杜仲组织培养的研究摘要:为了筛选出杜仲(Eucommia ulmoides)组织培养的最优培养条件,主要从外植体的选择､基本培养基､植物激素､光照条件､其他理化条件等方面对杜仲愈伤组织的诱导､增殖及分化培养的影响进行了综述,分析了杜仲组织培养过程中常见的问题并提出了解决方案,以期为杜仲快繁体系的建立提供理论依据｡关键词:杜仲(Eucommia ulmoides);组织培养;诱导;增殖;再分化Research on Tissue Culture of Eucommia ulmoidesAbstract: In order to select the optimal culture condition of Eucommia ulmoides tissue culture, induction, proliferation and differentiation conditions for E. ulmoides callus were screened from the the aspects of choice of explants, basic medium, plant hormones, light conditions and other physical and chemical conditions. The solutions of the common problems during the procedure of E. ulmoides Olive tissue culture were analyzed. This article provided a theoretical basis on E. ulmoides rapid propagation system.Key words: Eucommia ulmoides; tissue culture; induction; multiplication; regeneration杜仲(Eucommia ulmoides)系杜仲科杜仲属(Eucommia)植物,为我国特有的经济树种,是一种名贵的药用植物,特别是对血压有双向调节作用,被认为是世界上高效天然降压药物[1]｡杜仲还是一种胶源植物,杜仲胶具有良好的绝缘性､抗酸碱性､热塑性和形状记忆等特点,受到世人的普遍重视[2]｡因此,杜仲作为用材､水土保持､绿化的经济树种,集“一林､一胶､两材､三效益”于一体,应用前景广阔[3]｡由于杜仲是雌雄异株植物,授粉较为困难,种子产量有限,加之自然环境的破坏和长期无计划的采挖,以及扦插繁殖的技术问题还未得到完全解决,使得杜仲的供应十分困难,生产中种苗的数量缺口很大｡组织培养是解决种苗快繁的有效方法之一[4]｡杜仲是组织培养较为困难的一种木本植物｡目前对杜仲愈伤组织的诱导､增殖方面的研究已有一些报道[5]｡本研究在前人工作的基础上,综述了在不同时间采集,以杜仲幼叶､嫩茎及种子无菌苗的下胚轴､子叶､真叶､根为外植体愈伤组织的诱导､增殖､分化及生根的培养基､激素､光照等理化条件,目的在于找出杜仲的愈伤组织诱导､增殖继代､分化及生根的最优培养条件[6],以期为大规模培养生产杜仲及次生代谢产物奠定基础｡1 外植体的选择高等植物几乎所有的器官和组织都可以作为外植体,在合适的时间,选择适宜的苗龄､合适部位的外植体是有效诱导愈伤组织的关键[6]｡同类型的外植体对于诱导产生愈伤组织的难易程度不同,主要是不同的外植体其内源激素是有差别的[7]｡杜仲组织培养多采用植株的幼叶､嫩茎及种子无菌苗的下胚轴､子叶､真叶､根为外植体｡其中,使用频率最高的为茎尖[8]｡1.1 外植体的种类据罗丽等[7]的报道,杜仲各种外植体的诱导出愈能力比为下胚轴>子叶>幼叶,只要培养基中激素配比适宜,杜仲各类外植体均能诱导产生愈伤组织｡