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用核磁共振方法研究金属离子与蛋白质的相互作用张芳;林东海【摘要】许多蛋白质含有金属离子, 金属离子对蛋白质发挥生物学功能起着很大的作用. 金属离子与蛋白质的相互作用以及参与蛋白质功能调节的方式各种各样: 有些金属离子高度专一性地与蛋白质紧密结合, 对蛋白质发挥生物学功能起着关键性的作用; 有些金属离子只是作为蛋白质发挥功能的辅助因子而瞬态地与蛋白质松散结合. 本文简要介绍目前国际上用NMR方法研究抗磁金属离子和顺磁金属离子与蛋白质相互作用的进展, 并具体介绍了NMR方法在钙调蛋白、锌指蛋白、朊病毒蛋白等金属离子蛋白研究上的应用.【期刊名称】《波谱学杂志》【年(卷),期】2009(026)001【总页数】14页(P136-149)【关键词】核磁共振(NMR);金属离子与蛋白质相互作用;化学位移扰动;骨架动力学;顺磁效应;三维结构【作者】张芳;林东海【作者单位】中国科学院,上海药物研究所,上海生命科学研究院,上海,201203;中国科学院,上海药物研究所,上海生命科学研究院,上海,201203【正文语种】中文【中图分类】O482.53;Q71引言NMR是解析生物大分子结构-功能关系的强有力的技术手段. 许多蛋白质含有金属离子, 金属离子对许多蛋白质发挥生物学功能起着关键性的作用. 在人体基因组编码的蛋白质中，超过30%的蛋白质含有一个或多个金属离子；所有酶中，超过40%的蛋白质含有金属离子，它们在生命活动过程中发挥着各种各样的生物学功能[1,2]. 许多人类的疾病与金属离子-蛋白质的异常相互作用相关[3]. 金属离子与蛋白质相互作用主要分为以下几种类型：第一种，金属离子与蛋白质以固定的方向紧密结合，与蛋白质的功能密切相关，但对三维结构影响很小. 例如含有铜离子的蛋白质质体蓝素(plastocyanin)，是光合作用链中的重要成员，铜离子在质体蓝素传递电子和氧化还原过程中起着很重要的作用，但是铜离子的结合对质体蓝素的三维结构基本没有影响[4,5]. 第二种，金属离子与蛋白质紧密结合，如锌指蛋白，对保持蛋白质肽链的正确折叠和三维结构的稳定起着重要的作用，但是金属离子的结合对蛋白质的功能影响很小[6]. 第三种，金属离子调节蛋白，例如钙调蛋白(calmodulin)，金属离子的结合能调节蛋白质的三维结构，从而引起蛋白质生物学功能的改变[7]. 还有其它一些金属离子应激蛋白，如一些依赖Mg2+, Zn2+的tRNA合成酶,在蛋白质的生物合成中起着重要的作用，与一些神经系统疾病，如帕金森症、老年痴呆症，以及一些朊病毒病相关. 但是这些金属离子与蛋白质相互作用的分子机理及作用位点大部分都没有得到明确的表征[3].确定金属离子蛋白上金属离子的结合位点，阐述金属离子结合引起的蛋白质三维结构和动力学的变化，对于深入理解金属离子在蛋白质发挥生物学功能过程中的作用和分子机制具有极其重要的意义. 作为研究生物大分子结构-功能关系的强有力的技术手段， NMR方法能够在原子水平上提供溶液中蛋白质的三维结构和动力学信息，是研究金属离子与蛋白质相互作用的最主要的技术之一，被广泛地用于探测抗磁或顺磁金属离子的结合位点和亲和力，分析相互作用机理，以及蛋白质在结合金属离子前后的三维结构和动力学的改变，以更深入地阐明蛋白质发挥生物学功能的结构基础和分子机制. NMR方法主要研究分子量相对较小的(Mw<4×104)、可溶性的蛋白质. 对更大分子量的蛋白质，通常由于谱峰展宽、谱峰重叠而限制了NMR方法的应用. 通过15N/13C/2H 同位素标记、异核多维NMR谱和TROSY等技术[8]，采用高场核磁共振谱仪(如800～900 MHz 谱仪)，在一定程度上可以缓解谱峰严重重叠的困难. 本文简要地介绍目前国际上用NMR方法研究抗磁金属离子和顺磁金属离子与蛋白质相互作用的进展[9]，并举例说明NMR在水母发光蛋白、钙调蛋白、锌指蛋白、朊病毒蛋白等研究中的应用.1 抗磁金属离子与蛋白质相互作用金属离子与蛋白质结合会引起蛋白质上金属离子结合部位氨基酸残基周围的化学环境发生变化，从而引起这些残基化学位移的改变，因此抗磁金属离子与蛋白质的结合位点可通过化学位移扰动方法(chemical shift perturbation) 测定[10-12]. 该方法采用抗磁金属离子滴定实验，逐步改变结合位点附近残基谱学参数(如化学位移，线宽等). 通过比较滴定过程中采集的2D 1H-15N HSQC 谱中谱峰的差异，确定结合位点. 如果自由态和结合态的蛋白质构象化学交换速率慢于两种状态下化学位移的差异(kex≤Δω)，则可以分别观测到两组共振信号，分别对应自由态和结合态. 在这种情况下，自由态和结合态蛋白的化学位移不随金属离子浓度的增加发生改变，但信号强度会相应地发生改变，由此可以测出金属离子结合蛋白的摩尔比例. 当自由态和结合态的蛋白质构象化学交换速率快于两种状态下化学位移的差异(kex≥Δω)，则只能观测到一组权重平均的化学位移信号，其化学位移数值与金属离子的浓度有关. 