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三角帆蚌钙调蛋白(CaM)基因的cDNA序列克隆与表达分析李文娟;李倩;祁晓翔;尚朝;周子睿;施志仪【摘要】[目的]研究三角帆蚌钙调蛋白(CaM)基因在育珠和非育珠蚌各组织中的表达和不同Ca2+浓度下外套膜中的表达变化.[方法]通过RACE技术,以我国重要的淡水珍珠贝——三角帆蚌为研究客体,克隆了CaM的cDNA全长,并通过Real-Time Q-PCR技术分析了该基因在育珠和非育珠蚌各组织中的表达和不同Ca2+浓度下外套膜中的表达变化.[结果]三角帆蚌CaM基因cDNA全长659bp,包括70 bp的5'UTR,299 bp的3'UTR和447 bp的ORF,编码149个氨基酸,预测其分子量为16.8 kDa,等电点为4.14.cDNA序列比对信息表明三角帆蚌与池蝶蚌、合浦珠母贝间均具有57％的相似度,而其蛋白具有高度的保守性,除斑马鱼外,各生物CaM相似率达97％.定量数据表明,CaM基因广泛表达于三角帆蚌各组织,外套膜内膜与腮中表达量显著升高(P＜0.05),其次是外套膜外膜和内脏团组织.插核育珠能增加该基因在各组织的表达,特别是在外套膜外膜和鳃组织中,育珠蚌该基因的表达显著高于非育珠蚌(P＜0.05).此外,水体Ca2+浓度的增大对CaM基因表达有显著的影响,外套膜内膜该基因的表达随Ca2+浓度升高而增加,而外套膜外膜1.25 mmol/L Ca2+浓度下该基因的表达水平显著高于0.50 mmol/L、3.00 mmol/L 组(P＜0.05).[结论]为进一步深入研究钙调蛋白基因的在珍珠生长过程中的功能及其调控机理奠定了分子基础.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2014(000)022【总页数】5页(P7310-7314)【关键词】三角帆蚌;CaM;序列克隆;基因表达【作者】李文娟;李倩;祁晓翔;尚朝;周子睿;施志仪【作者单位】上海海洋大学农业部水产种质资源与养殖生态重点开放实验室,上海201306;上海海洋大学农业部水产种质资源与养殖生态重点开放实验室,上海201306;上海海洋大学农业部水产种质资源与养殖生态重点开放实验室,上海201306;上海海洋大学农业部水产种质资源与养殖生态重点开放实验室,上海201306;上海海洋大学农业部水产种质资源与养殖生态重点开放实验室,上海201306;上海海洋大学农业部水产种质资源与养殖生态重点开放实验室,上海201306;上海市高校水产养殖学E-研究院,上海海洋大学,上海201306【正文语种】中文【中图分类】S188钙调蛋白(Calmodulin protein，CaM)是存在于生物体内含量最丰富的钙离子结合蛋白，广泛存在于所有真核细胞中，参与细胞钙代谢、离子转运、细胞分泌、细胞增殖与分化、基因表达、防御反应等重要生理过程的调节［1－2］。
研究蛋白质表达调节的新型药物随着生物技术和医学研究的不断进步，寻找新型药物以治疗各种疾病成为了科学家们的重要任务。
蛋白质作为生物体内最基本的分子机器，对细胞功能的调节至关重要。
因此，研究蛋白质表达调节的新型药物成为了近年来的热点领域。
本文将介绍几种新型药物的研究进展，它们对蛋白质表达的调节有着重要的意义。
一、小分子药物的研究小分子化合物是一类具有较小分子量的有机化合物，可以作用于细胞内的蛋白质，从而干预蛋白质的表达和功能。
在研究蛋白质表达调节的新型药物方面，小分子药物占据了主导地位。
1. 抑制剂抑制剂是一类能够抑制特定蛋白质活性的小分子化合物。
通过与目标蛋白质发生相互作用，抑制剂可以阻断蛋白质相关的信号传导途径，从而降低该蛋白质的表达水平。
目前，已经开发出了许多具有潜力的抑制剂，如克唑替尼（Crizotinib）用于治疗某种肿瘤。
2. 激动剂激动剂是另一类重要的小分子药物，它们能够增强靶向蛋白质的表达和功能。
通过与目标蛋白质结合，激动剂可以激活蛋白质的活性，从而提高它们在细胞内的表达水平。
当前，许多研究团队致力于开发各种激动剂，以实现蛋白质表达的精准调控。
二、核酸技术在蛋白质表达调节中的应用除了小分子药物，核酸技术也被广泛应用于蛋白质表达调节的研究中。