另据李琰等[9]报道,以杜仲无菌苗作为外植体不仅出愈率高,愈伤组织生长旺盛,且不受季节影响,其中以下胚轴作外植体时,诱导率和生长状况最佳;以幼叶作为外植体时,污染小,便于消毒,出愈率也高;而对于茎,虽然诱导率高,但诱导出的愈伤组织不利于继代,且污染率高,诱导率有下降趋势｡此外,邱晓芳等[10]用杜仲无菌苗不同组织作为外植体,得出与上胚轴相比子叶更不易产生褐化,较容易进行稳定的继代;子叶和上胚轴均有利于诱导出疏松的愈伤组织,而上胚轴所诱导的愈伤组织质地非常疏松似乎更有利于作细胞悬浮培养｡可见,以胚轴作为外植体不仅诱导率高且不易褐化,愈伤组织生长茂盛稳定,是最优选择｡1.2 外植体大小､接种方式及采样时期在杜仲组织培养过程中,不同接种方式的出愈率明显不同｡李琰等[9]的研究表明,对不同外植体:将真叶､子叶切成0.5 cm×0.5 cm方块,下胚轴和根切成0.7 cm长的段进行接种;将幼茎切成0.7 cm长段,幼叶切成0.5 cm×0.5 cm的方块接种方式为佳｡其中以幼茎为外植体,茎段的大小和接种方式以0.7 cm长度横放方式诱导效果最好｡外植体的采用时期:田间材料幼叶取样时间以3月中旬为好,幼茎的取材时间以4月中旬前为最佳｡2 培养基的选择培养基是植物组织培养的物质基础,也是愈伤组织能否成功的重要因素之一,愈伤组织能否形成,一方面取决于培养基材料本身的性质,另一方面也取决于培养基的种类和成分,因此要根据不同的外植体以及不同的培养目的选择合适的培养基[6]｡杜仲组织培养常用的培养基有MS､B5､LS､White､1/2MS､N6等,其中以MS使用最多,初代培养中占83.3%,继代培养也有66.7%,而66.7%的生根培养基采用的是1/2MS[8]｡2.1 诱导培养基研究表明,B5培养基更有利于松散愈伤组织的形成,更适合作继代或悬浮培养;而MS培养基对子叶及上胚轴愈伤组织的诱导率均为最强,且不易于褐化;相比之下1/2MS培养基诱导的愈伤组织结构致密､生长缓慢､褐化严重,不利于诱导出疏松的愈伤组织[10]｡2.2 增殖培养基关于继代培养的研究,何泼等[11]在MS､B5､LS､White､1/2MS､N6培养基上进行继代培养,结果表明,MS培养基虽然在诱导时效果很好,但它不适于愈伤组织的继代培养,愈伤在接种到该培养基上后生长缓慢,增长率较低,有的接种后不久会褐化死亡;而B5培养基最适合于愈伤组织的继代培养,继代后愈伤组织生长旺盛,增长率最高;此外N6培养基的效果也较好｡但据黄勇等[12]报道,MS培养基更适合于杜仲愈伤组织的继代培养,这可能是由于培养基上所加生长调节物质有所不同,或者与外植体种类也有一定的关系｡另有李琰等[1]以MS､LS､B5､N6､H､Nitsch､White､WPM为基本培养基,进行不同培养基对杜仲嫩茎及幼叶愈伤组织诱导的研究;以MS､LS､B5､N6､H､Nitsch､White､1/2MS为基本培养基,进行不同培养基对杜仲嫩茎及幼叶愈伤组织继代培养的研究｡结果表明,MS培养基有利于杜仲幼茎愈伤组织的诱导,而B5培养基不仅对叶的愈伤组织诱导有利,对茎和叶愈伤组织的继代培养也是最理想的｡3 激素的选择3.1 愈伤组织的诱导和增殖试验表明,没有添加植物激素的培养基上,杜仲愈伤组织继代生长很差,单独使用NAA的生长速度不如NAA与BA配合使用｡BA的最优使用量范围为1.0~3.0 mg/L,NAA的最优使用量范围为0.5~4.0 mg/L｡比较可见,在以MS培养基(0.8%琼脂+3%蔗糖)上附加2.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA有利于杜仲愈伤组织的诱导;以B5培养基(0.8%琼脂+3%蔗糖)上附加1.0 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA,有利于愈伤组织的增殖[11]｡