通过拟合金属离子浓度与蛋白质化学位移的变化曲线，可以计算出金属离子与蛋白质相互作用的解离常数Kd. 当自由态和结合态的蛋白质构象化学交换速率与两种状态下化学位移的差异相当(kex≈Δω)，则蛋白质结合位点上的残基谱峰会发生展宽，通过分析谱峰线形，可以确定结合位点并估算亲和力. 很多金属离子不能由NMR直接检测，因而化学位移扰动方法不能得到结合位点上这类金属离子的几何结构. 但也有一些金属离子，如 111/113Cd， 199Hg 或者109 Ag，能被NMR检测，在生物体系研究中非常有用[13]. 例如， 113Cd 的化学位移对与它结合的配体的种类、数目和几何排布都非常灵敏.除了蛋白质三维结构的变化，金属离子与蛋白质的结合还会引起蛋白质的动力学的变化，特别在金属离子结合位点附近蛋白质的柔性可能会明显改变. NMR弛豫测量方法能够在原子水平提供ps～ns时间尺度的分子内运动信息、 ms～μs时间尺度的构象化学交换信息[14,15]，而这正是很多酶反应的特征时间尺度. 分析蛋白质动力学的变化可以获取可以金属离子与蛋白质的结合位点信息，以加深对金属离子蛋白的生物学功能的理解[16]. 蛋白质骨架动力学信息可以通过测量骨架酰胺基团的R1、 R2弛豫速率以及异核{1H}-15N NOE 获得[17]；侧链动力学可以通过测量甲基基团的13C， 1H和2H 的弛豫速率获得[18,19]. 一般来说，纵向弛豫速率R1和异核{1H}-15N NOE只对ps～ns时间尺度的分子内运动敏感，而横向弛豫速率R2还对μs～ms时间尺度的构象化学交换运动敏感. 异核{1H}-15N NOE 往往被用来定性描述ps～ns时间尺度的分子内运动. 采用model-free方法[20,21]分析NMR弛豫实验数据，可以得到一些定量描述蛋白质动力学的物理参数：广义序参数S2，在ps～ns时间尺度描述化学键由于内运动带来的空间自由度，是内运动空间约束程度和内运动幅度的量度， S2 大，柔性小；内运动相关时间τe，在ps～ns时间尺度描述化学键的内运动，决定内运动的速率；构象交换速率Rex，在μs～ms时间尺度描述构象化学交换过程. 高柔性分子的弛豫数据往往不适合用model-free方法分析，但有可能用谱密度函数方法进行分析[22].2 顺磁金属离子与蛋白质相互作用与抗磁金属离子的NMR方法比较而言，顺磁金属离子的NMR方法没有被广泛利用，主要原因在于蛋白质结合顺磁金属离子后，金属离子核外壳层的非成对电子与周围的蛋白质分子内的原子核发生了很强的相互作用，剧烈地改变了蛋白质的化学位移和弛豫速率，使NMR谱发生较大的变化. 受影响最大的是顺磁金属离子附近的蛋白质共振谱峰，除了明显移动外，还可能因严重的展宽而变弱甚至消失，因此顺磁金属离子附近的氨基酸残基的三维结构用传统的NMR方法往往难以测定.顺磁金属离子引起蛋白质化学位移的变化来自抗磁贡献和顺磁贡献，后者来源于顺磁中心与周围的质子之间存在的两种相互作用： Fermi 接触相互作用，产生接触化学位移；偶极相互作用，产生赝接触化学位移[23]. 接触化学位移由蛋白质的原子核与金属离子的未成对电子通过化学键相互作用(through bond)引起的，属于标量耦合，仅在金属离子的几个键长范围内起作用. 这种标量耦合通常引起金属离子结合位点附近的原子核化学位移发生较大的变化. 赝接触化学位移由蛋白质原子核偶极矩与顺磁金属离子的未成对电子通过空间相互作用(through space)引起. 它能在金属离子附近更大的范围(直至3.5 nm)内产生影响. 蛋白质原子核的赝接触化学位移取决于原子核与金属离子的距离，因而被广泛地用来精修顺磁金属离子蛋白的溶液结构[24].顺磁金属离子蛋白的弛豫速率包含了金属离子的空间位置、几何结构和电子结构等信息. 这些信息主要由蛋白质原子核的磁偶极与金属离子的未成对电子的相互作用提供. 在顺磁金属离子蛋白中，观测核的弛豫速率Rio为：Rio=Rid+Rip i=1,2 (1)i=1， 2分别对应纵向和横横向弛豫速率. Rid对应抗磁金属离子弛豫速率； Rip 对应观测核与顺磁金属离子未成对电子相互作用引起观测核的弛豫速率的增大量. 当金属离子与蛋白质原子核相互作用仅为偶极相互作用时，由顺磁作用引起的纵向弛豫速率R1p和横向弛豫速率R2p项分别为[25]：式中μ0为真空磁导率， S为电子自旋量子数， ge为电子的g因子，μB为波尔磁子，γI为核自旋I的磁旋比， r为未成对电子与观测核间的距离. τc,1和τc,2为转动相关时间， R1e和R2e分别为纵向和横向电子弛豫速率，τr是金属离子蛋白复合物的转动重定向相关时间，均可通过NMR弛豫测量得到[26]. 从公式(2)和(3)可以看出，顺磁弛豫速率的增大与金属离子和蛋白质观测核之间的距离相关. 因此，通过测量多个蛋白质原子核的弛豫速率的增大量，可以确定顺磁金属离子与蛋白质的结合位点.横向弛豫速率的大小决定着NMR谱峰宽度. 