骨髓间充质干细胞培养讲稿

大鼠骨髓间充质干细胞的分离方法和培养摘要】目的：探索在体外培养和纯化SD大鼠的骨髓间充质干细胞（BMSCs）的方法。

方法：采用改良全骨髓贴壁方法，分离和纯化3～4周的大鼠BMSCs，镜下连续观察细胞的形态变化。

流式细胞仪鉴定其表面抗原CD11b、CD45和CD90的表达情况。

结果：原代培养的细胞呈圆形和梭形等，24小时后大部分细胞均贴壁。

8～10天可达80%～90%融合，纯化后传代周期为6～8天。

流式细胞术鉴定表明CD11b和CD45阴性，CD90阳性。

结论：改良全骨髓贴壁法可有效分离培养大鼠的骨髓间充质干细胞，是一种比较理想的分离培养方法。

【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养大鼠【中图分类号】R730.5 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）13-0026-02Rat bone marrow mesenchymal stem cells‘s separation methods and tocultivate Zou Jin. Hun an Vocational College of Science and Technology, Hu’nan Province, Changsha 410014, China; Li Ya. Hu’nan University of Chinese Medicine, Hunan Province, Changsha 410004, China; Yin Jin. The Centers for Disease Control and Prevention of Hu’nan, Hu’nan Provin ce, Changsha 410007, China【Abstract】Objective To explore the in vitro culture and purification of SD rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) method. Methods Using improved the whole bone marrow adherent method, separation and purification of rat (for 3 ～ 4 weeks )of BMSCs, microscopically continuous observation of cell morphology change. To identification cells surface antigen CD11b, CD45 and CD90 expression using flow cytometry. Results The original generation of cultured cells is circular and spindle,after 24 hours, most of the cells are attached. 8 ～ 10 days later, the fusion of up to 80% ～ 90%. After purification，extend the period is 6 ～ 8 days. Using flow cytometry assay, CD11b and CD45 were negative, CD90 is positive. Conclusions Improved the whole bone marrow adherent method, which can effectively the isolation and cultureof rat bone marrow mesenchymal stem cells, is an ideal method of cultivation.【Key words】Bone marrow mesenchymal stem cells; Cell culture; The rat骨髓间充质干细胞是中胚层来源的干细胞，是具有多向分化潜能的成体干细胞之一[1]。

兔的骨髓间充质干细胞提取1.1兔骨髓MSC的分离用3%戊巴比妥钠按1 mg/kg的剂量施以全身麻醉，另用1%利多卡因于手术部位施以局麻；无菌操作下于右胫骨上端内侧部用锐性穿刺锥于骨皮质上开出一直径约2～3 mm的孔，使通达髓腔；用18号硬膜外穿刺针接5 ml 注射器，内含3000 U/ml的肝素0.1 ml，沿骨皮质上的孔穿入髓腔，抽出骨髓血约2 ml；抽出的骨髓血用平衡液洗涤两次后，离心1800R 5 min；弃去上清液，沉淀用Ham f12-10%FBS培养液重新打匀；用灭菌的0.17 mol/L饱和NH4Cl溶液按1∶5的体积比加入已重新打匀的悬液中，4℃下保留10 min，取出再离心180×g，5 min；弃去上清后，以几滴平衡液再悬浮后，用细胞计数板作细胞计数，确认有核骨髓细胞量达106～107后，即可进行原代培养接种用。

1.2兔骨髓MSC的原代培养将经上述培养分离所得的有核骨髓细胞按每孔3×104个细胞的密度接种于6孔培养板内，加入Ham f-12培养液，于37℃，10% CO2条件下培养；于接种5 d后进行第1次换液，以后隔日换液。

每天随机抽取3只实验动物的MSC作细胞生长动力学分析，各取此三者的1个培养孔用0.25%胰酶-1 mmol/L EDTA液将贴壁细胞消化分离（37℃、3～5 min），并作贴壁细胞计数，直至贴壁细胞铺满整个培养孔的底部。

将此3个实验动物MSC每天的细胞计数取平均值，作原代细胞培养的生长曲线分析。

1.3兔骨髓MSC的传代培养原代培养一旦铺满整个培养孔的表面，即可用0.25%胰酶-1 mmol/L EDTA液将贴壁细胞消化分离（37℃、3～5 min），然后按1∶3的比例进行传代接种培养，并记为P1；传代培养过程中隔日换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满整个培养孔的底面。

再重复以上操作，用0.25%胰酶-1 mmol/L EDTA 液将贴壁细胞消化分离（37℃、3～5 min），并按1∶3的比例进行下一代传代接种培养，并记为P2，余类推。