这种技术主要包括RNA干扰（RNAi）和基因编辑。
1. RNA干扰RNA干扰是一种通过引导特定RNA分子的降解来抑制蛋白质表达的技术。
通过合成特异性的RNAi载体，研究人员可以选择性地抑制目标蛋白质的合成，从而实现对其表达水平的调控。
这种技术被广泛应用于基础生物学研究和药物开发领域。
2. 基因编辑基因编辑技术则是通过直接修改基因组中的特定序列，来实现对蛋白质表达的调控。
例如，CRISPR/Cas9系统能够精确地识别和切割目标基因，从而实现对特定蛋白质的表达进行精确调节。
这种技术具有巨大的应用潜力，并已经在医学和生物研究中取得了突破性进展。
三、蛋白质稳定剂的发展蛋白质稳定剂是一类能够增加蛋白质稳定性的化合物。
Src、FAK对E-cadherin和integrin介导的串联以及肿瘤浸润、转移的影响周俭珊;黄海燕【摘要】钙黏蛋白(E-cadherin)和整合素(Integrin)在协调控制细胞基本的生理和病理过程中扮演着重要的角色,包括形态发生、组织分化、伤口愈合、免疫监视、炎症反应、肿瘤进展和转移等.然而,目前调节钙黏蛋白和整合素之间通信的根本性分子机制仍然不是很清楚.尽管大量的证据支持两种黏附受体家族间存在有精细调控的串联,而且这种串联可以影响他们的表达、翻转、定位和/或功能,并可根据细胞内外的环境背景来增强或抑制黏附连接,然而这些重要的现象中涉及到的分子和分子调控机制目前还不完全清楚.最近越来越多的证据表明,非受体酪氨酸激酶Src和FAK与整合素和钙黏蛋白调控的细胞间黏附和信号转导的过程密切相关,本文主要是综述Src及FAK在串联中的重要作用,及探讨这种串联对肿瘤细胞的集体迁移、浸润和转移的潜力的影响.【期刊名称】《海南医学》【年(卷),期】2016(027)001【总页数】4页(P93-96)【关键词】钙黏蛋白;整合素;串联;Src;FAK【作者】周俭珊;黄海燕【作者单位】三峡大学医学院,湖北襄阳 443000;三峡大学医学院,湖北襄阳443000【正文语种】中文【中图分类】R73-37所谓分子串联是指信号通路间的通信，在细胞生物学中起着核心作用，使细胞能够连接到相邻细胞或者较远的分子功能组件，来产生协同或拮抗效应，最终产生生物学效果[1]。
细胞间最重要的串联事件是连接到整合素和钙黏蛋白家族的黏附分子受体的信号网络。
钙黏蛋白(E-cadherins)和整合素(Integrins)是在上皮中分别介导细胞和细胞间、细胞和胞外基质间黏附的主要分子。
已有研究证实，这些分子参与了如细胞迁移、增殖、分化，生存和基因表达等重要生物过程的调节。
大量的体内和体外实验都证明了在细胞黏附和移动过程中E-cadherins和Integrins两者介导的连接存在着串联，且这种串联可以调控肿瘤细胞的可塑性，在肿瘤细胞的局部浸润和远处转移中发挥了重要作用[2-3]。
钙拮抗剂的药理作用及临床应用钙拮抗剂（calcium antagonists,CaA）是由Fleckenstein首先提出来的。
能选择性地阻滞Ca2+经细胞上电压依赖性钙通道进入胞内、减少细胞内Ca2+浓度，从而影响细胞功能的药物，有些尚可减慢Ca2+通道的恢复，使细胞内Ca2+水平降低而改变心血管功能，对心、脑血管起到保护作用，又称钙通道阻滞药。
随着临床医学的发展，其应用领域不断扩大，在消化系统、神经系统、泌尿系统及延缓衰老、治疗老年退行性疾病等方面均有应用。
现将CaA的药理及临床应用作一概述。
1 CaA的药理作用[1]1.1 Ca2+在细胞活动中的作用：许多刺激所引起的反应都是通过细胞内游离Ca2+的增加而实现的。
在心肌中Ca2+与向宁蛋白C结合而启动收缩过程；在平滑肌、血小板及神经元中，Ca2+与相应的蛋白质结合而产生收缩、分泌等效应。
Ca2+的第二信使样功能，日益受到重视。
细胞内Ca2+浓度为10-7M，而细胞外Ca2+浓度为10-4M，凡能阻Ca2+进入细胞内或妨碍Ca2+在细胞内到达其结合部位的药物，效果上具有Ca2+拮抗作用。
前者称为钙通道阻滞剂（calcium channell blocking agents），后者称为钙调蛋白拮抗剂（calmodulin antagonist）。