由于R2p横向弛豫速率的影响，顺磁金属离子与蛋白质相互作用会引起蛋白质共振信号严重展宽. 靠近金属离子的蛋白质原子核的共振信号展宽甚至消失，因此，很难得到靠近顺磁金属离子的蛋白质原子核的几何结构信息. 例如，致癌蛋白oncomodulin(含109个氨基酸残基)，存在2个Ca2+结合位点，当把其中1个Ca2+用顺磁金属离子Tb3+替代后，2D 1H-15N HSQC 谱仅能检测到蛋白质中距离Tb3+1.6 nm范围外的1H-15N基团的共振信号. 近年来报道的13C直接检测技术可以提高顺磁金属离子周围的蛋白质原子核的“可观测”度[27,28]，获取顺磁金属离子蛋白活性位点附近结构信息. 由于13C核具有比1H核更低的旋磁比，因此，根据公式(3)可知13C核的线形展宽效应没有1H核严重，例如在上述的Tb3+替代的致癌蛋白oncomodulin 中，利用2D 13C-13C NOESY谱能检测蛋白质上距离金属离子0.8 nm之外的13C-13C信号[28].NMR谱峰的顺磁展宽表征着金属离子附近的蛋白质原子核的结构信息. 不同的顺磁金属离子有不同的谱峰展宽效应，因为谱峰展宽效应主要取决于顺磁金属离子的自旋弛豫速率. 例如， Cu2+离子有相对较慢的自旋弛豫速率，会引起蛋白质NMR谱峰的严重展宽；而Ni2+离子有相对较快的自旋弛豫速率，只引起微小的谱峰展宽[29]. 顺磁弛豫的影响使15N的弛豫速率难以解释，因此利用NMR方法研究顺磁金属离子蛋白骨架动力学有一定的困难,相关研究报道很少[30,31].3 用NMR方法研究金属离子与蛋白质相互作用的实例下面列举几个近年来报道的用NMR方法研究金属离子与蛋白质相互作用的例子，表明用NMR方法可以探测蛋白与金属离子的结合位点以及结合金属离子前后蛋白质的三维结构和动力学的改变.3.1 水母发光蛋白水母发光蛋白(aequorin)是从水母中分离出的一种通过在胞内结合Ca2+而发蓝光的蛋白，它具有典型的EF-hand钙调蛋白结构特征，已经被用作监测生物体内Ca2+浓度的探针. 水母发光蛋白含有4个EF-hand结构，其中3个能结合钙离子，但是只有2个对发光有作用. 它也能结合Mg2+，虽然Ca2+和Mg2+有相似的化学性质，但是水母发光蛋白结合镁离子后有不同的发光行为. 利用NMR化学位移扰动方法可以检测水母发光蛋白结合镁离子的生物学行为[32]. 分析图1所示的水母发光蛋白结合镁离子前后的各个氨基酸残基化学位移的变化，发现第1和第3个EF-hand区发生了很大的变化，而第2和第4个EF-hand区发生的变化较小，表明水母发光蛋白第1和第3个EF-hand 区对镁离子有较大的结合能力.图1 (a) 水母发光蛋白(aequorin)的三维结构图(PDB ID: 1EJ3)； (b) 水母发光蛋白结合镁离子前后的1H-15N HSQC叠加谱； (c) 水母发光蛋白结合镁离子前后的各个残基的化学位移变化[32]Fig.1 (a) Ribbon representation showing the three dimensional structure of aequorin (PDB ID: 1EJ3). (b) Superimposed1H-15N HSQC spectra of 15N-labeled aequorin in the presence and absence of Mg2+. (c) Absolute value differences of amide proton chemical shifts between Mg2+-free and Mg2+-bound aequorin[32]3.2 钙调蛋白钙调蛋白(calmodulin, CaM)是真核生物细胞中的胞质溶胶蛋白，钙调蛋白的外形类似哑铃, 有2个球形的末端, 中间被一个长而富有柔性的螺旋结构相连, 两端各有2个Ca2+ 结构域, 每个结构域可以结合1个Ca2+, 这样,一个钙调蛋白可以结合4个Ca2+ . 钙调蛋白结合Ca2+ 后构象相当稳定[33]. 在非刺激的细胞中，处于自由态的钙调蛋白(apo-CaM)与Ca2+ 的亲和力很低；而受刺激的细胞Ca2+浓度升高, Ca2+与钙调蛋白结合形成钙-钙调蛋白复合物(calcium-calmodulin complex, Ca2+- CaM)，并引起钙调蛋白构象的很大变化, 增强了钙调蛋白结合配体的亲和力. apo-CaM 和Ca2+-CaM 的三维结构[34,35]表明CaM 蛋白在结合钙离子后三维结构发生了很大的改变. 自由态的apo-CaM 蛋白形成一个非常紧密堆积的结构，呈“关闭”状态，亲水性残基位于蛋白表面，疏水性残基埋在内部；结合钙后， CaM蛋白结构变成“打开”状态，很多疏水性残基裸露出来，改变了4个α-螺旋的相对取向[36]，如图2所示.