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BMP在骨科领域中的临床应用研究进展作者：彭吾训龚跃昆李世和王鑫吴仕峰【关键词】骨科1965年Urist等［1］发现骨基质中含有能够诱导异位成骨的骨形态发生蛋白以后，研究者们经过大量动物实验和临床应用研究证实，BMP能够诱导间充质细胞不可逆地分化为骨、软骨、韧带、肌腱和神经组织。
基于BMP的安全性和高效诱导成骨活性被越来越多的实验所证实，在一些国家BMP 已进入大规模的临床实验阶段。
在骨科领域中，BMP的临床应用研究进展主要有以下几个方面。
1 治疗新鲜骨折鉴于临床上某些部位和某些严重骨折发生骨不连的比例较大，研究者们试图应用BMP的高效成骨活性，辅助治疗这种类型的新鲜骨折，以降低其骨不连的发生率。
关于BMP治疗新鲜胫骨骨折、股骨骨折、尺骨骨折和桡骨骨折的大量动物模型实验研究已经证实，BMP在治疗新鲜长骨骨折方面是安全有效的。
近年来，已有学者进行BMP治疗人新鲜长骨骨折的临床研究，1997年，Michael等［2］应用BMP复合Ⅰ型胶原和自体红骨髓治疗132例新鲜骨折，对照组117例以自体髂骨移植。
随访2年，试验组与对照组愈合率差异无显着性，但对照组术后感染率高于试验组，其余并发症差异无显着性。
试验组12例术后出现一过性血浆牛胶原抗体，但对伤口愈合和骨修复无明显影响。
他们认为:与自体髂骨移植相比，BMP复合Ⅰ型胶原和自体红骨髓治疗新鲜长骨骨折是安全有效的，并且缩短了手术时间和减少了术后感染。
美国创伤中心对12例开放性胫骨骨折患者采用rhBMP-2和可吸收胶原通过伤口导入，12例患者中的9例在6个月内骨折修复［3］。
最近，Tuvek TJ等报道了用rhBMP-2和可吸收胶原结合外固定器或髓内钉治疗12例开放性胫骨骨折患者，术后16周9例患者骨折愈合，3例患者需再次行骨移植术［4］。
目前，美国FDA已经批准将开放性胫骨骨折作为评价BMP的临床实验模型。
2 治疗骨缺损、骨不连骨缺损、骨不连是矫形外科棘手的难题之一。
力学刺激下BMP信号通路影响成骨分化的研究进展陈红;杜丽玲;张译文;刘东旭【摘要】Clinically, mechanical stimulation is an important factor in enhancing the bone regeneration and remodeling, and mechani-cally induced bone reconstruction is the critical biological basis of distraction osteogenesis, bone defect restoration and orthodontic tooth movement. BMPs, as the key signaling molecule in the regulation of bone development, play a significant role in the occurrence and re-generation of bone tissue. It has been shown that the activation of BMP signaling can promote the expression of osteogenic-related genes and induce bone formation. This paper will summary the research progress of BMP signaling pathway in mechanically induced osteogenic differentiation.%骨组织的再生和重塑涉及复杂的力学刺激,而机械性诱导骨改建是牵张成骨、骨缺损修复、正畸牙移动生物学的重要理论基础.骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)是调控骨骼发育的关键信号分子,在骨组织的发生及再生中起着重要作用.研究表明,激活BMP信号可增强成骨相关标志性基因的表达,促进骨形成.本文就力学刺激下参与骨向分化的BMP信号通路的相关研究进行综述.【期刊名称】《口腔医学》【年(卷),期】2017(037)002【总页数】4页(P162-165)【关键词】骨形态发生蛋白;成骨分化;机械应变【作者】陈红;杜丽玲;张译文;刘东旭【作者单位】山东大学口腔医院正畸科,山东济南 250012;山东大学口腔医院正畸科,山东济南 250012;山东大学口腔医院正畸科,山东济南 250012;山东大学口腔医院正畸科,山东济南 250012【正文语种】中文【中图分类】R783.1骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)是 Urist在1965年发现的一种能促进异位成骨的分泌型多功能蛋白。