CaA不仅具有抑制心肌收缩力、减慢心率及延缓传导、降低心肌氧耗量、松弛血管平滑肌、引起血液动力学变化等心血管系统的作用，而且还具有抑制血小板的凝聚、抑制神经及内分泌系统的兴奋-分泌偶联，以及减少交感神经末梢递质的释放等作用。
1.2 CaA的血管内皮保护作用：近年逐渐认识了CaA的血管内皮保护作用，CaA具有抗氧化作用，可以对抗氧自由基和超氧离子对内皮的损伤，进而增加具有血管舒张及（或）抗炎、抗凝作用的内皮舒张因子，同时可增加平滑肌细胞对内皮舒张因子的敏感性，从而使血管内皮舒张。
另一方面，具有血管收缩及（或）促炎、促凝作用的内皮素的释放依赖于L型钙通道，CaA可以阻断内皮素对平滑肌的收缩作用。
钙调蛋白和钙调磷酸酶
钙调蛋白（calmodulin，CaM）和钙调磷酸酶（calcineurin）是两种与钙离子调节相关的重要蛋白质，在细胞信号传导和调控中发挥着重要作用。
钙调蛋白（calmodulin，CaM）：
CaM是一种高度保守的钙离子调节蛋白，在许多生物体中都广泛存在，并参与了许多细胞功能的调控。
在没有钙离子结合时，CaM呈现出一种不活跃的状态。
而当细胞内钙离子浓度增加时，CaM会与钙离子结合形成Ca2+-CaM复合物。
Ca2+-CaM复合物可以调节许多蛋白质的活性，包括激酶、磷酸酶、离子通道等。
通过与这些靶蛋白结合，Ca2+-CaM复合物可以调节它们的活性，从而影响细胞内的信号传导和生物学响应。
钙调磷酸酶（calcineurin）：
calcineurin是一种钙调节的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，也被称为钙调蛋白依赖性磷酸酶。
calcineurin在细胞信号传导中起着关键的作用，特别是在T细胞和神经元中。
calcineurin的活性受到钙离子和CaM的调控。
当细胞内的钙离子浓度升高时，Ca2+-CaM复合物会激活calcineurin，使其活化。
活化的calcineurin可以去磷酸化和调节多种底物蛋白，包括核因子和细胞凋亡相关蛋白，从而影响细胞的功能和命运。
总的来说，钙调蛋白和钙调磷酸酶是细胞内钙离子信号传导中的重要组成部分，它们通过与钙离子结合和活化，调节多种蛋白质的活性，参与了细胞的生理过程和生物学响应。
1。
AbstractSnapin regulates the function of Cav1.3 calcium channel by whole patch-clamp recordings. The results are as follows:1. Snapin colocalizes with Cav1.3 Ca2+ channel in the cell membraneThe colocalization of Cav1.3 and Snapin in the cell membrane was identified by immunofluorescence assays in either HEK293 cells overexpressed them and atrial myocytes isolated from mouse atrium.2. Snapin interacts with Cav1.3 Ca2+ channelThe physical interaction between Cav1.3 Ca2+ channel and Snapin was confirmed by co-immunoprecipitation assays in HEK293 cells heterologously co-expressed them and in mouse atrial tissues.3. Snapin affects the electrophysiological characteristics of Cav1.3 Ca2+ channelWe further analyzed the effects of Snapin on electrophysiological characteristics of Cav1.3 calcium channel in HEK293 cells heterologously