实验愈伤组织的继代与分化培养

2、操作程序
获取外植体材料－消毒处理－修整除去 坏死组织－切成5mm的圆柱形或方形小块－ 直放或倒放到培养基上－每9cm培养基接种5 －6块外植体－培养。 选用较大组织做材料时，可用打孔器 从块茎和块根中钻取一批圆柱型组织，切 成相同厚度的小圆片进行培养。
采用圆形的原因：
能得到外形简单结构相同的材料
第一节 愈伤组织的培养
愈伤组织培养是指将母体植株上的各个 部分切下，形成外植体，接种到无菌的培养 基上，进行愈伤组织诱导、生长和发育的一 门技术。 一般情况下，植物组织均能诱发形成愈 伤组织，由外植体形成愈伤组织，标志着植 物离体培养的开始。
一、愈伤组织的诱导 （一）诱导原理 1、细胞全能性 植物每一细胞具有全套遗传信息，在 特定环境下能进行表达，而产生一个独立 完整的个体。
（二）在园艺植物育种中的应用： 1、加快园艺植物新品种和良种繁育速度， 迅速高效低成本 2、培养无病毒苗木 3、获得倍性不同植株，易染色体核内加 倍育种有利用价值 4、克服远缘杂交困难 5、利于种质资源长期保存 6、提供育种中间材料 7、诱发和离体筛选突变体 8、制造人工种子
植物离体培养中的器官发生类型： 不定芽型—诱导顶端分生组织产生不定 芽，再生成植株的方式。顶芽、腋芽培养。 多数植物培养采用。
圆形的表面积大
圆柱形的外植体有利于组织块与外界进 行物质和气体交换；也使外植体表面促进愈 伤组织形成的分泌物较多，诱导率增高。
培养基
MS培养基 激素 IAA、NAA、2,4-D、BA 椰子汁、番茄汁、酵母提取物。
二、愈伤组织细胞的分化
单个细胞或一块外植体形成典型的愈伤 组织，大致经历三个时期，这三个时期中细 胞代谢、细胞数目、细胞形态均有明显差别。
细胞分化——持续细胞分裂增殖——原胚期— —球形胚——心形胚——鱼雷形胚——子叶期

草莓茎尖愈伤组织的诱导与增殖培养实验报告册1、培养程序和培养基5--6月于晴天的下午在健壮、无病的草莓刚抽出的匍匐茎上取茎尖，大小为0.3--0.4mm，作为组织培养的外植体。

用于草莓茎尖培养诱导芽分化的基本培养基为MS，附加6-BA 0.5mg/L，NAA 0.2mg/L，蔗糖30g/L，琼脂粉6.5g/L，pH 值调至5.8--6.0。

在草莓茎尖的扩大繁殖阶段，采用MS 培养基附加6-BA 0.5mg/L 、NAA0.01mg/L。

扩大繁殖主要是将丛生苗分块即每5--7株切成一块，转入继代培养基。

在转苗过程中，去掉原生叶片有利于新苗分化，在扩大繁殖中随时清除愈伤组织，有利于新苗增殖和生长。

诱导生根培养基用1/2MS 附加。

经查文献得知0.1mg/L浓度的IBA处理的生根率最高，为100%，平均根条数为2.4条。

不加TBA及IBA浓度超过0.2mg/L，多数苗都是先于苗基切口处产生愈伤组织，随后在愈伤组织上分化生根，致使成活率大大降低。

2、操作技术要点及培养条件⑴)灭菌与接种预处理―为了灭菌彻底，常把接种材料先进行湿润处理，采用的是75%的酒精，湿润的时间为半分钟至1分钟。

灭菌处理在草莓组织培养中常用灭菌剂的种类很多。

我们曾用过次氯酸钠10%水溶液(含有效氯0.4--0.5%)，浸泡接种材料10--15分钟;次氯酸钙(漂白粉)，用其饱和上清液，浸泡接种材料15--30分钟;过氧化氢10--12%水溶液浸泡10--20 分钟;新洁尔灭5--10%水溶液，浸泡10--15分钟;升汞0. 1%水溶液，浸泡8--10分钟。

