灭菌20分钟。
11. MS基本培养基大量元素 mg/L 微量元素 mg/L 有机营养 mg/LNH4NO3 1650 KI 甘氨酸KNO3 1900 H3BO3烟酸CaCl2·2H2O 440 MnSO4·4H2O 盐酸吡哆醇（Vb6）MgSO4·7H2O 370 ZnSO4·7H2O 盐酸硫胺素（Vb1）KH2PO4 170 NaMoO4·2H2O 肌醇 100CoCl2·6H2OCuSO4·5H2OFeSO4·7H2O配制方法母液：大量元素（50×） 400mL硝酸铵 33g；硝酸钾 38g；磷酸二氢钾；七水合硫酸镁；铁元素（100×） 200mL七水合硫酸亚铁；七水合EDTA二钠；有机营养（100×） 200mLGly ；VB1 ；VB6 ；肌醇 2g；烟酸；微量元素（1000×） 200mL碘化钾 166mg；硼酸 1240mg；一水合硫酸锰 3380mg；七水合硫酸锌 1720mg；二水合钼酸钠 44mg；五水合硫酸铜 5mg；六水合氯化钴 5mg；氯化钙（50×） 400mL 氯化钙12. 愈伤组织诱导与分化培养基：MS基本培养基＋ L 6-BA＋L NAA＋ 3%蔗糖＋ %琼脂其中6-BA 取25mg用少量1M NaOH溶解后定容到50mL；NAA取25mg用少量1M NaOH溶解后定容到50mL；2,4-D取50mg用少量1M NaOH溶解后定容到100mL；以上激素母液均为mL13. 筛选培养基：MS基本培养基＋L 6-BA ＋ L NAA＋3%蔗糖＋%琼脂＋100mg/L羧苄青霉素14. 抗生素母液的配制KANA（50mg/mL） 1g KANA溶于20mL蒸馏水；RIF（50mg/mL） RIF溶于少量乙醇再定容至50mL；STR（30mg/mL） STA溶于20mL蒸馏水；羧苄青霉素（100mg/mL） 2g羧苄青霉素溶于20mL蒸馏水。
潮霉素B（50mg/mL）可以直接购买〖实验步骤〗I 烟草外植体的无菌培养和诱导再生1. 烟草叶片预培养：取烟草完全展开的幼叶，用自来水洗净晾干。
在超净工作台中将叶片浸于70％酒精中30秒，然后移入10％的次氯酸钠溶液中5～10分钟（消除外植体表面的微生物）。
无菌水至少洗涤3次（消毒液对外植体有很大伤害，必须清洗干净），每次停留3～5min。
将无菌叶片剪成×大小块或用 6mm打孔器凿成圆盘。
2. 烟草叶片的诱导再生：自行设计MS培养基中的NAA、6-BA植物激素浓度，诱导烟草叶片生根或生芽；将上述处理过的无菌叶片接种在含有不同浓度植物激素的MS固体培养基中，每周定期观察并更换培养基。
II 转基因烟草的培养1. 农杆菌的培养：将含T-DNA载体的农杆菌单菌落接种到20ml LB液体培养基中（Kana 50ug/ml、RIF、STR）， 27℃，180r／min振摇培养过夜。
将2ml 菌液转入20ml LB液体培养基中，与上述的相同条件培养6小时左右，使菌液达到OD600＝～，用来侵染烟草叶片。
2. 烟草叶片预培养：取烟草完全展开的幼叶，用自来水洗净晾干。
在超净工作台中将叶片浸于70％酒精中30秒，然后移入10％的次氯酸钠溶液中5～10分钟（消除外植体表面的微生物）。
无菌水至少洗涤3次（消毒液对外植体有很大伤害，必须清洗干净），每次停留3～5min。
将无菌叶片剪成×大小块或用 6mm打孔器凿成圆盘。
3. 愈伤组织转化：在80r/min摇床上旋转浸染5～10分钟。
将叶外植体置于无菌滤纸上吸去多余的菌液（如果叶片粘附细菌过多，可以在无菌水中漂洗1～2次）。
4. 共培养：将侵染过菌液的叶片接种在MS愈伤组织诱导和分化培养基上，在26℃黑暗条件下共培养3天。
5. 筛选培养与分化：将共培养处理的烟草叶片转移到凝固后的筛选培养基上（100ug/L羧苄青霉素和50ug/L潮霉素B，羧苄青霉素起到抑制农杆菌生长的作用。
如果农杆菌生长未被抑制，农杆菌将抑制叶外植体的生长）。
每隔3～4天继代一次，培养条件为，光照2000lx，温度26℃，日照16h。
4周后转基因细胞分裂生长形成大量愈伤组织并有根、芽分化。
接种烟草叶片于无激素的MS培养基上培养，培养条件同上，同时作为对照实验（无愈伤组织生长和器官分化）。
Ⅲ转基因烟草的检测1. 剪取培养后的转化烟草和前期实验未转基因烟草叶片小片，液氮中研磨至粉末状，加入℃预热CATB抽提液65℃水浴抽提30min，间歇混匀；2. 取上清各加入氯仿异戊醇（体积比24:1）去除蛋白，12000rpm离心10min；3. 取上清加入1体积预冷异丙醇至-20℃出沉淀30～60min，8000rpm离心15min；4. 弃上清，70%乙醇洗涤2次干燥，避光保存；5. 加入15μL蒸馏水溶解并电泳检测（%琼脂糖凝胶电泳）；6. 提取pMDC83rc质粒：（1）3-5ml过夜菌12000rpm离心1min，弃上清；（2）加300μL预冷溶液I，颠倒混匀6-8次；（3）加300μl新鲜不预冷溶液II，颠倒混匀6-8次；（4）加300μl预冷溶液III，颠倒混匀6-8次；（5）12000 rpm 15min，转移上清液；（6）加入倍体积的异丙醇，混匀，室温放置3min，如上离心12min；（7）弃上清，70%乙醇洗沉淀；（8）空气干燥，20ml 蒸馏水溶解，-20℃贮存。
7. 对提出的基因组DNA进行PCR扩增；引物和扩增体系同上述的PCR步骤；GFP引物GFP-F: 5’- GCGGCGATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3’，GFP-R: 5’-TTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTG-3’（1）在管中，按照下表配制PCR反应体系（25μL）。