图2 (a) 钙调蛋白晶体结构[34]； (b) 钙调蛋白C-端溶液结构(上图浅灰色显示“打开”状态，下图深灰色显示“关闭”状态)[35]，黑色球状为钙离子； (c) 钙调蛋白的打开与闭合状态表面疏水性氨基酸残基排布图，各图中颜色相对较深的部分为疏水性氨基酸Fig.2 (a) The crystal structures of calmodulin[34]. (b) The solution NMR structure of the C-terminal domain of calmodulin, the open state is shown in the upper and the closed state in the lower[35]. (c) Hydrophobic residues on the surface of calmodulin both the open state (upper) and the closed state (lower)研究表明， CaM 在结合钙离子之前就存在“打开”与“闭合”两态平衡，主要倾向于“闭合”状态[37-39]. 当结合一个钙离子后，平衡倾向于“打开”状态. “打开”和“闭合”状态间的构象交换动力学已经用NMR方法进行了详细的研究[39]. 在3种不同温度下测得的15N NMR 动力学参数如图3所示，描述快速内运动的序参数表明除了loop区可能由于构象交换引起一定程度的结构无序外，CaM蛋白质整体仍处于有序折叠. 通过测量Rex和R2弛豫速率，可以研究“打开”和“闭合”两种状态. 状态间的构象交换过程，或者是Ca2+-CaM 与apo-CaM 之间的构象化学交换过程. 结合钙后，钙结合区无规卷曲(loops)的序参数变大，即ps～ns时间尺度上的骨架柔性降低. Rex在μs～ms时间尺度上描述“打开”与“闭合”状态之间的构象化学交换速率，可以看出，钙离子的结合几乎影响了CaM 的整个肽链的骨架柔性，几乎所有Ca2+残基都参与了构象化学交换过程.图3 (a) apo-E140Q钙调蛋白C端骨架动力学序参数[38]， (b) 结合钙后E140Q 钙调蛋白C端骨架动力学序参数， (c) 结合钙后E140Q钙调蛋白C端构象交换速率Rex. (b)中图中黑色条带代表α螺旋(E, F, G, H)，黑色弧线代表与钙结合的loops (III, IV). (c)中灰度从浅至深分别为18、 28和35℃下测得的弛豫数据[39]Fig.3 The backbone amide order parameters, S2, of the C-terminal domain of (a) apo-calmodulin[38], (b) calcium-loaded E140Q calmodulin, and (c) μs～ms exchange contributions Rex to 15N R2 rates of calcium-loaded E140Q calmodulin (lower panel). All data were obtained from 15N NMR[39]3.3 锌指蛋白有些金属离子蛋白即使在没有结合金属离子时仍然以天然折叠构象存在. 例如蓝铜蛋白azurin，其天然折叠构象含有一个金属离子结合位点，能够结合一个铜离子[40]，因此金属离子对这类蛋白质的正确折叠不起关键性的作用. 而锌指蛋白不一样，只有在结合锌离子之后，锌指蛋白才能折叠成正确的构象.目前研究最多的锌指蛋白是最先在TF IIIA 中发现的Cys2 His2型，它们在真核生物的转录因子中含量最丰富. Cys2 His2型锌指蛋白包含9个重复串联的30个氨基酸残基长度的序列: C-X2-4-C-X12-H-X3-5-H (其中C代表半胱氨酸, H代表组氨酸, X代表任何氨基酸) . 这个转录因子需要结合锌离子后再与DNA结合[41]. 这些序列在锌离子存在时折叠形成紧密的ββα结构,其中锌离子夹叠在α螺旋和两股反向平行的β 链中,锌离子与N端β链末端的两个半胱氨酸和α螺旋C端部分的两个组氨酸形成四面体结构. 锌离子的存在维持了锌指结构的稳定性，锌离子缺乏时锌指蛋白就不能形成折叠结构，锌指蛋白在释放锌离子后会丧失生理活性. 其它的二价金属离子，比如Cd2+、 Co2+、 Ni2+和 Fe2+也能结合锌指蛋白，但是结合能力很低[42]，对其结构的影响也较小. 图4为人源金属离子调节转录因子1在分别结合锌离子和镉离子情况下记录的1H-15N HSQC 谱[43]. 分析谱峰分散度可以看出，结合锌离子的蛋白结构变得更好，而结合镉离子的蛋白结构并不变好. 锌指蛋白移除锌离子后，其光谱特征会发生很大的变化，如圆二色(CD)光谱的椭圆率下降， 1H化学位移分散度减少. 当再加入锌后，结构松散的锌指蛋白能够重新折叠成天然球状结构. 也有一些锌指蛋白具有不一样的行为，例如锌指蛋白人源转录因子TFIIB，即使没有再加入锌时也能折叠成比较好的结构[44]；但是，加锌前后，距离金属离子结合位点较远区的蛋白质异核稳态NOE都有较大的变化，表明锌离子主要起着稳定蛋白质结构的作用.