co-expressed them by using whole cell patch clamp. Results show that Snapin significantly reduce the density of I Ca-L, accelerate the process of steady-state activation and delay the process of deinactivation.All the results indicated that Snapin can interact with Cav1.3 calcium channel in the mammalian system and affect the electrophysiological characteristics of Cav1.3 Ca2+ channel: inhibition of Cav1.3 I Ca-L density, acceleration of steady-state activation process and delay of deinactivation process. This suggested that Snapin mediated the membrane excitation by inhibiting the Cav1.3 I Ca-L.Key words: Cav1.3 calcium channel, Snapin, HEK293 cell, atrium英文缩写词表英文缩写词表英文缩写英文全名中文译名AP alkalinephosphatase 碱性磷酸酶A VN atrioventricualr 房室结BSA bovine serum albumin 牛血清白蛋白DHP dihydropyridine 二氢吡啶sulfoxide 二甲基亚砜DMSO dimethyserum 胎牛血清FBS fetalbovineGFP green fluorescent protein 绿色荧光蛋白HEK 293 human embryonic kidney 人胚肾上皮细胞G 免疫球蛋白IgG immunoglobulinLVDCC L type voltage-dependent caicium channel 电压依赖的L型钙通道gelelectrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE polyacrylamidePBS phosphate buffer salt 磷酸盐缓冲液PFA paraformadehyde 多聚甲醛fluoride 苯甲基磺酰氟PMSF phenylmethylsufonyldodecylsulfate 十二烷基硫酸钠SDS sodium学位论文独创性声明本人郑重声明：1、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。
钙离子诱导钙调蛋白CaM构象变化
CaM可结合4个钙离子，有两种构象，无钙的Apo-CaM与钙饱和的Holo-CaM. 增加钙离子可使CaM从一个“开放形式”的构象转变为疏水结构接触的构象。
Apo-CaM (左) 和Holo-CaM (右) 3D 结构，钙原子(红)，蛋氨酸(黄), 酪氨酸(绿) 和组氨酸(蓝)
用AWS A20石英晶体微天平研究钙调蛋白聚合的钙离子
芯片：金表面覆盖石墨涂层芯片
步骤：
1)将10μl的60μM钙调蛋白溶液滴到芯片表面，室温下干燥。
2)注入5ml的缓冲溶液，PH=7，0.1M的Tris/HCl溶液
3)频率稳定后，每次持续添加30μl 的10mM CaCl2溶液，记录频率变化。
每次添加溶液会产生频率噪音峰。
图A每次添加30μl 的10mM CaCl2溶液的频率随时间变化
图B每次添加30μl 的10mM CaCl2溶液的频率随钙离子浓度变化
起初频率没有发生变化，当Ca2+浓度增加到180 mM时，
钙调蛋白开始集合Ca2+，芯片表面质量增加直到钙离子浓度增加到约350 mM。
此时由于钙离子的存在，钙调蛋的构象发生变化，由Apo-CaM 转化为Holo-CaM.