其中前4种灭菌剂对接种材料比较安全，但因灭菌时间较长，常常使接种材料的外层氧化变褐，以致影响培养效果。

升汞有很强的杀菌能力，但浸泡时间稍长会造成接种材料中毒。

因此，在草莓组织培养中，如把握好时间，升汞是应用较多的灭菌剂。

灭菌后的接种材料，要用无菌水充分清洗，通常要换水 3--5次。

接种以培养无病毒苗为主要目的的草莓组织培养，所接种的茎尖材料很小，在接种时首先要求准确熟练地剥取茎尖生长点，并使用固体培养基比较适宜，接种时应注意不能将整个茎尖埋入培养基中。

一 、 Definition of callus
Callus consists of an amorphous (无 定形) mass of loosely arranged thinwalled (parenchyma 薄壁) cells
Wound callus on the stem of an Erythrina tree 刺桐树
等。这样才能得到足够数量的、无菌的、一致的、 适合于培养的外植体。
具体的操作过程： 无菌的块茎或块根，用钻孔器钻出一批同一类薄 壁组织圆柱形的组织，平行排列好。多把刀片等 距离地固定在一组金属片之间，一次切下去得到
许多个长短一致的圆柱形的外植体。
圆柱形大量地、准确地得到外形相同的外植体。 圆柱体的表面积大，利于组织块和外界气体和营 养物的交换。 外植体的损伤表面分泌物，具有促进愈伤组织形
1/0.25%=400支，即接种800块材料，能得2块无菌材
料。 若按3块/支接种，需做8000支试管培养基，接入2.4万块 材料，才能有1支试管的（得3块）无菌材料。
六、外植体的褐变及其防止措施
褐变
• 褐变是指外植体在培养过程中体内的 多酚氧化酶被激后活，使细胞内的酚类 物质氧化成棕褐色醌类物质，这种致死 性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐 渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活 性，严重影响外植体的脱分化和器官分 化，最后变褐而死亡的现象
三、激素对愈伤组织分化的影响
植物生长调节物质在分化过程中的作用是极为 明显的，合适的植物生长物质配比在器官分化 中起着重要的作用。 如仙人掌科的金牛掌茎段培养中，当6-BA加倍 时，茎段的愈伤组织可以再分化出仔球，而6BA浓度过高(150倍)或过低(10倍)则无仔球形成。
器官分化的植物激素控制理论