骨形态发生蛋白9的研究进展骨形态发生蛋白9（BMP-9）是转化生长因子超家族的成员之一，已知BMP 家族中成骨活性最强的成员；Smad蛋白在其信号传导中起重要作用；BMP-9腺病毒为载体表现出强大成骨能力；BMP-9还具有促进原始神经元乙酰胆碱的合成，调节造血干细胞，降低血糖等作用。
标签：骨形态发生蛋白9；信号通路；成骨作用；腺病毒骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，简称BMPs）是转化生长因子（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族的成员之一，在人体内由肝脏合成并分泌，具有多种生物学功能，尤其是骨诱导能力，现已成为了医学界的研究热点，特别是为难以突破的骨缺损修复问题提供了新的治疗方法，现阶段BMP 家族中的BMP-2和BMP-7以被成功应用到临床治疗中，并取得了良好的效果。
BMP-9又称GDF2（growth differentiation factor 2），是已知BMP家族中成骨活性最强的成员，因其骨诱导活性不会受到免疫反应的较大抑制，故也是该家族中唯一能在有免疫能力的活体动物体内显著诱导骨形成的成员。
目前研究已证实，动物模型中BMP-9可有效地修复骨缺损。
现阶段BMP-9 的成骨机制、成骨作用、表达纯化方法、载体及支架材料的选择已经成为目前研究工作的热点和重点。
1基本特征BMP9（也称GDF-2，growth differentiation factor 2）是BMPs 中的一种，主要由肝脏分泌并完成表达，其免疫原性较低，通常不会引起免疫排斥反应，只具有轻微的免疫刺激能力。
BMP9从结构上看为高度保守的糖蛋白，对核酸酶以及胶原酶等大部分蛋白酶不敏感，只对胰蛋白酶和糜蛋白酶敏感。
现已经证实BMP9具有诱导和维持胚胎神经元的类胆碱分化、调节葡萄糖和脂肪酸代谢、调节体内铁的动态平衡等多种重要功能，BMP-9通常会以前体和二聚体的形式存在，其在结构上不含有第7保守半胱氨酸这一特点与绝大多数TGF-β超家族成员相区别[1-2]。
骨形态发生蛋白BMP与骨形成的研究进展1陈于东2陈锦平1义乌市中医院2浙江省人民医院1965年，Urist等人将脱钙牛骨基质植入皮下和肌内后发现能够诱导新骨形成，他们认为脱钙骨基质中存在能诱导骨生长的未知物质，称之为BMPs。
其后的研究表明BMPs是一组复合物，迄今为止，人们己经成功分离出了40余种这类蛋白质，而且通过DNA重组技术，人的9种不同的BMP （1-9）己经得到了清楚的解释。
Wozney等曾详细报道了BMP1、BMP2、BMP3的分子克隆和分子结构与活性的关系。
BMPs是一个重要的骨相关细胞因子家族，除BMP-1外均属于TGF-B超家族，可由间充质细胞、成骨细胞及软骨细胞产生。
BMPs家族的成员通过结合I型和II型丝氨酸2苏氨酸激酶受体发挥作用，BMPs是目前发现的唯一能在体内异位诱导化骨与软骨的细胞因子，能诱导未分化的间充质细胞分化为骨软骨母细胞并产生骨软骨基质，还能刺激成骨细胞和软骨细胞分化，在骨和软骨的生长和发育中起重要作用。
1 BMP-2的理化性质人类成熟的BMP-2是一种可溶的、低分子跨膜糖蛋白，分子量约为32Kd，包括N端疏水性分泌性引导序列、中间区域的前肽和C端成熟区。
具有活性的BMP-2分子是由两个相同亚基形成的二聚体，两个亚基之间以二硫键相连，它的C-端拥有七个高度同源性的半胱氨酸残基片段，其中六个半胱氨酸残基在多肽链内形成二硫键，依赖半胱氨酸二硫键维持特定构象并保持一定的生理活性，N-端的10个碱基序列是肝素的结合位点，与细胞外的肝素特异性结合，可影响BMP-2受体激活，并调节其生物活性。
Tabas等利用体细胞杂交株，用cDNA探针杂交技术确定了BMP-2基因定位于20p-12p。
2 内源性BMP来源BMP分布于各种动物的硬组织，且骨皮质含量高于骨松质，其它组织含量甚少，但内源性BMP 确切来源目前没有完整的结论，原位杂交分析和免疫组化研究发现BMP-2的mRNA可在骨组织和多种间充质组织中表达，如肢芽、心脏、和颌骨滤泡等，但BMP-2的mRNA在骨组织中表达水平比在其它组织高40倍。
不同来源的间充质干细胞治疗骨与软骨组织疾病的研究进展JIN Zhenxiong;TANG Dezhi;XIAO Yanhua【摘要】近年来,随着细胞和组织工程技术的发展,间充质干细胞广泛受到关注和研究,具有易分离获取、培养过程相对简单等优点,并且能够自我更新并分化成多种细胞类型,包括成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等,是较为理想的种子细胞.在骨髓间充质干细胞大量的研究基础上,脂肪、骨骼肌、滑膜等多种不同来源的间充质干细胞也广泛应用在骨及软骨组织的体内研究和体外研究中.虽然间充质干细胞在基础性研究方面取得了飞跃进展,但在临床推广应用干细胞治疗上还面临着诸多问题,如对间充质干细胞的分化机理尚不明确,对其定向分化无法进行精确调控,且存在诸多限制骨和软骨再生的几个因素,很大程度上影响治疗的效果,故仍需进一步深入研究.【期刊名称】《中国骨质疏松杂志》【年(卷),期】2019(025)006【总页数】6页(P858-862,879)【关键词】间充质干细胞;骨;软骨;干细胞治疗;组织修复【作者】JIN Zhenxiong;TANG Dezhi;XIAO Yanhua【作者单位】;;【正文语种】中文【中图分类】R336现如今，组织工程技术在骨和软骨、血管、神经、皮肤、肌腱韧带等组织工程领域得到迅速发展。