当构象由Apo-CaM 转化为Holo-CaM时，结构变得易弯曲，使深处膜层不易再聚合钙离子。
通过106Hz频率变化计算得到，电极表面增加了0.12μg的钙离子
以1个钙调蛋白可结合4个钙离子计算，可得到钙调蛋白聚合了0.1μg的钙离子
两者不同是因为有钙离子直接吸附到了芯片表面。
钙调蛋白和钙调磷酸酶全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：钙调蛋白和钙调磷酸酶都是与细胞内钙离子平衡调节相关的重要分子。
它们在细胞中扮演着重要的调节作用，对于维持细胞内环境的稳定和功能的正常发挥起着关键的作用。
下面就让我们来详细了解一下这两种分子的特性以及它们在生物体内的重要作用。
让我们先来了解一下钙调蛋白。
钙调蛋白是一类能够调节细胞内钙离子浓度的蛋白质，它们可以通过结合到钙离子上来转变其活性。
钙调蛋白可以通过调节细胞内钙离子平衡来影响多种重要的细胞功能，比如细胞的收缩、分裂、凋亡等。
在真核生物中，钙调蛋白种类众多，比如肌钙蛋白、调节蛋白C、调节蛋白D等。
这些钙调蛋白在不同的细胞类型中扮演着不同的角色，但它们的共同点是都能感知细胞内钙离子浓度的变化，并通过调节相应的信号通路来传递这种信号。
另外一种重要的调节细胞内钙离子平衡的分子是钙调磷酸酶。
钙调磷酸酶是一种能够调解细胞内钙离子信号的酶，它通过去磷酸化或磷酸化靶蛋白来完成对信号分子的调节作用。
钙调磷酸酶在细胞内被广泛分布，可以调节多种重要的细胞功能，比如信号传导、代谢调节、基因表达等。
在细胞内，钙调磷酸酶与钙调蛋白通常会形成一个负反馈调节回路，通过相互作用来维持细胞内钙离子的稳定水平，避免发生过高或过低的钙离子浓度。
钙调蛋白和钙调磷酸酶的相互作用在细胞内起着重要的协同作用，它们共同维持了细胞内钙离子平衡，保证了细胞功能的正常运转。
在激活信号通路、细胞增殖、细胞凋亡等过程中，钙调蛋白和钙调磷酸酶的协同作用非常重要。
通过调节这两种分子的活性，细胞可以有效地对抗外界环境的变化，保持自身的生存优势。
钙调蛋白和钙调磷酸酶在细胞内起着非常重要的调节作用，它们共同维持了细胞内钙离子平衡，保证了细胞的正常功能。
这两种分子的相互作用和调节机制为我们深入了解细胞内信号传导、代谢调节等生物学过程提供了重要的参考。
在未来的研究中，更深入地探究钙调蛋白和钙调磷酸酶的功能和调节机制，将有助于我们更好地理解细胞内的调控机制，从而为疾病的治疗和药物的研发提供新的思路和途径。
钙调蛋白拮抗剂的化学,分子药理学及其治疗…Mannh.,R;魏欣冰
【期刊名称】《国外医药：合成药．生化药．制剂分册》
【年(卷),期】1993(14)6
【摘要】细胞内游离钙的浓度变化在许多细胞的功能调节中起着关键性作用,钙在这些过程的化学反应中的作用是通过钙蛋白(calci-proteins)来完成。
钙调蛋白(calmodulin,CaM)是细胞内最重要的钙蛋白之一。
CaM拮抗剂是对CaM有选择性拮抗作用的药物,它既是研究CaM生理过程的重要工具,也是药理学中的重要课题。
【总页数】6页(P322-327)
【作者】Mannh.,R;魏欣冰
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】R977.6
【相关文献】
1.钙调蛋白拮抗剂W-7对人Tenon囊成纤维细胞的抑制实验 [J], 陈凤华;王津津;李志辉;王金城
2.新型钙调蛋白拮抗剂(EBB、BB、B0)对CaM基因表达的影向 [J], 段江燕;张金红
3.钙调蛋白拮抗剂研究进展 [J], 段江燕
4.植物中钙调蛋白拮抗剂的研究 [J], 杨桂芝
5.钙调蛋白拮抗剂对人胃癌细胞效应机理的研究——钙调蛋白与磷酸二酯酶活性测定分析* [J], 赵雅丽;孟松娘;刘树人;林仲翔
