外植体的选择与培养共32页

由于在消毒后的环境里和物品上没有活着的微生物， 所以通过严格消毒灭菌的操作空间(接种室、超净台、 等)和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何 活着的微生物。在这样的条件下进行的操作，就叫做无 菌操作。
一 常用的灭菌方法 物理方法
化学方法
湿热灭菌(常压或高压蒸煮) 干热灭菌(烘烧和灼烧) 射线处理(紫外线、超声波、微波) 过滤除菌 大量无菌水冲洗
注意：完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气， 灭菌才能彻底。
在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷 空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀 压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有 空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于 饱和蒸汽的温度。
高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的 都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌 彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待 压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空 气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关 阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时或压力 为0.1-0.15MPa，15-20min。
因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理， 再经无菌操作接到培养基上，这一过程叫做接种。
第一步:自来水冲洗
将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔 细洗干净，如用适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大 小，即灭菌容器能放入为宜。
置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，易漂浮或 细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重 时特别有用。洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲 净洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物， 除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。
(3)配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。 如将磷、钙和铁放在最后加入。
(4)注意高压灭菌后培养基pH值的变化及回复动态。如 高压灭菌后的pH值常由5.80升高至6.48。而96h后又 回降至5.8左右。这样在实验中就可以根据这一规律 加以掌握。

第三节 外植体的选择与培养
外植体成苗途径：
愈伤组织
根、芽
A
外植体 B
C
胚状体 芽、根
芽根
试
根芽
管
苗
第三节 外植体的选择与培养
胚状体的产生途径：
(1)、直接从器官上发生 (2)、从愈伤组织发生 (3)、从游离的单细胞发生 (4)、从小孢子发生
诱导胚状体比诱导芽的优点：
(1)数量多 (2)速度快 (3)结构完整
本章小结：
(1) 常用的培养基：①MS培养基；②B5培养基；③ W基。
灭菌剂 次氯酸钙 次氯酸钠
氯化汞 抗菌素
使用浓度(%)
9~10 2
0.1~1 4~50mg/L
持续时间 （min）
5~30 5~30 2~10 30~60
去除的难易
易 易 较难 中
效果
很好 很好 最好 较好
第三节 外植体的选择与培养
三、外植体的接种与培养
（一）接种—无菌操作 定义:把经表面灭菌处理后植物材料，切碎或分
第三节 外植体的选择与培养
培养的环境条件:
温度
光照
培养室 培养条件
氧气
湿度
第三节 外植体的选择与培养
定义：培养物在培养基上生长一段时间以后，由 于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物 的积累，必须转移到新鲜培养基上培养,这个 过程叫做继代培养。
第三节 外植体的选择与培养
四、外植体成苗途径
1、外植体→愈伤组织→根、芽→试管苗 ①同时长芽和根 ②先长芽，再长根 ③先长根，再长芽 2、外植体→胚状体→试管苗（胚状体途径） 3、外植体→根、芽→试管苗（器官发生途径）
四、提高试管苗移栽成活率的途径

第三节 外植体的选择与培养
（二） 外植体培养
外植体培养：指把培养材料放在培养室里，使之 生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化 成再生植株的过程。
第三节 外植体的选择与培养
培养的环境条件:
光照 培养室 培养条件 氧气
温度
湿度
第三节 外植体的选择与培养
定义：培养物在培养基上生长一段时间以后，由 于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物 的积累，必须转移到新鲜培养基上培养,这个 过程叫做继代培养。

第三节 外植体的选择与培养
接种时的无菌操作技术：



(1)对接种材料进行消毒； (2)先解开包口纸，将试管等拿成斜角，使试管口在酒 精火焰上方转动，灼烧数秒钟； (3)用灼烧过的镊子夹取外植体送入试管内，轻轻插入 或放在培养基表面； (4)接种完后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟； (5)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、 走动和咳嗽等； (6)接种工具随时蘸95%酒精灼烧，避免交叉污染； (7)接种完毕后要清理干净并用70%酒精擦工作台。
第1章 植物组织培养实验室 构建及操作技术
第三节 外植体的选择与培养
一、外植体的选择： 种质优良
选材
植株健壮
取材的最适时期
适宜的大小
第三节 外植体的选择与培养
二、外植体灭菌
1：对材料进行预处理 2：材料表面灭菌： 1）水洗,滤纸吸干; 2)70%酒精浸30～60s; 3）用灭菌剂处理; 4）用无菌水冲洗.
较好
第三节 外植体的选择与培养
三、外植体的接种与培养
（一）接种—无菌操作 定义:把经表面灭菌处理后植物材料，切碎或分 离出器官、组织、细胞，再经无菌操作转接到 无菌培养基上，这一过程叫做接种。