实验
实验七七愈伤组织的继代培养
【目的要求】：1、掌握愈伤组织的继代培养方法
2、学习接种操作技术规范。

【实验内容】：1、70%乙醇喷洒净化工作台并擦洗干净，将接种所用的工具等放入工作台。

打开紫外灯，15分钟后关闭紫外灯开始方可操作。

打开风机吹风15分钟，
备用。

2、挑选生长旺盛的苜蓿愈伤组织（此类愈伤组织多呈白色或淡黄色，有光泽），
将其分割成直径约为0.5cm的小块。

3、将分割好的愈伤组织小块接种到新鲜的原培养基上，摆放均匀
4、培养：将培养瓶用封口纸包好，用记号笔写上姓名和接种日期,放在培养
室内25±2℃条件下暗培养。

【实验结果】：观察愈伤组织在继代培养基上的生长情况。

思考题：1．为什么要进行继代培养？
2．在进行愈伤组织继代培养中应注意的问题是什么？。

⑶先芽后根： 愈伤组织中产生多个分生细胞形成分生中心，从中仅分化出芽，一般情况下待芽 长到一定大小时，切下移入生根培养基中，在其基部即可分化出根。有些植物在分 化芽的培养基上同时在芽器官基部分化出根，形成完整的植株。大多数植物均属这 类正常的分化途径，这类苗移栽较易成活。 ⑷先根后芽： 有些植物外植体脱分化后在愈伤组织上先分化出根，而后在靠近愈伤组织的根部 上再分化出芽，有的将根切下放入分化培养基，再于根上分化出芽器官，甚至在根 端也能分化出芽。
长素降低些，尤其是使用2，4-D时。 一般地，经过继代培养的愈伤组织在稳定生长1～2代后，具有S型生长曲线。开 始一周生长缓慢，中间3周生长很快，4周以后生长又变迟缓。
第二节 悬浮培养
悬浮培养:一般是把一些小块生长旺盛的愈伤组织
放入液体培养基中，进行振荡培养，从而使愈伤 组织块变成良好分散性的细胞和小的细胞聚集体。 愈伤组织通过悬浮培养能产生大量的比较均一 的细胞，而且细胞增殖速度快，适宜进行大规模
（1）三角烧瓶容纳的培养基占总容积的20%～30%，培养基含量可随培养物量的减 少而减少； （2）转速一般为80～100 r/min； （3）细胞或愈伤组织的生长呈典型的S型曲线，即延滞期（lag phase），对数生长 期（log phase），然后逐渐减慢，直至停止。
3、愈伤组织的生长特性
一般情况下，25℃下培养的愈伤组织需要每4~6周继代一次。大多数研究工作表
官。可以把愈伤组织分化出芽、根器官概括为以下几种方式：
⑴单极分化： 愈伤组织中的分生中心在刺激物质的影响下向着一极分化，形成有根无芽或 者有芽无根的现象。 ⑵双极分化： 愈伤组织中随着细胞分裂出现两个或两个以上分生中心，其中有的分化芽， 有的分化根，根芽之间并无输导等组织沟通，在培养瓶内靠愈伤组织提供养料， 这种以愈伤组织隔离着的芽和根的苗，常常不能移栽成活。

第三节愈伤组织的形态发生
一、不定芽方式（adventitious bud）
外植体 脱分化 愈伤组织 高生长素(1,2-D)
再分化
芽
低(生长素/细胞分裂素)
高(生长素/细胞分裂素)
根
再生植株
第三节愈伤组织的形态发生
愈伤组织的器官发生顺序有四种情况：
（ 1）愈伤组织仅有根或芽器官的分别形成，即 无根的芽或无芽的根； （2）先长芽，后长根，多数情况； （ 3）先长根，再从根的基部长芽。这种情况较 难诱导芽的形成，尤其对于单子叶植物； （ 4）先在愈伤组织的邻近不同部位分别形成芽 和根，然后两者结合起来形成一株植株。
从外表均一的外植体长出的愈伤组织，在开始阶 段是相当一致的，而从茎、根等器官切段上长出 的则是一个混杂的愈伤组织。
不同颜色的愈伤
第二节 愈伤组织的继代培养
1、定义：培养物在培养基上生长一段时间以后， 由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产 物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养,这 个过程叫做继代培养。
第二节愈伤组织的继代培养
2、愈伤组织培养的调控因素：
外植体 培养基 培养环境
第二节愈伤组织的继代培养
（一）材料本身
Photo indicating where the callus (c) arises from
第一节愈伤组织的诱导和分化
Wound callus on the stem of an Erythrina tree 刺桐树
二．愈伤组织的分化
• 从外植体脱分化形成 典型的愈伤组织大致 愈伤组织分化 可分为三个时期： 诱导期 分裂期 分化期
附：第五节 组织培养成苗
指把外植体放在培养室（有光照、 温度条件）里，成再生植株的过程。 外植体：1、带芽外植体