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CaM与ZmCCaMK相互作用参与BR诱导的玉米叶片抗氧化防护管莉;张阿英【摘要】以玉米(Zea maysL.)为材料,通过酶联免疫法、实时荧光定量PCR技术、免疫共沉淀激酶反应以及原生质体瞬时表达体系等方法研究了在油菜素内酯(Brassinosteroids,BR)诱导的玉米叶片抗氧化防护过程中钙调素(Calmodulin,CaM)的作用以及CaM和Ca2+/CaM依赖的蛋白激酶(ZmCCaMK)之间的关系.结果显示:外源BR处理显著提高了玉米叶片叶肉细胞原生质体中的CaM含量,CaM拮抗剂的预处理几乎完全抑制了BR诱导的抗氧化防护酶活性,表明CaM参与了BR诱导的抗氧化防护.而且ZmCCaMK原生质体瞬时表达及瞬时沉默结果显示ZmCCaMK影响BR诱导的CaM含量,CaM拮抗剂的预处理也显著抑制了BR诱导的H2O2的产生、ZmCCaMK基因表达以及激酶活性.说明BR诱导产生的CaM增强H2O2的积累,进一步诱导抗氧化防护酶活性增加,并且CaM 和ZmCCaMK之间存在互动机制.【期刊名称】《江苏农业学报》【年(卷),期】2015(031)001【总页数】6页(P10-15)【关键词】玉米;油菜素内酯;钙调素;抗氧化酶;H2O2;ZmCCaMK【作者】管莉;张阿英【作者单位】南京农业大学生命科学学院,江苏南京210095;南京农业大学生命科学学院,江苏南京210095【正文语种】中文【中图分类】S513.01油菜素内酯(Brassinosteroids，BR)作为一种新型甾醇类植物激素，参与并调节植物生长发育以及对胁迫响应过程［1-3］。
许多研究结果表明，BR 可以通过提高植物的抗氧化防护酶活性来增强植物对胁迫的耐受能力［4-5］，活性氧、促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase，MAPK)［5-6］、钙调素依赖的蛋白激酶(Calcium-calmodulin dependent protein kinase，ZmCCaMK)等都参与BR 诱导的抗氧化防护，然而关于BR 诱导植物抗氧化防护的详细机理还不十分清楚。
第14卷第1期2000年3月 山西师范大学学报(自然科学版)Jour na l o f Sha nx i T eache r ′s U niv e rsity N atur al Science Editio n V o l.14No.1M a rch 2000收稿日期:1999-11-16作者简介:段江燕(1965-),女,山西师范大学生物系讲师,硕士.文章编号:1009-4490(2000)01-0058-04新型钙调蛋白拮抗剂(EBB 、BB 、B 0)对CaM 基因表达的影响段江燕1, 张金红2(山西师范大学生物系,山西临汾 041004;2.南开大学分子生物学研究所,天津 300071)摘要:本文初步探讨了小檗胺(B 0)及其衍生物(EBB 胺BB )对Ca M 基因表达的影响.结果表明三种化合物不仅能拮抗Ca M 的调控功能,而且对Ca M 基因表达系统亦有抑制作用.为进一步探讨CaM 拮抗剂的分子机制具有一定的参考价值.关键词:小檗胺;衍生物;拮抗剂;基因表达中图分类号 Q 756 文献标识码:A随着钙调蛋白(CaM )在细胞内多种生理功能被认识,人们对它在细胞周期和增殖过程中的调控作用也越来越重视.随后进行的CaM 拮抗剂对多种瘤株体外增殖的抑制作用更证明了CaM 参予细胞增殖过程[1].研究中普遍存在的问题有二方面,(1)专一性不强.一些已知的CaM 拮抗剂除能影响CaM 的调节功能外,对非Ca M 调节的靶体亦有抑制作用;(2)Ca M 受抑制部位尚不明.即Ca M 拮抗剂拮抗Ca M 是在DN A 水平还是只拮抗CaM 的功能,至今尚无统一认识.因此大家努力寻找专一性强的CaM 拮抗剂用于抗肿瘤增殖的研究,以揭开拮抗剂抑制肿瘤细胞增殖的本质.小檗胺类化合物是一种新型的钙调蛋白拮抗剂[2],酶学实验证明改性后的小檗胺衍生物拮抗CaM 的能力超过其母体小檗胺几倍至几十倍之多,且专一性系数增高[3].先期的细胞学实验结果表明小檗胺衍生物对脑恶性胶质瘤细胞[4]、人宫颈癌细胞[5]、腹小癌细胞以及黑色素瘤细胞等都有明显的抑制作用[6],且改性后的衍生物抑制肿瘤细胞增殖的作用比小檗胺强.