骨髓间充质细胞共培养简介骨髓间充质细胞（MSCs）是一种具有多潜能的细胞群体，可以分化为多种成纤维细胞样细胞，如成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。

共培养是指将MSCs与其他类型的细胞一起培养，以模拟体内细胞间的相互作用。

通过骨髓间充质细胞共培养，可以研究细胞间的相互作用和信号传导，并探索细胞共培养在再生医学和组织工程领域的应用潜力。

MSCs与其他细胞共培养的优势1.促进细胞增殖：MSCs可以分泌多种生长因子和细胞因子，与其他细胞共培养可以促进细胞增殖并加速组织修复过程。

2.促进细胞分化：MSCs具有多向分化潜能，与特定类型的细胞共培养可以诱导MSCs定向分化为目标细胞类型，如骨细胞、软骨细胞等。

3.促进细胞功能：MSCs与其他细胞共培养可以促进细胞间的相互作用和信号传导，提高细胞的功能表现。

4.提高组织工程材料的生物相容性：将MSCs与生物材料一起培养可以提高材料的生物相容性和降低排异反应的风险。

骨髓间充质细胞共培养的方法1. 直接接触共培养直接接触共培养是将MSCs与其他细胞直接共同培养在同一培养基中。

这种方法可以促进细胞间的相互作用和信号传导，但也可能导致细胞间的竞争和影响。

2. 间接接触共培养间接接触共培养是将MSCs和其他细胞分别培养在不同的培养基中，但通过孔隙大小适中的隔离膜或转移液体的方式，使两种细胞之间可以相互影响。

这种方法可以减少细胞间的竞争，但信号传导可能不如直接接触共培养明确。

3. 三维共培养三维共培养是将MSCs和其他细胞培养在三维支架或基质中。

这种方法模拟了体内组织的三维结构和细胞间的相互作用，能够更真实地模拟体内环境。

MSCs与不同类型细胞的共培养研究1. MSCs与成骨细胞共培养研究通过将MSCs与成骨细胞共培养，可以促进骨细胞的增殖和功能表现，加速骨组织修复。

此外，MSCs还可以促进骨基质的形成和骨再生过程。

2. MSCs与软骨细胞共培养研究MSCs与软骨细胞共培养可以诱导MSCs向软骨细胞方向分化，促进软骨组织的再生和修复。

分离培养及鉴定骨髓间充质干细胞的方法探析论文分离培养及鉴定骨髓间充质干细胞的方法探析论文骨髓间充质干细胞（BMSCs）也被称为间质祖细胞，由于其巨大的增殖和多向分化潜能，被认为是再生医学、基因治疗和细胞治疗的理想种子来源，已被广泛进行研究[1-3].目前，BMSCs在动物实验和临床应用上取得了巨大的成果，在骨、软骨、肌腱、神经胶质修复、心脏疾病、心肌梗塞、肝脏损伤等方面取得了重大突破[4-6],并且可避免胚胎干细胞和异基因干细胞治疗所涉及的伦理道德和免疫排斥问题，有利于细胞移植。

但是骨髓中的BMSCs含量极少，约占骨髓全细胞的0.001%~0.010%[7];因此，需要在体外分离纯化、培养扩增来满足临床应用和实验研究。

研究表明，不同分离方法和首次换液方式对BMSCs的增殖培养有很大的影响[8].本试验通过观察2种不同分离方法和不同首次换液时间对兔BMSCs生物活性的影响，旨在建立一种有效的分离培养及鉴定BMSCs的方法，以便获得大量、高纯度、高活性、培养周期短的BMSCs,为下一步研究和临床实验提供基础。

1 材料与方法1.1实验动物1月龄雄性新西兰大耳白兔1只，由河南省实验动物中心提供。

1.2主要试剂和仪器胎牛血清（北京四季青）；DMEM-F12（Gibco）；胰蛋白酶（北京拜尔迪生物公司）；DMSO（Gibco）；红细胞裂解液（北京赛驰生物技术有限公司）；生物素标记山羊抗兔IgG、HRP标记链霉亲和素、DAB显色试剂盒、改良型苏木素（北京华肽先锋）；兔抗兔CD34、CD44、CD99抗体（北京博奥森）；封闭山羊血清（北京博奥森）。