• 污染估算：首次接种通常污染 率40—60% 按40%计：接种100个材料 1个材料/容器： 污染量=100X40%=40 获得量=100-40=60。 2个材料/容器： 2污染：1X40%X40%=16% 弃掉 1污染：2X40%X40%=32% 2未污染：60%X60%=36% 污染率=100-36=62% 污染量=100X62%=62 获得量=100-62=48
材料预处理： • 在对外植体进行常规化学灭菌之前，对特殊材料进行特殊预处理，可以收到很好的 效果。例如，在对密披绒毛的枇杷幼果进行灭菌之前，先把绒毛刮去，灭菌效果很 好。对于密披绒毛的叶片，可先连枝带叶放在自来水下冲洗，去除污物后，用0.5 ％Tween20浸1h（其间换新鲜液2～3次），然后进行常规灭菌，就可起到彻底杀菌 的作用。对兰花花芽常规灭菌之前，先用10％的杀藻铵（Benzalkonium Chloride） 溶液浸渍材料10min，效果很好。
第三节 外植体（培养物）的建立
（2）、污染的防止： • 母株保护：保持母株清洁，减少喷 灌。温室种植，喷施杀菌（虫）剂， 减少病原菌含量。 • 材料选择：选取生长发育健壮，病 虫危害少的材料。 • 严格清洗、消毒与无菌操作。 • 小容器、分散接种。
第三节 外植体（培养物）的建立
（3）、污染Biblioteka 算及对策：4、污染（Infection）
能否有效地控制微生物污染是植物离体培养是否成功的关键技术 之一。对于离体培养的探索性研究实验，污染会导致实验失败； 对于大规模的离体繁殖生产来说，污染使生产成本大大增加。 因此，无论是科研机构还是生产厂家都十分重视微生物污染问 题。 植物离体培养中的污染可分为外植体、培养基、无菌操作和培养 环境四个方面。其中培养基和无菌操作方面的污染，目前已得 到十分有效的控制。外植体方面污染最复杂，也最难控制，其 可能是细菌引起的，也可能是真菌引起的；微生物可能是附生 性的，也可能是内生性的。近年来，国外较重视各种微生物的 鉴定，并根据不同的微生物种类采取相应的控制措施，这方面 的研究进展较快。

百合试管苗
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第四节、试管苗驯化与移栽
2、特点：(与常规苗相比）
(1)生长细弱； (2)光合作用差 (3)叶片气孔数目少，活性差 (4)根的吸收功能弱 (5)对逆境的适应和抵抗能力差
小麦试管苗
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第四节、试管苗驯化与移栽
二、炼苗（驯化）
• 驯化的目的： • 通过减肥、增光、降温、控水等措施，提高试
污染
褐变
组织培养三大难题
玻璃化现象
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第三节 外植体的选择与培养
（一）污染
1、污染原因 细菌污染 真菌污染
真菌污染
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第三节 外植体的选择与培养
2、污染的预防措施
(1)减少或防止材料带菌 (2)外植体灭菌要彻底 (3)玻璃器皿和金属器皿的灭菌 (4)布质制品的灭菌 (5)无菌室的消毒 (6)操作人员一定要严格按照无菌操作的程序进 行接种。
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第三节 外植体的选择与培养
（二）、外植体的褐变
1、定义：
是指外植体在培养中体内的多酚氧 化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化 成棕褐色的醌类物质，有时使整个培养 基变褐，从而抑制其他酶的活性，影响 材料的培养。
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第三节 外植体的选择与培养
2、褐变的主要原因
①植物品种 ②生理状态 ③培养基成分 ④培养条件不当
管苗对外界环境条件的适应性，提高光合作用 的能力，提高试管苗的移栽成活率。
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第三节 外植体的选择与培养
3、减轻褐变现象发生的措施
①选择合适的外植体： ②合适的培养条件： ③连续转移 ④加抗氧化剂： ⑤加活性炭