干细胞(stem cell)是一种未充分分化、尚不成熟的细胞，具有自我复制、再生、更新、多向分化等能力的细胞。
正是因为它的多分化能力和再生潜力使其大量应用于干细胞研究和再生医学中［1］。
干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类，成体干细胞又可根据其特定组织来源分为造血干细胞、骨髓及脂肪间充质干细胞、脐血干细胞等。
其中以骨髓及脂肪间充质干细胞在骨科应用较为广泛。
随着年龄的增长，身体健康的下降或其他因素的影响，内在再生潜能下降时，需要在创新疗法方面取得新的进展，因此基于细胞的修复策略已成为有希望的治疗策略［2］。
在正常情况下，它们保持静止状态。
兔骨髓基质干细胞的培养、鉴定及标记的实验研究摘要目的对兔骨髓基质干细胞的培养方法、鉴定及标记技术进行初步研究。
方法采用贴壁法培养幼年兔骨髓细胞，经反复传代细胞逐渐纯化，以流式细胞术检测细胞表面抗原。
以5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记骨髓基质干细胞，将骨髓基质干细胞注入兔脑内，2周后取脑作石蜡切片，进行免疫荧光染色。
结果通过贴壁法培养幼年兔骨髓细胞可获得较纯化的细胞，并能在体外长期培养。
CD31的阴性率为5.67%，CD34的阴性率为4.31%，CD45的阴性率为4.42%，CD44的阳性率为98.82%，CD71的阳性率为99.17%，CD90的阳性率为98.23%。
提示CD31、CD34、CD45 的结果为呈阴性，CD44、CD71、CD90的结果为阳性，BrdU能够掺DNA合成期的骨髓基质干细胞。
结论贴壁法可获得高纯度的骨髓基质干细胞，BrdU可作为骨髓基质干细胞体内示踪的理想标记物。
关键词骨髓基质干细胞；CD分子；5-溴脱氧尿嘧啶核苷【Abstract】Objective To briefly research culture，identification and mark of rabbit bone marrow stroma stem cells. Methods Bone marrow cells of young rabbits were cultured by adhesion method for purification by repeated passage，and cell surface antigen was detected by flow cytometry. Bone marrow stroma stem cells marked by 5-bromodeoxyuridine （BrdU）was injected into rabbit brain for immunofluorescent staining of brain paraffin section after 2 weeks. Results Bone marrow cells cultured by adhesion method provided purified cells suitable for long-term culture in vitro. CD31 had negative rate as 5.67%，CD34 had negative rate as 4.31%，CD45 had negative rate as 4.42%，CD44 had positive rate as 98.82%. CD71 had positive rate as 99.17%. CD90 had positive rate as 98.23%. CD31，CD34 and CD45 showed negative outcome，and CD44，CD71 and CD90 showed positive outcome. BrdU was suitable to be taken by bone marrow stroma stem cells in DNA synthesis. Conclusion Adhesion method provides bone marrow stroma stem cells with high purification，and BrdU can be used as ideal marker for in vivo tracking bone marrow stroma stem cells.【Key words】Bone marrow stroma stem cells；CD molecule；5-bromodeoxyuridine骨髓基质细胞是一种不具有造血功能的细胞，由于该细胞容易取材，并且可以体外扩增以及多向分化等优点，逐渐成为受到广泛研究[1-4]。