及时继代
愈伤组织在培养过程中会逐渐老化， 为保证实验的准确性，应及时进行继 代培养。
03
实验结果与分析
实验结果
实验观察记录
在继代培养过程中，胡萝卜愈伤组织表现出良好的生长状态，细 胞分裂活跃，质地松软，颜色鲜艳。
显微镜观察
通过显微镜观察，发现细胞分裂旺盛，细胞排列紧密，呈现出典型 的愈伤组织结构。
在未来的实验中，我们可以尝试优化 培养条件，如温度、光照、湿度等， 以提高愈伤组织的生长速度和质量。
此外，我们还可以进一步研究愈伤组织在继 代培养过程中的基因表达和分子机制，为植 物组织培养和基因工程领域的发展做出贡献 。
我们可以通过添加植物激素或其他生 长因子来调节愈伤组织的生长和分化， 以实现更好的实验效果。
2. 制备培养基
按照MS培养基配方，添加适量的植物生长调节剂和糖， 搅拌均匀后倒入培养容器中，待培养基凝固。
3. 接种外植体
将准备好的外植体放置在培养基上，确保外植体与培养 基接触良好。
4. 培养条件
将培养容器放置在恒温、恒湿、无菌的环境中，保持适 宜的温度和光照条件。
5. 继代培养
经过一段时间的培养后，观察愈伤组织的生长情况，当 愈伤组织长满培养基时，将其切割成小块，重新接种到 新的培养基上，进行继代培养。
薄壁细胞团。
通过将愈伤组织进行继代培养， 可以保持其生长和分化能力，并 对其进行遗传转化、次生代谢产
物生产等方面的研究。
实验采用的培养基通常含有植物 生长调节剂、无机盐、维生素等 成分，以促进愈伤组织的生长和
分化。
实验背景
植物细胞培养技术是近年来发展迅速的生物技术领域之一，在农业生产、生物医药、 工业生产等方面具有广泛的应用前景。

本科学生综合性实验报告
学号姓名
学院生命科学学院专业、班级
实验小组及成员
实验课程名称植物组织培养实验
教师及职称龙维彪（讲师）
开课学期2011 至2012 学年下学期填报时间2012 年 6 月 1 日
云南师范大学教务处编印
一．实验设计方案
二．实验报告
1．实验现象与结果
A实验结果记录表：
愈伤组织诱导结果：
总接种瓶数5瓶总接种块数15块
污染瓶数4瓶污染块数11块
未污染瓶数1瓶未污染块数4块
未污染块中愈伤组织发生块数3块
愈伤组织发生率75%
愈伤组织发生情况记录愈伤组织的色泽较新鲜，但比较少
污染情况及原因分析污染瓶中，有1 瓶是霉菌污染，3瓶细菌污染。

可能是接种过程中接种器械消毒不够，掀开封口
膜时碰到了封口膜里面，也可能是封口膜没绑好。

愈伤组织继代培养结果：
继代培养没有受到污染，愈伤组织增殖情况较好，呈现不规则状。

颜色浅黄，注意看会有一些小黑点，愈伤组织开始老化，部分开始分化。

B实验结果图片。

本科学生综合性实验报告
学号：094120275 姓名：陈小华
学院：生命科学学院专业、班级：09应用生物教育B班实验课程名称：胡萝卜的愈伤组织诱导培养及继代培养
教师：杨世忠
开课学期：2011 至2012 学年第二学期填报时间：2012 年 5 月18 日
云南师范大学教务处编印
）无菌操作流程：
二．实验报告
图1胡萝卜愈伤组织诱导培养结果
2号瓶内的胡萝卜愈伤组织长势良好，1、3和4号瓶内胡萝卜均被
图2 胡萝卜愈伤组织继代培养结果
具体说明如表2：
表2 胡萝卜愈伤组织继代结果统计
2 存活瓶数 2
1号瓶内愈伤组织为Ⅱ型愈伤组织，其结构松脆，生长旺盛，
鲜艳，增值很快，称为亢进分裂型。