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(7)接种完毕后要清理干净并用70%酒精擦工作台。
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第三节 外植体的选择与培养
（二） 外植体培养
外植体培养：指把培养材料放在培养室里，使之 生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化 成再生植株的过程。
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第三节 外植体的选择与培养
培养的环境条件:
温度
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光照
培养室 培养条件
氧气
湿度
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第三节 外植体的选择与培养
(3)接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，及拖 鞋等；
(4)上工作台后，用酒精棉球擦拭双手。然后70%酒精喷 雾降尘，并擦拭工作台面；
(5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子蘸95% 酒精在酒精灯火焰上灼烧，放置冷却。
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第三节 外植体的选择与培养
接种时的无菌操作技术：
(1)对接种材料进行消毒；
2、玻璃化现象产生的原因
细胞分裂素浓度较高时； 琼脂浓度低时； 温度低、光照时间长时； 气体交换不良时； 培养基中无机离子种类及比例不当时。
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第三节 外植体的选择与培养
3、预防措施：
①适当控制培养基中无机营养成分； ②适当提高培养基中蔗糖和琼脂浓度； ③适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度，增加生
长素量； ④增加自然光照，控制光照时间； ⑤降低培养温度，进行变温培养； ⑥增加容器通风，最好进行CO2施肥。
第1章 植物组织培养实验室 构建及操作技术
第三节 外植体的选择与培养
一、外植体的选择： 种质优良
选材
取材的最适时期
1
植株健壮
适宜的大小
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第三节 外植体的选择与培养
二、外植体灭菌

(1) 常用的培养基：①MS培养基；
无菌培养基上，这一过程叫做接种。 第三节 外植体的选择与培养
(6)接种工具随时蘸95%酒精灼烧，避免交叉污染； (1)在接种前1-2周用甲醛熏蒸接种室； 5、控制好移栽前10天的光、温、湿环境因子 (2)先解开包口纸，将试管等拿成斜角，使试管口在酒精火焰上方转动，灼烧数秒钟； 1、试管苗的生理状况：移栽壮苗 ②合适的培养条件： 第三节 外植体的选择与培养
（一）接种—无菌操作 (4)布质制品的灭菌
(5)无菌室的消毒 (6)操作人员一定要严格按照无菌操作的程序进行接种。
定义:把经表面灭菌处理后植物材料，切碎或分 第三节 外植体的选择与培养
2、植物生长调节物质：适当加入生长素，去除细胞分裂素，有利生根，提高成活率
离出器官、组织、细胞，再经无菌操作转接到 第三节 外植体的选择与培养
第三节 外植体的选择与培养
3、减轻褐变现象发生的措施
①选择合适的外植体： ②合适的培养条件： ③连续转移 ④加抗氧化剂： ⑤加活性炭
第三节 外植体的选择与培养
（三）玻璃化现象
1、定义：在长期的离体培养繁殖时，有些 试管苗的嫩茎、叶片呈现半透明水渍状， 这种现象称为玻璃化。
第三节 外植体的选择与培养
第三节 外植体的选择与培养
外植体成苗途径：
①植物品种
(1)在接种前1-2周用甲醛熏蒸接种室； (1)对接种材料进行消毒； 三、外植体的接种与培养
愈伤组织
根、芽
培 细养胞基分中 裂无 素机 浓离 度子 较种 高类 时及；比例不A当时。
芽根
第四节、试管苗驯化与移栽
(5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子蘸95%酒精在酒精灯火焰上灼烧，放置冷却。
第三节 外植体的选择与培养