图4 人源金属调节转录因子1 (human metalloregulatory transcription factor-1) C-端锌指结合域在结合锌离子与结合镉离子情况下的1H-15N HSQC谱[43] Fig.4 Titration of 15N-Lys-labeled hMTF-zf46 as monitored by 1H-15N HSQC spectra. acquired as a function of added Zn(II) or Cd(II) as indicated[43]3.4 朊病毒蛋白朊病毒蛋白是人和动物中普遍存在的由正常细胞基因编码的产物,在正常状况下处于“细胞形态”(cellular form)，简称PrPC, 本身不能致病,而导致疾病的是处于“搔痒形态”(scrapie form)的朊病毒蛋白, 简称PrPSc. 这两种不同形态的蛋白质由同一基因编码, 具有完全相同的氨基酸序列, 没有共价修饰的区别,但三维结构的差异却很大, 导致相当不同的理化性质. PrPC主要由α螺旋组成, 表现为蛋白酶消化敏感性和水溶性，而PrPSc主要由β折叠片组成, 对蛋白酶消化具有显著的抵抗能力, 并能聚集成淀粉样的纤维杆状结构[45]. 目前人们对朊病毒病的致病机制还没有真正的了解,但是已经有大量的证据表明铜离子的结合对其生物学功能影响很大. 人们发现Cu2+-PrPC具有超氧歧化酶活性，推断朊病毒病的起因可能是抗氧化功能的丧失[46].为研究Cu2+对朊病毒功能的影响，人们用NMR方法研究了PrPC的Cu2+结合态的三维结构，发现PrPC的N端只有在结合二价铜离子后才会折叠成较好的三维结构. 利用NMR滴定实验以及铜离子的顺磁性质，确定了铜离子与PrPC (91～231)的结合位点. 逐渐增加铜离子的浓度，由于其顺磁性引起横向弛豫速率显著增大，谱峰展宽，造成1H-15N HSQC谱峰强度降低，由此得以确定Cu2+ 结合位点的残基[47]. 结果表明残基94～98, 108～114, 135～136, 153～159的谱峰强度发生了较大的改变，可能与铜离子结合有关，如图5所示.图5 加入250, 500， 750，1 000 μmol L-1 CuSO4后，人源PrPC 1H-15N HSQC谱峰强度与加CuSO4之前谱峰强度的比值的变化图[47]Fig.5 1H-15N HSQC peak intensities of human PrPC(91～231) at 250, 500, 750 and 1 000 μmol L-1 CuSO4 relative to those at 0 μmol L-1 CuSO4[47]最近， Gaggelli等通过测量纵向顺磁弛豫速率R1p的增大量，研究Cu2+与PrPC的106～126片段的结合[48]，如图6所示. 结果表明Cu2+主要与His111以及PrPC的N-端结合. 分析弛豫速率的增大量还能准确地提供结合位点的几何结构信息. 铜离子能通过偶极-偶极相互作用影响PrPC蛋白的自旋晶格弛豫速率，通过标量耦合影响PrPC蛋白的横向弛豫速率，因此，由顺磁离子引起的线型展宽可以确定参与相互作用的残基，而通过分析与顺磁相关的自旋-晶格弛豫速率R1p，可得到金属离子与残基上原子核之间的距离，作为距离约束进行结构计算. 由实验获得的铜离子与残基间的距离作为唯一的约束条件进行Cu2+-PrPC (106～126)复合物的结构建模，通过模拟退火计算出结构，与用能量最小化和分子动力学模拟分别计算得到的结构基本一致(图7).图6 人源PrPC(106～126)片段加入0.1当量Cu2+，顺磁贡献对自旋晶格弛豫速率R1p的影响[48]Fig.6 Paramagnetic contributions, R1p to spin-lattice relaxation rates of selected protons of PrPC(106～126)at 2 mmol L-1 inH2O in the presence of 0.1 equiv of Cu(II); pH 3.0, 298 K[48]图7 用NMR结构测定(深灰)、能量最小化(浅灰)以及分子动力学模拟(灰色)获得的Cu(II)-PrPC(106～126)片段的3个结构叠合图[48]Fig.7 Superposition ofCu2+ PrPC (106～126) structures obtained from experimental data(deep gray), from energy minimization (slight gray) and from molecular dynamics calculations (gary)[48]4 总结用NMR技术研究金属离子与蛋白质的相互作用，探测蛋白质与金属离子结合位点、三维结构和动力学的变化，加深我们对金属离子蛋白的了解. 这些研究工作表明，金属离子与蛋白质的相互作用既可以是高度专一性的、紧密的结合，也可以是瞬态的、松散的结合. 这些瞬态的相互作用也可能具有很大的生物学意义. 