此结果与酶学实验结果基本一致,说明这些化合物抑制细胞增殖与拮抗CaM 活性有关.为了进一步研究其可能的机理,我们以携带CaM 基因表达系统的大肠杆菌(Eco li k12U T481)为材料,观察了小檗胺(B 0)及其衍生物(BB 、EBB)对Ca M 表达的影响,其目的在于从分子水平探讨CaM 与肿瘤生长的关系,为Ca M 拮抗剂作为抗肿瘤药物应用的可行性提供科学依据.1 材料与方法1.1 材料小檗胺,北京东升制药厂;衍生物(BB 、EBB ),本室合成;携带CaM 基因表达系统的大肠杆菌(Eco li k 12U T481),来源:D ·M Ro berts 惠赠徐友涵老师;磷酸二酯酶:从牛心制备;钙调蛋白(Ca M):从牛脑制备,电泳均一纯;其他试剂均为国产或进口分析纯.1.2 方法1.2.1 小檗胺类化合物作用于大肠杆菌Eco li k 12U T 481生长曲线的制作 把携带CaM 基因的Eco li k 12UT 481播种于LB 培养基中(蛋白胨1%;酵母膏0.1%,牛肉膏0.5%,Na Cl 0.5%,p H =7.0～7.2)分为对照组和实验组,实验组中加入不同浓度的B 0、EBB 、BB ,于37℃、140转/分摇床培养12小时,每隔2小时测OD 550,绘制其生长曲线,以确定小檗胺类化合物的用于基因表达的浓度范围.1.2.2 高表达CaM 的大肠杆菌(Ecoli k 12U T 481)中CaM 水平的测定 E coli k 12U T 481播种在LB 培养基中,37℃,140转/分摇床上培养,分为对照组和实验组,待菌液的O D 550值为0.4—0.5时,实验组中加入不同浓度的B 0,BB,EBB,表达2小时后收集菌体,处理细胞进行CaM 含量测定,以对照组CaM 含量/总蛋白为100%,计算不同药物对CaM 基因表达的抑制率.相对抑制率=(对照组-实验组)CaM 含量对照组CaM 含量×100%1.2.3 CaM 含量测定(1)细胞样品处理;(2)PDE 法测CaM 含量.3 结果与讨论3.1 结果B 0,EBB,BB 三种药物对Ecoli 生长曲线的影响如图1、2、3所示,结果表明:在本实验条件下,药物对Ecoli 的生长有一定的影响.但Eco li 在LB 培养基中培养6小时,B 0低于100μmo l /L 、BB 低于50μmo l /L 、EBB 低于20μm ol /L 时均不影响Eco li 正常生长,Eco li 一直处于对数生长期.因此选择上述浓度作为被检最高浓度.59第1期 段江燕 张金红:新型钙调蛋白拮抗剂(EBB 、BB 、B 0)对CaM 基因表达的影响 Ecoli 在LB 培养基中培养,当菌液中菌的密度达OD 550nm 0.4—0.5时,加入不同浓度的B 0,BB ,EBB 继续培养表达2小时,用PDE 法测CaM 含量.实验发现B 0、BB 、EBB 对CaM 基因的表达都有一定的抑制作用(如图4,以对照组CaM 表达率为100%)表现出同种化合物浓度的增加,其抑制CaM 表达作用增强;不同化合物因其化学结构的不同表现出的抑制效果不同,100μmo l /L 的B 0其抑制率为30%;20μmol /L EBB 的抑制率为55%;50μm ol /L BB 的抑制率为50%,可见烷氧基化的小檗胺(EBB)和酰基化的小檗胺的抑制作用比小檗胺强.烷氧基化的EBB 与酰基化的BB 相比,EBB 作用更强.3.2 讨论CaM 是存在于一切真核细胞中的多功能调节剂,为研究钙调蛋白拮抗剂拮抗CaM 的机理问题,我们选用了CaM 缺乏,具有简便、经济、高效等优点的原核Ecoli 表达系统进行研究分析,D.M Rober ts 等人于1985年将合成的Ca M 基因在大肠杆菌中进行了克隆和表达,并对该基因进行了序列分析和活性测定,其结果表明大肠杆菌表达系统中所表达的CaM 与牛脑CaM 对PDE 激活相似,为我们今天对CaM 基因表达调控的研究提供了方便.