据黄勇等[12]的报道,以杜仲幼茎为外植体,接种于附加NAA､2,4-D､KT､6-BA及其组合的MS培养基上,均能产生愈伤组织,但附加2,4-D的培养基上愈伤组织容易褐化,其他均可正常生长,附加0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+ 1.0 mg/L KT的培养基适合愈伤组织的增殖培养｡3.2 芽的诱导和增殖芽的诱导形成使用的激素有BA､NAA､IBA､BAP､IAA､KT等,BA和NAA 2种激素在从愈伤上诱导芽时通常需要混合使用,BA的最优使用量范围为0.50~2.25 mg/L,NAA的最优使用量范围为0.05~0.50 mg/L[8]｡根据李岩等[5]的报道,在含有0.1 mg/L NAA+ 0.8 mg/L 6-BA的MS培养基中,杜仲胚轴可直接诱导产生不定芽,诱导率达到47%,为较优培养方案｡李琰等[2]以MS为基本培养基,在添加0.05 mg/L NAA+0.5 mg/L BA或者0.1 mg/L IBA+0.5 mg/L BA的培养基中,腋芽的诱导和生长较好;继代增殖培养以0.5 mg/L BA+0.01 mg/L NAA的MS培养基丛芽数量最多,增殖系数最高｡可见,不同浓度的BA和NAA混合使用对芽的诱导与增殖有显著促进作用｡3.3 根的诱导杜仲生根培养所需激素有NAA､IBA､GA等3种激素,以IBA的效果最好,其适合浓度为1.5~2.0 mg/L[8]｡据报道,只用White培养基,不添加激素也可以生根[8]｡李岩等[5]研究表明,在生根培养中,附加1.5 mg/L IBA+20 g/L蔗糖的1/2MS培养基效果最好,生根率达到91.7%｡另有王东良等[4]报道,以1/3MS附加0.1 mg/L KT+0.5 mg/L NAA也有生根现象,生根率18%｡比较可知,采用1/2MS培养基材料的生根率明显高于采用1/3MS培养基材料的生根率,且较低浓度的盐离子有利于根的分化｡4 光照条件光对愈伤组织的生长既有促进作用也有抑制作用,杜仲的愈伤组织培养中,光照条件以12 h光照12 h暗培养最好｡黑暗中和12 h光照条件下愈伤组织的增长量相似,但颜色差异较大｡在生理生化特征和分化能力上这些形态不同的愈伤组织也有很大的差异,其在次生代谢产物的含量方面是否有差异尚需进一步研究[13]｡何泼等[11]分别采取黑暗24 h/d､光照12 h/d､自然光3种不同光照方法进行光照对愈伤组织增长影响的试验,结果表明,3种不同光照方式下愈伤组织的增长率并无太大差异,但光照12 h/d条件下培养的愈伤组织更易做进一步的继代培养,而连续黑暗培养24 h/d时的增长率略低｡另外光照对杜仲愈伤中次生代谢物的积累有明显影响,杨振堂等[14]报道,光照有利于愈伤中杜仲胶的积累,与自然光下相比,杜仲胶的总生产率较高｡另据李琰等[15]的报道,黑暗不影响愈伤组织的生长,但却抑制绿原酸和总黄酮的形成,光照12 h/d对愈伤组织的生长及绿原酸和总黄酮的合成有明显的促进作用｡5 其他理化条件5.1 培养基pH对愈伤组织继代培养的影响培养基的pH可通过影响培养物对营养元素的吸收､呼吸代谢､DNA合成､植物激素进出细胞等直接或间接地影响愈伤组织形成｡培养基的pH因培养材料的来源不同,大多数植物都要求在pH 5.6~5.8的条件下进行培养,但不同的植物其最适pH也不一样｡在杜仲愈伤组织诱导中发现,pH 4.8~6.8的诱导率差异不大,均在90%以上,但对愈伤组织的长势影响差异较大,只有pH 6.3时愈伤组织长势最好,20 d的增长率可达100%,过高或过低都起抑制作用[9]｡5.2 碳源对杜仲愈伤组织继代培养的影响培养基中糖不仅起到碳源的作用,而且还有调节渗透的作用,因而对愈伤组织的生长和次生代谢产物的含量有明显影响｡据李琰等[13]报道,以市售食用白糖､分析纯的蔗糖､葡萄糖作为碳源,3种糖中以分析纯的蔗糖最好,葡萄糖最差｡