PEG/BMP-2转染兔骨髓间充质干细胞及其表达测定的开题报告一、研究背景及意义：骨髓间充质干细胞（BMSCs）作为一种重要的细胞来源，具有广泛的应用前景，包括修复骨组织缺损、治疗免疫性疾病和心血管病等。
近年来研究表明，BMSCs可通过基因转染进一步增强其在组织工程和再生医学中的应用。
其中，紫外激活的聚乙二醇（PEG）和骨形态发生蛋白2（BMP-2）是常用的基因载体。
PEG能够通过暴露于紫外线下后产生的极端亲疏水性改变，进而实现基因递送；BMP-2则可以促进BMSCs向成骨分化方向发展。
本研究旨在通过PEG/BMP-2转染兔BMSCs，并对转染效率及表达情况进行检测，为今后在骨组织再生修复方面提供一定的理论基础和实践经验。
二、研究内容和方法：1.构建基因转染体系。
将PEG和BMP-2克隆入质粒载体，并用文库筛选合适的转染载体。
经过体外菌落PCR、限制性内切酶酶切、测序等方法鉴定合格的质粒载体。
2.培养和鉴定BMSCs。
采集新鲜兔骨髓，将骨髓细胞分离培养至90%的汇聚度后进行CD29、CD44、CD90和CD45表面标记的流式细胞术检测，筛选并扩增BMSCs，存活性检测和细胞形态学观察。
3.基因载体转染。
将所筛选的质粒载体转染入BMSCs中，分别选用PEG及BMP-2载体分别转染，同时设置空白对照组和阴性对照组。
4.转染效率和表达测定。
利用聚合酶链式反应（PCR）、Western blot和免疫荧光技术等手段，对转染效率和表达情况进行检测。
三、预期研究结果：1.成功构建PEG/BMP-2转染体系。
2.成功分离出鉴定合格的BMSCs。
3.成功将PEG/BMP-2载体转染入BMSCs，有效提高BMSCs向成骨分化的能力。
4.成功检测转染效率和表达情况。
四、研究的价值与意义：本研究旨在探讨PEG/BMP-2基因转染方法对BMSCs向成骨分化方向的影响，对骨髓间充质干细胞的应用及组织修复和再生方面具有重要的理论和实践意义。
同种异体骨脱钙骨基质联合BMP修复兔桡骨骨缺损的实验研究万东东;姜文学;胡茂忠;范猛【摘要】目的:探讨异体脱钙骨基质(DBM)骨泥复合骨形态发生蛋白(BMP)修复家兔桡骨节段性骨缺损的作用.方法:日本大耳白兔54只,雌雄不限,随机分为3组,A组:空白组(缺损区不植入任何材料),B组:对照组(缺损区植入金世植骨灵),C组:实验组(缺损区植入DBM骨泥).建立家兔单侧桡骨骨缺损模型,采用同种异体骨DBM骨泥复合BMP进行修复,复合骨泥中加入骨胶原作为塑形剂,术后4、8、12周观察新骨生成情况,通过形态学、X线、组织学及计算机图像分析等观察指标,并与对照组及空白组进行比较,客观评价骨泥诱导成骨及骨缺损修复能力.结果:DBM与BMP 复合骨泥易根据骨缺损大小塑形,术中操作简单.术后A组骨缺损未获骨性修复,B、C组骨缺损均获得骨性愈合,且新骨面积测定显示B、C组间成骨速度无明显差异(P>0.05),比A组快(P<0.01).结论:异体DBM骨泥复合BMP具有良好的骨修复作用.【期刊名称】《天津医科大学学报》【年(卷),期】2009(015)003【总页数】4页(P485-488)【关键词】脱钙骨基质;骨形态发生蛋白;骨不连;兔【作者】万东东;姜文学;胡茂忠;范猛【作者单位】天津医科大学第一中心临床学院骨科,天津,300192;天津医科大学第一中心临床学院骨科,天津,300192;天津医科大学第一中心临床学院骨科,天津,300192;天津医科大学第一中心临床学院骨科,天津,300192【正文语种】中文【中图分类】医药卫生第 15 卷3 期2009 年 9 月天津医科大学学报JOURNAL OFTIANJINMEDICALUNIVERSITY Vol.15, No.3Sep.2009485同种异体骨脱钙骨基质联合 BMP 修复兔桡骨骨缺损的实验研究万东东，姜文学，胡茂忠，范猛(天津医科大学第一中心临床学院骨科，天津 300192) [摘要] 目的：探讨异体脱钙骨基质 (DBM) 骨泥复合骨形态发生蛋白(BMP) 修复家兔桡骨节段性骨缺损的作用。
在PLGA支架上的黏附、生长状况；X线摄像及组织切片染色等观察异位成骨情况。