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第三节 外植体的选择与培养
（二）、外植体的褐变
1、定义：
是指外植体在培养中体内的多酚氧 化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化 成棕褐色的醌类物质，有时使整个培养 基变褐，从而抑制其他酶的活性，影响 材料的培养。
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第三节 外植体的选择与培养
2、褐变的主要原因
①植物品种 ②生理状态 ③培养基成分 ④培养条件不当
(2)先解开包口纸，将试管等拿成斜角，使试管口在酒 精火焰上方转动，灼烧数秒钟；
(3)用灼烧过的镊子夹取外植体送入试管内，轻轻插入 或放在培养基表面；
(4)接种完后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟；
(5)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、 走动和咳嗽等；
(6)接种工具随时蘸95%酒精灼烧，避免交叉污染；
(5) 筛选培养基方法，即单因子试验法、多因子试验法、 广谱实验法。
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第1章 植物组织培养实验室 构建及操作技术
本章小结：
(6) 植物培养技术：灭菌、接种、培养和驯化四个环节。
(7) 灭菌与消毒的方法。
(8) 接种程序：①植物材料表面的消毒；②切割外植体；③ 将外植体移人培养基。
(9)培养方法：固体培养法和液体培养法。
定义：培养物在培养基上生长一段时间以后，由 于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物 的积累，必须转移到新鲜培养基上培养,这个 过程叫做继代培养。
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第三节 外植体的选择与培养
四、外植体成苗途径
1、外植体→愈伤组织→根、芽→试管苗 ①同时长芽和根 ②先长芽，再长根 ③先长根，再长芽 2、外植体→胚状体→试管苗（胚状体途径） 3、外植体→根、芽→试管苗（器官发生途径）

(2)先解开包口纸，将试管等拿成斜角，使试管口在酒 精火焰上方转动，灼烧数秒钟；
(3)用灼烧过的镊子夹取外植体送入试管内，轻轻插入 或放在培养基表面；
(4)接种完后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟；
(5)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、 走动和咳嗽等；
(6)接种工具随时蘸95%酒精灼烧，避免交叉污染；
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第1章 植物组织培养实验室 构建及操作技术
第四节、试管苗驯化与移栽
草莓
试管苗
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第四节、试管苗驯化与移栽
一、试管苗的特点
1、试管苗的生态环境： 高温且恒温、 高湿、 弱光、 无菌
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第四节、试管苗驯化与移栽
2、特点：(与常规苗相比）
(1)生长细弱； (2)光合作用差 (3)叶片气孔数目少，活性差 (4)根的吸收功能弱 (5)对逆境的适应和抵抗能力差
(3)接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，及拖 鞋等；
(4)上工作台后，用酒精棉球擦拭双手。然后70%酒精喷 雾降尘，并擦拭工作台面；
(5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子蘸95% 酒精在酒精灯火焰上灼烧，放置冷却。
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第三节 外植体的选择与培养
接种时的无菌操作技术：
(1)对接种材料进行消毒；
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第三节 外植体的选择与培养
（二）、外植体的褐变
1、定义：
是指外植体在培养中体内的多酚氧 化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化 成棕褐色的醌类物质，有时使整个培养 基变褐，从而抑制其他酶的活性，影响 材料的培养。
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第三节 外植体的选择与培养
2、褐变的主要原因

(6)接种工具随时蘸95%酒精灼烧，避免交叉污染；
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(7)接种完毕后要清理干净并用70%酒精擦工作台。 完整版课件
第三节 外植体的选择与培养
（二） 外植体培养
外植体培养：指把培养材料放在培养室里，使之 生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化 成再生植株的过程。
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第三节 外植体的选择与培养
除细胞分裂素，有利生根，提高成活率
3、无机盐浓度：适当降低 4、加入少许活性炭 5、控制好移栽前10天的光、温、湿环境因子 6、使试管苗从无菌向有菌逐渐过渡
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第1章 植物组织培养实验室 构建及操作技术
本章小结：
(1) 常用的培养基：①MS培养基；②B5培养基；③ White培养基；④N6培养基；⑤KM-8P培养基。
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第三节 外植体的选择与培养
五、培养过程中常出现的问题 及解决方法
污染
褐变
组织培养三大难题
玻璃化现象
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第三节 外植体的选择与培养
（一）污染
1、污染原因 细菌污染 真菌污染
真菌污染
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第三节 外植体的选择与培养
2、污染的预防措施
(1)减少或防止材料带菌 (2)外植体灭菌要彻底 (3)玻璃器皿和金属器皿的灭菌 (4)布质制品的灭菌 (5)无菌室的消毒 (6)操作人员一定要严格按照无菌操作的程序进 行接种。
(2)接种前15-20min，打开超净工作台的风机以及台上 的紫外灯；
(3)接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，及拖 鞋等；
(4)上工作台后，用酒精棉球擦拭双手。然后70%酒精喷 雾降尘，并擦拭工作台面；