白糖和蔗糖虽然主要成分都是蔗糖,但纯度不同,白糖效果不如蔗糖,可能是因为白糖中微量杂质如重金属､氯化物等对细胞生长和次生代谢产物的形成都有一定的抑制作用｡高浓度的蔗糖能提高培养基中次生代谢产物的含量,其原因之一是提高了培养基的渗透压｡在10~40 g/L蔗糖浓度范围内,愈伤组织的增长量和次生物质的积累随蔗糖浓度的升高而增加,在40 g/L时愈伤组织增长量和黄酮含量达到最大值;蔗糖浓度50 g/L时,愈伤组织的生长受到抑制,黄酮含量和产量也下降,但绿原酸的含量和产量仍在提高[15]｡6 杜仲组织培养及植株再生存在的问题6.1 初代的污染杜仲组织培养在使用茎尖和带芽茎段进行初代培养时污染率很高｡据罗丽等[16]报道,以4､5月份取材萌发率高,污染小｡外植体最佳表面消毒方法为:3%H2O2浸泡20 min后,0.1% HgCl2 +数滴Tween80浸泡10 min｡培养基附加链霉素8万单位/L+山梨酸钾50 mg/L抑制微生物生长｡在培养10~15 d受到污染时可浸泡于8万单位/L链霉素10min或0.1% HgCl2 5 min除菌｡前10 d没有出现污染,10~15 d 时微生物污染发生率在20%以下｡6.2 诱导芽困难目前获得成功的杜仲组织培养,大多以器官直接发生途径获得无菌芽,这虽然在一定程度上提高了组织培养效率,但增殖率仍然很低,一般为3~5个,无法达到产业化生产的标准｡在杜仲组织培养中相比较根的诱导,芽的诱导相对较低,如何克服这一关键问题,是目前杜仲组织培养应用于生产上亟待解决的问题之一[8]｡6.3 继代培养中的褐化现象在植物细胞培养特别是木本植物细胞培养中,愈伤组织在继代培养中容易产生褐化,导致难以获得生长旺盛､目的次生代谢产物含量高的细胞株于杜仲本身的生物学特性,导致杜仲组织培养过程中极易发生褐变现象,轻者影响细胞生长和繁殖,重者导致细胞死亡｡据邱晓芳等[17]的研究报道,以B5培养基0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA是杜仲愈伤组织继代培养和褐化控制的适合培养基;另外,培养基中添加0.5%活性炭(AC)能有效地抑制杜仲愈伤组织的褐化;在光照条件方面,与中强光和红光相比,蓝光和黑暗能减轻组织的褐化｡参考文献:[1] 李琰,姜在民,唐锐. 杜仲叶片愈伤组织诱导的激素优化研究[J]. 植物研究,2006,26(2):182-186.[2] 李琰,张靖,辛转霞,等. 杜仲组培快繁的研究[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版),2004,32(6):79-82.[3] 李俊红,张焕玲,李周岐. 杜仲组织培养再生体系的优化[J]. 西北林学院学报,2008,23(4):97-100.[4] 王东良,丁兰,魏昊进. 杜仲组织离体培养研究[J]. 西北师范大学学报(自然科学版),2004,40(1):64-66.[5] 李岩,罗丽,赵德刚. 杜仲胚轴､子叶直接诱导不定芽及再生体系的建立[J]. 中草药,2007,38(1):101-105.[6] 王慧英. 影响植物愈伤组织形成的因素研究[J]. 聊城大学学报(自然科学版),2010,23(2):51-53.[7] 罗丽,赵德刚. 杜仲愈伤组织诱导与继代培养研究[J]. 安徽农业科学,2009,37(7):2861-2863,3019.[8] 唐亮,金晓玲. 杜仲组织培养的研究进展[J]. 贵州农业科学,2010,38(3):15-18.[9] 李琰,张朝红,崔宏安,等. 杜仲愈伤组织诱导的研究[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版),2003,31(5):153-156.[10] 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