2号瓶内愈伤组织为Ⅰ型愈伤
组织，其结构致密，生长较慢，容易分化成苗，称为保守分裂型。

植物细胞工程-胡萝卜的组织培养姓名：物理数学狂班级：生物技术综合班学号：2019004284【实验计划】1.MS培养基母液的配置与保存、MS固体培养基的配置（准备实验）2.外植体胡萝卜愈伤组织的诱导培养（2018.10.18）3.胡萝卜愈伤组织的继代培养（2018.11.8）4.胡萝卜愈伤组织悬浮培养（2018.11.22）5.胡萝卜愈伤组织诱导生根（2018.12.1）6.观察实验结果（2018.12.13）【实验时间】2018年10月18日-2018年12月13日实验（一）MS 培养基母液的配制与保存一、实验目的1.通过MS 培养基母液的配制，掌握配制培养基母液的基本技能；2.掌握培养基各种母液的保存方法。

二、实验原理1.MS 培养基的特点：①无机盐浓度高；②高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐；③含有一定的铵盐，营养丰富；④不需要添加更多的有机附加物。

MS 按照营养水平划分为基本培养基。

2.培养基是植物离体培养组织和细胞赖以生存的营养物质，配置培养基时，为了减少试剂称取时的工作量出现的误差，以及多种营养成分混合导致沉淀产生或相互反应而失去培养效果，需要预先将各种营养成分配置为一定倍数的培养基母液，待使用时稀释到适合的浓度。

母液的浓度为培养基浓度的10倍、20倍、50倍、100倍等或更高。

3.需要时将配置好的母液按一定比例稀释到培养基指定浓度，再加入琼脂、蔗糖、生长调解物质等，制成符合要求的培养基。

三、器材与试剂1.器材：各类天平、磁力搅拌器、冰箱、烧杯、量筒、玻璃棒、试剂瓶、标签；2.试剂：95%酒精，0.1-1N NaOH ，0.1-1N HCl ，配制MS 培养基所需的各种无机物、有机物，蒸馏水。

四、方法步骤（一）母液的配制母液是欲配制培养基的浓缩液，一般配成比所需浓度高10—100倍。

优点：（1）保证各物质成分的准确性；（2）便于配置时快速移取；（3）便于低温保藏。

1.MS 大量元素母液（10×）称10升量溶解在1升蒸馏水中。

第2章《愈伤组织培养》复习题参考答案一、填空：1、绝大多数培养植物再生植株时都先经过愈伤组织阶段。

2、愈伤组织形成大致经历诱导期、分裂期和分化期三个时期。

3、使用植物生长调节物质时要注意：种类和浓度生长素和细胞分裂素的比值。

4、愈伤组织的形态发生方式主要有不定芽方式和胚状体方式。

二、名词解释：1、愈伤组织培养(callus culture):是指将母体植株上的外植体，接种到无菌的培养基上，进行愈伤组织诱导、生长和发育的一门技术。

2、继代培养(subculture)：愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养。

这个过程叫做继代培养3、形态建成（organogenesis）：外植体在适宜的培养条件下经脱分化、再分化形成不定根（adventitious roots）、不定芽（adventitious shoots）或直接发育成形态完整的植物体的过程。

4、体细胞胚（somatic embryo）又称胚状体（embryoid）：指在组织培养中，由一个非合子细胞(体细胞)，经过胚胎发生和胚胎发育过程（经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚5个时期），形成的具有双极性的胚状结构。

三、问答题1、愈伤组织细胞的分化一般分几个时期？各有何特点？（1）诱导期：①气体交换增加，如氧气的吸收增加②RNA含量增加（增加到300%）③蛋白质量增加（每个细胞的总增加量为200%）d酶活性增强（2）分裂期：①细胞的数目迅速增加②每个细胞平均鲜重下降③细胞体积小，内无液泡d细胞的核和核仁增大到最大e细胞中RNA含量减少，而DNA含量保持不变f随着细胞不断分裂和生长，细胞的总干重、蛋白质和核酸含量大大增加，新细胞壁的合成极快。