确定金属离子蛋白的结合位点、结合强度和相互作用机理，揭示其发挥生物学功能的结构基础，对阐明金属离子蛋白的作用机制是很有必要的. 作为蛋白质溶液构象最主要的技术手段， NMR方法在研究金属离子与蛋白质的相互作用方面具有明显的技术优势，不仅可以研究专一性的强相互作用，而且可以研究瞬态的弱相互作用；既可以研究抗磁金属离子蛋白，又可以研究顺磁金属离子蛋白. 更重要的是，NMR方法可以在原子的水平上探测蛋白质结合金属离子前后三维结构和动力学的变化，从而使我们更深入地理解金属离子对蛋白质发挥生物学功能的作用及其分子机制.参考文献:【相关文献】[1] Lu Y, Valentine J S. 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钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ在维拉帕米逆转肺腺癌顺铂化疗耐药中的作用刘淼;范平生;张腾跃;黄金;樊高飞;刘亚贝【摘要】目的探讨钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)在维拉帕米逆转肺腺癌顺铂化疗耐药中的作用.方法在肺腺癌细胞系(A549)中,采用CCK-8法检测维拉帕米逆转顺铂耐药的能力,采用流式细胞仪Annexin V-FITC/PI法检测维拉帕米逆转顺铂耐药中凋亡水平的效果,采用Western blotting检测逆转耐药过程中P-CaMKⅡ/CaMKⅡ蛋白表达水平的变化.结果在肺腺癌细胞系(A549)中,单药顺铂组、顺铂联合维拉帕米组的细胞增长抑制率分别为(55.00±2.60)％、(32.30±1.80)％,差异有统计学意义(P＜0.05).凋亡实验表明,单药顺铂组细胞凋亡率为10.30％,顺铂联合维拉帕米组为21.60％,差异有统计学意义(P＜0.05).Western blotting结果显示,在A549细胞中,顺铂联合维拉帕米组P-CaMKⅡ/CaMKⅡ的表达明显低于单药顺铂组.结论在肺腺癌细胞中,CaMKⅡ参与维拉帕米逆转化疗耐药的过程.【期刊名称】《实用临床医药杂志》【年(卷),期】2019(023)010【总页数】4页(P5-8)【关键词】肺腺癌;维拉帕米;顺铂;耐药性;钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ【作者】刘淼;范平生;张腾跃;黄金;樊高飞;刘亚贝【作者单位】安徽省肿瘤医院,中国科学技术大学附属第一医院,中国科学技术大学生命科学与医学部,安徽合肥,230000;安徽省肿瘤医院,中国科学技术大学附属第一医院,中国科学技术大学生命科学与医学部,安徽合肥,230000;安徽省肿瘤医院,中国科学技术大学附属第一医院,中国科学技术大学生命科学与医学部,安徽合肥,230000;安徽省肿瘤医院,中国科学技术大学附属第一医院,中国科学技术大学生命科学与医学部,安徽合肥,230000;安徽省肿瘤医院,中国科学技术大学附属第一医院,中国科学技术大学生命科学与医学部,安徽合肥,230000;安徽省肿瘤医院,中国科学技术大学附属第一医院,中国科学技术大学生命科学与医学部,安徽合肥,230000【正文语种】中文【中图分类】R734.2目前，早期肺癌仍缺乏有效的诊断手段，大多数肺癌患者初诊时已为中、晚期，错过了根治性治疗的机会[1]。
注射用重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基成品鉴别试验方法的建立1. 引言1.1 选题背景注射用重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基（recombinant human calcineurin B subunit, rhCNB）是一种重要的蛋白质药物，具有免疫抑制和抗白血病作用。
市面上存在大量的假冒伪劣产品，严重影响了患者的用药安全和疗效。
建立一种可靠的注射用重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基成品鉴别试验方法具有重要的临床意义。
目前，钙调蛋白磷酸酶B亚基成品的鉴别方法主要包括生化鉴定、免疫学检测和质量分析等多个方面。
由于假劣产品制造商采用了各种技术手段对产品进行伪装，传统的鉴别方法往往难以满足实际检测的需求。
有必要开展针对注射用重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基成品的新型鉴别试验方法的研究，以提高产品的质量控制水平，保障患者的用药安全。
【选题背景】1.2 研究意义重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基是一种重要的蛋白质，在生物学研究和临床医学中具有广泛的应用价值。
它在细胞信号传导、细胞分化和增殖等生物学过程中发挥着重要作用。