在本实验条件下,CaM 基因在Ecoli 中能得到高效表达22%,钙调蛋白拮抗剂(EBB,B 0,BB)不仅拮抗CaM 的活性而且对CaM 基因表达系统亦有抑制作用.表现在带有CaM 基因的Ecoli 在LB 培养基中培养至OD 550在0.4—0.5时,加入药物立即进行CaM 测定,发现5μM 的EBB 可使CaM 表达率降低19%,20μm EBB 可使CaM 表达率降低26%,说明加入的药物与CaM 形成了复合物致使CaM 活性降低,在与药物一起培养2小时,CaM 的表达率发生改变,5μm,EBB 的CaM 表达率由19%降低至36%,20μm EBB 由26%降低至55%,可见除EBB 与CaM 形成复合物拮抗CaM 活性外,还有15%(5μm EBB)或29%(20μM EBB),使CaM 表达率降低的原因来源于抑制了CaM 基因表达系统,此作用结果使CaM 基因的转译受到影响,但具体是因为CaM 含量降低,而影响Ecoli 自身的DN A 复制和表达(包括Ca M 基因的表达);还是仅仅拮抗了携带的CaM 基因,致使体系内CaM 表达率降低的问题还有待于进一步的研究.尽管结果证明钙调蛋白拮抗剂对Ecoli Ca M 表达系统有一定影响,但由于真核细胞60 山西师范大学学报(自然科学版) 2000年内基因表达调控的复杂性,因此小檗胺类化合物抑制细胞增殖的同时所伴随的Ca M 水平降低的原因还需进行深入的研究.参考文献:[1] William N Hait ,e t al .Calmo dulin :Apo r ential ta rg et fo r cance r chemo theapea tic ag ents [J ].JClin O nce,1986,4(6):994-1012[2] Youhan X u,e t al.The effec t o f ber ba mine deriv a tiv es on activa ted Ca 2+-stimula ted M g 2+-dependent AT Pa se in eny th rocy te membero nes [J ].Bio ch em J ,1987:248[3] 刘杰文.钙调素拮抗剂小檗胺衍生物对成纤维细胞增殖功能的影响[J ].细胞生物学杂志,1993,15(3)[4] 张金红,等.小檗胺及其衍生物的结构对宫颈癌细胞生长增殖的影响[J].南开大学学报,1996,29(2)[5] 张金红,等.M T T 比色分析法在贴壁生长细胞药物敏感性测定中的应用[J ].南开大学学报,1996,29(4)[6] 张金红,段江燕.小檗胺类化合物对黑色素瘤细胞生长增殖的影响[J].中草药,1997,28(8)The Role of New Calmodulin (B 0,BB ,EBB )On CaM Gene ExpressionDUA N Jiang-yan , ZHANG Ji -hong Abstract :The paper studied the role of berbamine deriva tives on CaM g ene ex pression.The results dem onstrated tha t three berbamine compounds (B 0,BB,EBB)no t o nly antago nized the activities o f Ca M ,but also ca n inhibit CaM g ene ex pression system.It is v aluable to further explore the m olcular m achanism on the affected o f CaM antag onists.Key words :Berbamine ;Deriv ativ e ;Antag onist ;Gene ex pression 61第1期 段江燕 张金红:新型钙调蛋白拮抗剂(EBB 、BB 、B 0)对CaM 基因表达的影响 。