（3）分化期：①细胞分裂部位和方向发生改变②形成瘤状或片状的分生组织结节和维管组织结节③细胞的体积相对稳定，不再减少d出现了各种类型的细胞e生长旺盛的愈伤组织呈乳白色、白色或浅绿色，老化的多转化为黄色或褐色2、分裂期愈伤组织的共同特征是什么？细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，维持其不分化的状态，颜色浅而透明。

第三章愈伤组织的诱导与培养第一节愈伤组织的诱导与继代培养愈伤组织（callus）: 在培养基上，由外植体经脱分化和细胞分裂形成的一团无序生长的薄壁细胞。

大部分外植体细胞须经脱分化形成愈伤，才能再分化成完整植株，只有茎尖等少数细胞只恢复为分生状态但不分裂，直接再分化。

愈伤组织的诱导与分化是植物组培的基本环节。

一、愈伤组织的诱导及其形态特征1、愈伤组织的诱导1）起动期/诱导期（initiation/induction stage, Induction of growth）外植体细胞在外源激素作用下，经脱分化而恢复分裂状态，开始形成愈伤。

细胞外观无明显变化，代谢旺盛，合成加强，为分裂做准备。

持续十几小时~几天。

2）分裂期（divition stage/phase）：外植体切口边缘膨大，外层细胞迅速分裂，体积变小，具分生细胞的特征，细胞数速增。

3）形成期（formation stage/Differentiation phase）：外植体表层细胞分裂减缓，内部细胞开始分裂，大量细胞形成瘤状/泡状或片状结构。

若不及时继代，将分化出拟分生组织瘤状物和维管组织，又称分化期。

2. 愈伤组织的形态特征质地：松脆易碎的颗粒状；紧密坚实的结块状；水渍或浆糊状。

颜色：白色或淡黄色；淡绿色或绿色；黄色至褐色。

一般，淡黄或淡绿/绿色松脆（近圆形）或致密的颗粒状愈伤再生能力较强，白色/灰白色或黄褐色、浆糊状或紧实（香蕉形）的愈伤再生能力差。

3. 影响愈伤诱导的关键因素愈伤的形成是外植体、培养基和培养条件诸因素互作的结果。

迄今，几乎从各种外植体诱导形成愈伤。

其关键主要不在于外植体，而是培养基，尤其是激素的种类和浓度。

生长素为愈伤诱导和增殖所必需，细胞分裂素视外植体来源而异。

二、愈伤组织的继代培养继代培养（subculture）：将原有培养物转移到新鲜培养基上继续培养的过程称为~。

愈伤组织在培养基上生长一段时间后，由于营养枯竭，水分散失，代谢物积累，致使其生长缓慢甚至停止，须进行继代培养。

A 选择适当的基因型和适当的外植体。 B 选择正确的培养基，特别是正确的植物激
素的种类和浓度，以及在需要配合使用生 长素和细胞分裂素时，二者之间正确的配 比。
第五章继代培养
C 采用某些特殊的理化因素改变愈伤组织诱 导培养基和培养条件。 在玉米幼胚愈伤组织培养中，一些研究者通
过在培养基中添加5mg/L或10mg/L AgNO3，抑 制愈伤组织内乙烯的作用，从而使类型II愈伤组 织的频率显著提高。
第五章继代培养
六、继代培养
1、愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营 养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必 须转移到新鲜培养基上培养。这个过程收继代。继 代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过 程。
2、通过继代培养，可使愈伤组织无限期地保存持在 不分化的增殖状态。
第五章继代培养
如果让愈伤组织留在原来的培养基上继 续培养而不继代，它们则不可避免地发生分 化。
第五章继代培养
第二阶段为分裂期（细胞从开始分裂到持续分裂的 时期）： 细胞数目增加、体积变小、核和核仁变大、 RNA含量持续上升。从培养外植体的形态变化来 看，表现为外层细胞迅速分裂。当细胞体积最小， 细胞核和核仁最大，细胞内无大液泡,RNA含量最 高时，标志着细胞处于分裂高峰时期。
第五章继代培养
持自然生长方向接种；有时为了促进侧枝的形 成，茎尖接种时也可以水平放置在培养基上；
第五章继代培养
3、要定期对培养物进行观察和统计，根据培养物生 长情况及时对培养基和培养条件做出调整；
4、培养过程中经常会出现污染现象，要及时加以清 除；
5、在继代培养时一定要仔细检查，避免将污染的材 料进行扩大增殖。
第五章继代培养
五、愈伤组织分为3种主要类型：