HF151UV型CO2培养箱（Heal Force）；倒置显微镜（Leica）;800型离心机、85-2恒温磁力搅拌器：金坛市大地自动化仪器厂；数码相机：日本佳能IXUS 980IS;电子天平：METTLER TOLEDO AL104;超净工作台：AIR TECH;FX101-2型电热鼓风干燥箱：上海树立仪器仪表有限公司；pH计：上海雷磁仪器厂。

骨髓间充质细胞共培养
骨髓间充质细胞（BMSCs）是一种多能干细胞，具有广泛的分化潜能和免疫调节作用。

BMSCs可以通过共培养的方式与其他细胞相互作用，从而影响它们的生长、分化和功能。

共培养是指将两种或更多种不同类型的细胞放在同一培养皿中，让它们相互作用。

BMSCs与其他细胞的共培养可以通过直接接触或间接接触的方式进行。

直接接触是指BMSCs与其他细胞直接接触，而间接接触是指BMSCs释放的细胞因子通过介质传递到其他细胞中。

BMSCs与其他细胞的共培养可以产生多种效应。

首先，BMSCs可以促进其他细胞的增殖和分化。

例如，BMSCs与神经元的共培养可以促进神经元的生长和分化，从而有助于神经再生和修复。

其次，BMSCs可以调节其他细胞的免疫反应。

BMSCs可以通过释放细胞因子来抑制其他细胞的免疫反应，从而减轻炎症和自身免疫性疾病等疾病的症状。

此外，BMSCs还可以促进其他细胞的代谢和功能。

例如，BMSCs与心肌细胞的共培养可以促进心肌细胞的代谢和收缩功能，从而有助于心脏功能的恢复。

BMSCs与其他细胞的共培养是一种重要的细胞学研究方法，可以用于研究细胞间相互作用的机制，以及开发新的细胞治疗方法。

未来，我们可以进一步探索BMSCs与其他细胞的共培养的机制和效应，以期为临床治疗提供更有效的细胞治疗策略。

中国组织工程研究与临床康复 第15卷 第10期 2011–03–05出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research March 5, 2011 Vol.15, No.10ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH1721Department of TraumaticOrthopaedics and Hand Surgery, First Affiliated Hospital, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, ChinaLi Xiao-feng ★, Master, Attending physician, Department of TraumaticOrthopaedics and Hand Surgery, First Affiliated Hospital, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China xiaofengli74@ Correspondence to: Zhao Jin-m in, Doctor, Professor, Department of TraumaticOrthopaedics and Hand Surgery, First Affiliated Hospital, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Chinazhaojinmin@Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No. 30860078*; Key Science andTechnology Program by HealthDepartment of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 200636*Received: 2010-12-27 Accepted: 2011-01-26大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定**★李晓峰，赵劲民，苏 伟，崔向荣，罗世兴，马爱国Culture and identification of rat bone marrow mesenchymal stem cellsLi Xiao-feng, Zhao Jin-min, Su Wei, Cui Xiang-rong, Luo Shi-xing, Ma Ai-guo Abstract Li XF, Zhao JM, Su Wei, Cui XR, Luo SX, Ma AG. Culture and identification of rat bone marrow mesenchymal stem cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(10): 1721-1725. [ ]摘要 李晓峰，赵劲民，苏伟，崔向荣，罗世兴，马爱国. 大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15(10):1721-1725. [ ]0 引言骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells ，BMSCs)具有多向分化潜能，能促进间充质组织的再生，如：骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪及基质等组织[1]。

小鼠骨髓间充质干细胞培养目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。

密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。

随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。

实验准备：1实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g。

2实验材料与试剂高糖DMEM培养基，胎牛血清，双抗（青霉素钠，链霉素），培养皿，镊子，眼科剪，止血钳，1mL注射器操作步骤1、小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取预冷的培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，冲洗液直接收集在插在冰上的离心管中，1500rpm离心5分钟，弃上清，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬细胞，接种于培养皿中（一只小鼠种一个60mm的培养皿），置于5�2，37℃，培养过夜，吸出上清，用PBS洗两遍，洗掉未贴壁的细胞，加入新鲜的培养液，继续培养。

以后每两天换液1次，并观察细胞形态。

待细胞长至80%-85%时传代（1传2）2、原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。

传代后细胞生长迅速。

采用贴壁培养法可获得足够数量、生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。

一种药用级间充质干细胞及其培养方法《一种药用级间充质干细胞及其培养方法》嘿，宝子们！今天我就像个怀揣着绝世秘籍的大侠一样，来给你们唠唠这个药用级间充质干细胞及其培养方法。