1. 材料1.1主要仪器及材料：自动平衡离心机....................................................................上海医用分析仪器厂台式离心机............................................................................EPPENDOF（德国）低温台式离心机 ..................................................................EPPENDOF（日本）凝胶成像及分析系统 ..............................................................BIO-RAD（美国）紫外分光光度仪 ..............................................................................岛津（日本）紫外投射仪 ................................................................................UVITEC（英国）电泳系统....................................................................................BIO-RAD（美国）超净工作台 ..............................................................................THERMO（美国）电子恒温摇床 ..........................................................................THERMO（美国）电子分析天平 .......................................................METTLER TOLEDO（瑞典）JTT-5架盘药物天平.............................................................上海医用激光仪器厂恒温水箱................................................................................上海跃进医疗器械厂加样器 ..................................................................................EPPENDOF（德国）移液器......................................................................................SOCOREX（瑞士）DELTA 320pH计...................................................METTLER TOLEDO（瑞典）超低温冰箱................................................................................THERMO（美国）医用冰箱.......................................................................................SANYO（日本）磁力搅拌器 ......................................................................上海司乐仪器有限公司倒置荧光相差显微镜 ..................................................................NIKON（日本）电子显微摄像系统........................................................................NIKON（日本）液氮容器............................................................................成都金凤液氮容器公司压力蒸汽消毒器.................................................................HTRAYAMA（日本）电热鼓风干燥箱........................................................上海福玛实验设备有限公司CO2孵箱....................................................................................BIO-RAD（美国）Milli－Q Biocel超纯水系统lipore（美国）制冰机........................................................................................SCOTSMAN(美国) 流式细胞仪..........................................................BECTON DICKINSON（美国）酶标仪.......................................................................................TECAN（奥地利）扫描电镜...........................................................................................AMRAY(美国) 切缝包，骨穿针,肝素，等常规药品及材料。