愈伤组织诱导的普遍性与特殊性？
1. 外植体的选择 需考虑以下因素:
(1) 外植体的基因型 (2) 同一植物不同部位外植体，其细胞的分化能
力有相当大的差别 (3) 植物胚与幼龄组织器官比老化组织、器官更
容易去分化
一个细胞向分生状态回复过程所能进行的程度， 取决于它在原来所处的自然部位上已经达到的细 胞分化程度和生理状态
再生植株：器官发生(organogenesis)和体细胞 胚胎发生(somatic embryogenesis)
体细胞胚胎发生：指从体细胞进行的类胚结构的 生产。体细胞胚是一个二极结构，不物理地附着 于原组织，每一个体细胞胚称为胚状体，它可以 同合子胚一样发育成植株。
器官发生：是指培养条件下的组织或细胞团（愈 伤组织）分化形成不定根（adventitious roots）、不定芽（adventitious shoots）等器 官的过程 。
从理论上讲，生物体的每一个活细胞都应该具 有全能性。
差异：（1） 受精卵的全能性最高 （2） 受 精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖 细胞的低。
全能性实现的两个必须满足的条件： 把具有较强全能性的细胞从植物组织抑制性影
响下解脱出来 要给予植物细胞一定的刺激
二、几个重要的概念
外植体（explant): 植物组织培养中用来进行无菌培养的离体材料，
（2）物理因素 光：
很多光照条件下，一些植物均能进行器官发生， 说明光周期并不是非常重要的因子
有的植物在光、暗交替条件下才能形成芽，而 在连续光照下则不能
尽管如此，多数植物需要一个稳定的光周期， 多数培养条件是14-16h光照，8-10h黑暗
温度：不同植物不一样，需要摸索，如烟草和棉 花就不一样
B

实验四植物叶片愈伤组织的诱导培养（理论）一、概念愈伤组织（callus）◆自然状况下指植物在受伤后于伤口表面形成的一团薄壁细胞。

◆植物组织培养中，指在人工培养基上由外植体组织增生细胞产生的一团不定形的疏松排列的薄壁细胞。

二、植物愈伤组织及形成过程外植体形成愈伤组织，标志着植物组织培养的开始。

1、形态结构◆形状不规则，结构疏松◆有大量的分生中心◆细胞排列毫无次序◆内有大量的细胞间隙◆颜色不一致优良的愈伤组织所具备的特性：A、高度的胚性或再分化能力，以便从愈伤组织得到再生植株B、易散碎，可建立优良的悬浮体系，并可分离出全能性的原生质体C、旺盛的自我增殖能力，可建立大规模的愈伤组织无性系D、经过长期继代保存而不丧失胚性，可进行各种遗传操作2、愈伤组织形成过程A、诱导期◆细胞准备分裂◆合成代谢活动加强◆细胞大小基本不变诱导期时间长短因植物种类、外植体生理状况及外部因素而异B、分裂期◆一分为二，不断增殖◆形态结构与生理生化发生变化主要表现：◆数目迅速增加◆细胞平均鲜重下降◆细胞体积小◆核与核仁增至最大◆ RNA减少，DNA保持不变◆组织总干重、蛋白质与核酸含量增加◆新细胞壁合成极快C、形成期细胞经诱导、分裂形成无序结构愈伤组织的时期。