这可就像是培育超级小战士一样，特别有趣呢！首先呢，咱们得先有细胞的来源。

这就好比你要组建一支军队，得先找到合适的兵源。

间充质干细胞可以从好多地方来，比如说骨髓啦，脂肪组织啦。

我可跟你们说啊，就像我之前有一次，想从骨髓里取细胞，那感觉就像是在挖掘宝藏一样。

骨髓可是个好地方，里面藏着好多能成为“超级战士”的细胞种子呢。

不过取的时候可得小心点，就像你在挖宝藏的时候，不能把宝藏盒子给弄坏了。

这个过程要在非常严格的医疗环境下进行哦，就像超级特工执行任务，容不得一点马虎。

拿到细胞源之后呢，咱们就要开始分离细胞了。

这一步就像是把混在一起的各种小豆子分开，只留下咱们想要的那种豆子。

要用专门的试剂，就像魔法药水一样，把间充质干细胞从其他细胞里分离出来。

我记得我刚开始做的时候，看着那些试剂滴进细胞溶液里，就像看着魔法在施展，心里紧张得很，想着可千万别把我的“小战士”给变没了。

这个步骤要特别注意试剂的量，多了少了都不行，就像做菜放盐，多了太咸，少了没味。

接下来就是培养的环境了。

这就像是给咱们的“小战士”盖房子，要给他们一个舒服的家才能茁壮成长。

培养皿就是他们的小家啦，里面要放上特制的培养液。

这个培养液啊，那可是细胞的“营养大餐”，里面各种营养成分就像各种美味菜肴一样。

我有时候就想，这些细胞吃着这么好的“饭菜”，肯定能长得壮壮的。

温度也很重要，要保持在一个很合适的温度，就像咱们人住在房子里，温度得适宜，不能太热也不能太冷，不然细胞就像咱们人一样会生病的，那可就麻烦了。

然后就是细胞的传代培养啦。

当细胞在“小家”里住得满满当当的时候，就像房子住不下了，咱们就得给它们换个更大的房子。

这个时候要把细胞按照一定的比例分到新的培养皿里，这比例可得算好了，就像分蛋糕一样，每个人都得有合适的份额。

间充质干细胞培养步骤一、间充质干细胞的简单介绍间充质干细胞可是超级神奇的哟。

它们就像是身体里的小工匠，可以分化成好多不同类型的细胞呢，在医学研究和治疗领域那可是大明星。

所以学会培养它们是一件超酷的事情。

二、培养间充质干细胞的前期准备1. 细胞来源我们得先有间充质干细胞的来源呀。

可以从骨髓、脂肪组织或者脐带血这些地方获取呢。

骨髓就像是一个细胞的大仓库，从这里获取细胞就像从仓库里挑选宝贝一样。

脂肪组织也很棒，它里面的间充质干细胞数量还不少呢。

脐带血里的间充质干细胞就更厉害了，年轻又有活力。

2. 培养设备和试剂我们需要一个超级干净的培养箱，这个培养箱就像是间充质干细胞的小房子，温度、湿度还有二氧化碳浓度都要调好。

就像我们住房子，环境舒服了才开心嘛。

还有培养皿，这是细胞生长的小床，要选质量好的哦。

试剂方面，培养基是必不可少的，这是细胞的食物呢。

血清也很重要，就像给细胞加个营养包。

三、间充质干细胞的具体培养步骤1. 组织处理如果是从骨髓或者脂肪组织获取的细胞，我们要先把组织处理一下。

比如说从骨髓中抽取出来后，要先过滤掉一些杂质，就像淘米把沙子去掉一样。

把组织切成小块，然后用特殊的酶去消化，这样就能把细胞从组织里释放出来啦。

2. 细胞接种把处理好的细胞接种到培养皿里。

这个过程要很小心，就像把小种子种到土里一样。

要控制好细胞的密度，不能太挤也不能太稀。

太挤了细胞就像住在小房子里的人太多，会不舒服；太稀了又会觉得孤单，不利于生长呢。

3. 培养条件设置前面提到的培养箱的温度要设置在37摄氏度左右，这是间充质干细胞最喜欢的温度啦。

湿度一般保持在95%左右，二氧化碳浓度大概是5%。

这些条件就像给细胞创造了一个温馨的小世界。

4. 细胞观察与换液要经常去看看细胞长得怎么样了。

就像照顾小宠物一样，每天都要关心一下。

如果发现培养基变黄了，那就是细胞的“排泄物”太多啦，要及时换液。

换液的时候也要小心，不能把细胞弄伤了。

5. 细胞传代当细胞长满了培养皿，就像小房间住不下了，就要进行传代啦。