1.2 菌株及质粒：菌株：E.coli DH5α(本实验室保存);质粒：pcDNABMP-9（重庆医科大学附属儿童医院康权博士构建并惠赠）；pIRES2-EGFP质粒（重庆医科大学康权博士馈赠）；1.3 主要试剂及配制:1.3.1 主要试剂：DMEM/F-12培养基GIBCO（美国）特级胎牛血清TBD（杭州四季青公司）青霉素华北制药股份有限公司链霉素华北制药股份有限公司HEPES SIGMA (美国)限制性内切酶Nhe I、Xho I NEB (美国)GenExtract TM质粒中量抽提无内毒素试剂盒道普生物科技（北京）胰蛋白酶SIGMA (美国)DMSO 华美公司Lipofectamine TM2000 INVITROGEN(美国)ALP测定试剂盒建成生物工程研究所(南京) PLGA材料岱罡科技有限公司（济南）其它常规试剂等。
1.3.2试剂配制：•细胞培养相关试剂DMEM①-F12培养液配制取1000ml消毒过的大烧杯，注入约800mml的消毒过的三蒸水，首先加DMEM/F12培养基一包，溶解后，再加5.0 g碳酸氢钠，加入HEPES10.0 g，加入葡萄糖3.0g，加入青霉素10万u（终浓度100u/ml），链霉素6.5万u（终浓度100u/ml），定容至1000ml后调PH值（7.0~7.2），在超净台上抽滤除菌，并分装至11个100ml 盐水瓶中，盖好瓶塞，用牛皮纸扎口，放在-20℃冰箱中保存备用。
每次使用取出一瓶，无菌条件下加入已分装的灭活胎牛血清10ml后使用。
解冻后的培养液用后置于4℃保存。
②血清将冻存的100ml优等特级胎牛血清先置于室温下3h使其自然融化，然后置于56℃水浴30min灭活补体；消毒25ml血清瓶5个，无菌条件下分装后-20℃冰箱保存备用。
③胰蛋白酶称取胰蛋白酶0.25g，然后再用消毒好的PBS液100ml溶解后抽滤，在无菌台上分装在消毒后的25ml血清瓶内，放于-20℃冰箱冻存。
④PBS（pH7.0~7.4）：取NaCl 8.0g，KCl 0.2g，无水Na2HPO41.2g，KH2PO40.2g，调pH值（7.0~7.4），三蒸水定容至1 L，抽滤分装至10个100ml盐水瓶中，盖好瓶塞，用牛皮纸扎口，120 ℃，20 min消毒，常温保存备用。
•DH5α细菌培养相关：①液体培养基的配制LB取精解蛋白胨5.0g，酵母浸出粉2.5g，氯化钠5.0g，溶于500ml三蒸水，用5mmolNaOH调PH值7.0；分装为100ml后120 ℃，20 min消毒；恒温水箱冷却至60 ℃，加入所需抗生素（kan，终浓度为50μg/l），再直接室温冷却；所有培养基4 ℃保存备用。
②固体培养基的配制及平板制作LB称取1.5g 琼脂粉（Agar），加入到上面所配置的100mlLB液体培养基中，溶解摇匀；120℃，20min消毒；立即置于60℃恒温水箱降温，半小时后；加入所需抗生素卡那霉素（Kan），轻轻摇匀；准备好φ10 cm塑料平板于消毒之超净台上；从水箱取出液态LB 固体培养基后，尽快转移至超净台，小心倒入预备各平板中，厚度约3mm左右；Agar凝固后立即倒扣平板，防止盖上之冷凝水污染培养基；3h 后用消毒纸巾小心抹去底盖冷凝水；扣好板盖，封口胶双层密封后4℃保存备用；③抗生素配配制卡那霉素（Kan）：三蒸水配制10mg/ml工作液；φ220nm滤纸过滤后避光保存；（使用前）取5ml（50mg）加入1000ml LB medium（或LB Agar）中；最终工作液浓度：50μg/ml 。
•电泳相关试剂①的配制（1L工作液）：TAETris 乙酸7.56g + EDTA 0.372g，三蒸水定容至1 L 备用；GSB②的配制：0.25％溴酚蓝（0.25g） + 40％蔗糖（40g），三蒸水定容至100ml 备用。
1.4实验动物：2~3月龄新西兰大白兔。
2. 方法2.1 MSCs的准备：2.1.1 MSCs的分离、培养：新西兰大白兔全麻，侧卧位，双后肢自然伸直、交叉，暴露下面后肢内侧胫骨平台，备皮，碘酒、75%酒精常规消毒，铺洞巾(洞巾孔洞应控制在lcm左右，以利于减少污染)，使用20ml的无菌注射器吸取0.1~0.2毫升含1000单位的肝素化生理盐水(使针道内壁肝素化，防止吸取粘稠骨髓时出现针道内的溶血)，于胫骨平台穿刺吸取骨髓。