磷酸酶B亚基的异常表达或功能异常与多种疾病的发生及发展密切相关，如癌症、糖尿病、神经退行性疾病等。
研究注射用重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基成品的鉴别方法具有重要的临床意义和应用前景。
1.3 研究目的研究目的：建立注射用重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基成品鉴别试验方法，旨在为药品质量控制提供依据，确保药品的安全有效性。
通过对不同批次的药品进行鉴别试验，可以准确区分不同品种、规格的药品，减少药品交叉混淆的风险。
建立可靠的鉴别试验方法可以帮助监管部门监督药品市场，保障患者用药安全，提高药品质量管理水平。
研究的目的还在于丰富药品检验方法学理论，推动药品质量控制技术的进步，为药品安全提供更为可靠的技术支持。
通过本研究，期望能够为药品质量控制领域的科研工作提供新的思路和方法，推动该领域的发展和进步。
2. 正文2.1 相关理论重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基是一种重要的生物制剂，具有调节骨代谢和骨形成的作用。
生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：XX】实验目的：1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法5、了解柱层析技术实验原理：1、蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。
2、不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。
利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。
3、盐析法：盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。
蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。
中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。
4、离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。
5、醋酸纤维素薄膜电泳原理：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。
它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。
由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。
因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。
实验材料：人混合血清葡聚糖凝胶（G-25)层析柱DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液醋酸铵缓冲溶液 20%磺基水杨酸1%BaCl溶液氨基黑染色液2漂洗液 pH8.6巴比妥缓冲溶液电泳仪、电泳槽实验流程：盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定）实验步骤：（一）盐析+凝胶柱层析除盐：（二）离子交换层析（纯化）：（三）醋酸纤维素薄膜电泳：1、点样（如下图）：-点样线尽量点得细窄而均匀,宁少勿多2、电泳：①薄膜粗面向下②点样端置阴极端③两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平电压：110V时间：50min3、染色和漂洗：电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。
钙调蛋白、钙调蛋白激酶与癫痫癫痫的发病机制较为复杂，但是各种类型癫痫发作的共同病理基础是神经元的异常放电。
癫痫的每一次发作都包括起动、发作性放电的维持与扩展以及发作性放电的抑制3个不同而连续的病理生理过程，在这个过程中，脑内钙离子(Ca2+)的传导起重要作用。
Ca2+是一个功能活跃的2价阳离子，在调节神经元兴奋中起着重要作用。
细胞外的Ca2+一旦进入细胞内并达到一定浓度时，可以激活许多细胞生物学过程。
Ca2+也是中枢神经系统内发挥着重要的第二信使[3]的作用，通过Ca2+受体蛋白―钙调蛋白和钙调蛋白激酶系统激活细胞的多种功能。
1钙离子、钙离子通道与癫痫?钙离子与癫痫的关系已经肯定。
Ca2+内流在阵发性去极化漂移（paroxysmal depolarization shift，PDS）、神经元同步放电和抑制性突触后电位形成有关。