细胞特点：◆大而不规则、高度液泡化◆无次生细胞壁与胞间连丝◆整个组织松散◆表面以下约5~10个细胞生长中心本时期的愈伤组织是最适合获得单细胞或原生质体的，是建立悬浮体系的最好时期。

D、分化期停止分裂的细胞发生生理代谢变化，导致形成由不同形态和功能的细胞组成的愈伤组织。

本期愈伤组织特点：◆细胞分裂部位由表层转变到深层◆分裂方向由单周分裂变为深层局部分化◆分化组织瘤状结构形成◆维管组织形成瘤状结构的出现使愈伤组织逐渐形成具有维管组织，呈分散的节状结构形成，出现各类组织细胞。

细胞分裂素对促进维管化组织有重要作用3、愈伤组织的继代培养◆长期保存愈伤组织的一种方法◆直径到2~3cm时与外植体分离，单独培养◆选取其生长迅速的部位作继代培养◆分化与再生植株时，应选生长较慢的愈伤组织◆每一继代培养时间取决于其生长速度◆一般可在3~6周继代一次三、植物愈伤组织的遗传变异1、引起异质性的原因A、外植体染色体倍数性与遗传组成不同的细胞经诱导后的分裂B、培养条件引起的不规则性它们常同时发挥作用2、初生愈伤组织接种到培养基上后，细胞核内的变化：A、正常有丝分裂B、先核内复制，后有丝分裂C、先核碎裂，后有丝分裂◆初生愈伤组织的异质细胞群体性反映了外植体中的染色体状况反映了愈伤组织诱导期间核变异的结果◆在诱导中，会出现二倍体、多倍体、单倍体、非整倍体与染色体结构变异体等3、建成愈伤组织◆选择作用的结果◆只有一种主要核型占优势◆培养基成分和培养类型的影响◆异质群体中细胞间的竞争与互作的影响四、影响因子及培养条件1、培养基2、组织原有的倍数性3、培养环境的条件五、愈伤组织的发生方式发生方式：1、器官发生指细胞或愈伤组织通过形成不定芽再生成植株的过程。

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2、外植体材料的准备与消毒： 外植体的消毒一般采用次氯酸钠（市面上销售的一般为10-14%有效氯）， 使用时按1:10稀释，消毒时间以材料定，消毒后无菌水冲洗4-5次；或用 0.1%汞消毒。 如果没有特殊的条件要求，在无菌条件下发芽种子能产生无菌的根、茎、 叶（无菌苗），较适于诱导愈伤组织。种子是诱导愈伤组织的很好起始 材料，因为： （1）可将整粒种子放在加有生长物质的培养基上使其直接产生愈伤组织； （2）在无激素的培养基上发芽，可产生无菌的根、茎、叶用于外植体； （3）可直接从种子上剪下根原基及芽尖用作外植体。
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（二）、影响器官发生的因素

化学因素： 从早期烟草组织的研究我们知道，器官发生的表达受外源 化学物质控制，高浓度的生长素和低浓度的分裂素可以促使 细胞连续繁殖-无组织的生长。相反，高浓度的分裂素能引 起茎-芽（shoot-bud）形成。同时，ausion/cytokinin之比 值的变化成为特定的器官、根或芽分化的一个参数，一个基 本规律是：生长素促进根分化，分裂素促进芽分化。生长素 与根形成有关，同时对愈伤组织的保持也是必须的。在促进 芽的分化中，BAP是最有效的。
固体培养
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悬浮培养的用途：



提供一个相对一致的细胞群体（供生化研究、胚胎发生研究、 胚的同步化研究等）。 能快速吸收外源物质，检查药效。 研究次生代谢、酶诱导、基因表达、抗生素的降解的良好实 验体系。 多数悬浮细胞缺乏叶绿体、色素，对酶和次生物质的分离及 纯化十分有利。 细胞增值速度快，适于大规模培养。 分离原生质体的良好细胞来源。

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器官发生型的应用
• • 细胞、原生质体培养； 无芽组织的分化；
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