由于细胞内Ca2+浓度的调节机制（Ca2+通道、Ca2+结合蛋白）失控，Ca2+过度流入神经元，可以导致细胞毒性等一系列反应。
因此，Ca2+内流是癫痫发病的基本条件。
1.1在细胞水平上，癫痫的共同病理基础是神经元过度放电至于这种自发性放电，目前认为是短暂快速的Ca2+内流和缓慢Ca2+内流[4-5]引起的细胞去极化。
Badea[6]等用Ca2+成像的方法观察了神经元参与癫痫发作的情况，证实了Ca2+离子快速内流与细胞去极化有关。
当这种去极化达到一定程度就会触发Na+内流，从而爆发一系列迅速的去极化过程。
1.2癫痫发作需要众多的神经元同步放电，其放电是由突触介导的，先决条件是Ca2+内流在癫痫发作前，突触前末梢活性区域中的高电子密度颗粒实质上是一种Ca2+通道。
它为Ca2+进入细胞并促发癫痫发作提供条件。
在癫痫持续状态时，Ca2+也发挥作用。
一般认为，癫痫放电过程中，除了细胞膜快速去极化外，神经元还通过Na+-Ca2+交换、Ca2+泵、线粒体和内质网重新调整细胞内Ca2+浓度，在此基础上，新的Ca2+内流又开始。
蛋白质的提取及含量测定蛋白质的提取1.藻细胞破碎方法1.1反复冻融法：将藻细胞在20℃以下冰冻，再在4℃左右融解，反复3-4次，利用细胞内冰粒的形成和细胞液盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
在显微镜下观察计数细胞破碎率可达90%以上，将破碎的的藻细胞悬浊液于4000 r/min离心20 min，弃沉淀，上清液加入一定量的壳聚糖，浓度为10g/L，充分搅拌后，4℃静置12 h，离心，取上清液。
该法操作简单、方便，适用于实验室少量藻体材料的处理。
1.2溶胀法：直接用蒸馏水或低盐溶液浸泡藻体细胞，使其溶胀、破裂，释放出藻胆蛋白。
用15 g/ L N a N O3或1 0 m m o l / L CaCl2的浸泡效果好。
余九九等比较了液氮冻融法和超声波法后，认为采用蒸馏水或低浓度CaCl2溶液40℃条件下浸泡螺旋藻的提取方法效果较好。
但溶胀法提取周期较长，用蒸馏水要浸泡10 d，用低浓度CaCl2溶液也需浸泡3~4d。
1.3超声波法：运用超声波破碎藻体细胞的细胞壁，使藻胆蛋白溶出。
在80w的超声清洗仪中超声30min，以破坏藻细胞的细胞壁。
该法常作为藻胆蛋白提取中的辅助方法。
单纯用超声波来破碎藻体细胞壁是不够的，还必须与其它方法合用，以最大限度地破碎藻体细胞。
1.4组织捣碎法：将材料配成稀糊状液，用高速组织捣碎机来破碎藻体细胞。
实际操作中，上述几种方法经常混合使用，以最大限度地破碎藻体细胞，使藻胆蛋白溶出。
2.粗提方法2.1盐析法：取上述藻蛋白粗体液，加入25%梯度饱和硫酸铵溶液，4℃静置12 h，离心，离心，取上清液，追加至55%饱和度，4℃静置12 h，离心。
将2次盐析得到的粗体液置于5%硫酸铵饱和梯度中，4℃静置12 h，离心，取上清液，追加至35% 饱和度，4℃静置12h，离心。
将4次盐析得到的粗体液置于23%硫酸铵饱和梯度中，4℃静置12 h，离心，取上清液，追加35%饱和度，4℃静置12h，离心。
钙调蛋白神经保护作用的体外研究发表时间：2013-07-22T10:28:01.170Z 来源：《世界临床医学》2013年第2期供稿作者：刘宝莲[导读] 钙调蛋白是一种很重要的受体蛋白，它是15kD 的蛋白，几乎存在于一切真核细胞。
刘宝莲（山东省蒙阴县人民医院药剂科，山东蒙阴 276200）摘要：目的探讨钙调蛋白Calmodulin（CaM)神经保护的作用及相关机制。
方法0.32mM 异氟烷处理培养一周后的神经细胞12h，异氟烷处理前提前两天在培养基中加入钙调蛋白,将细胞随机分为溶剂对照组（control 组）、异氟烷处理组（iso 组）和异氟烷加钙调蛋白组（iso+ CaM 组），检测细胞的MTT，对细胞进行 Hoechst33258 荧光染色观察凋亡细胞并计数。
结果control 组的MTT 值明显高于iso组和iso+ CaM 组（P < 0.05）,凋亡细胞计数明显低于iso组和iso+ CaM 组（P< 0.05）；iso组MTT 值明显高于iso+ CaM（P < 0.05），凋亡细胞计数明显低于iso+ CaM（P < 0.05）。
结论0.96mM 的异氟烷处理2h 对小鼠的神经元产生了明显的毒性；钙调蛋白能明显减轻异氟烷的神经毒性。
关键词：钙调蛋白；异氟烷；原代培养；神经元中国图书资料分类号文献标识码钙调蛋白Calmodulin（CaM）是细胞内一种主要的Ca2+受体信号系统调控蛋白，CaM 能够激活钙调蛋白依赖性的PDE、钙神经素、钙调蛋白激酶CaM-Kinase(CaMKs)。
目前的研究发现钙调蛋白能够介导脑中CaMKs 磷酸化并调节大量的蛋白底物，CaMKs 在脑中含量极为丰富，CaMKs 能调节神经递质的释放，对神经系统中突触的形成和神经行为等方面有重要作用1 。
近年来的许多研究发现了吸入麻醉药异氟烷的神经毒性作用，特别是其对发育中的动物神经系统的影响 2 。
