小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定发表时间：2012-05-24T09:50:06.677Z 来源：《医药前沿》2012年第1期供稿作者：林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3[导读] 分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。
林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3( 1 福建医科大学省立医院临床学院血液科福建福州 3 5 0 0 0 1 )( 2 福建省立医院检验科福建福州 3 5 0 0 0 1 )( 3 福州大学生物工程学院福建福州 3 5 0 0 0 1 )【摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。
方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。
结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。
传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。
传至10代仍具有良好的增殖活性。
流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。
结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。
【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。
1 材料和方法1.1 材料1.1.1 实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g，购于吴氏动物实验中心。
1.1.2 实验仪器与试剂低糖DMEM培养基（Gibco公司），特级胎牛血清（Hy c l o ne公司），胰蛋白酶（Si gma公司），青霉素钠（Si gma公司），链霉素（Si g m a公司），5%C O2培养箱（日本三洋公司），流式细胞仪(BD FA CSCalibur)，倒置显微镜（OLYMPUS），大鼠抗小鼠单克隆抗体：CD29-PE、CD44-FITC、CD34-PE、CD45-FITC（BD公司）。
1.2 方法1.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于装有P BS溶液的培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，移入装有预冷的含10%特级胎牛血清、青霉素钠100U/ml、链霉素0.1g/L 的低糖DMEM培养液的培养皿中，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，收集冲洗液，反复吹打使细胞打散，静置10分钟，小心将上清移至灭菌的10m l离心管中，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-D M EM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，调整细胞密度为5×105个/ml接种于25cm2培养瓶中，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中培养4小时后，轻轻吸出上清，并加入新鲜培养液。
培养24小时后轻轻吹打，使未贴壁的细胞悬浮，吸出上清，加入新鲜的培养液，继续培养。
以后每天换液1次，并观察细胞形态。
1.2.2 小鼠骨髓间充质干细胞的传代培养原代细胞生长接近瓶底的80%时，吸去上清，加入0.125%胰蛋白酶，37℃条件下消化并观察细胞形态，待细胞呈球形、不在粘连时吸弃胰酶，加入新鲜培养液重悬细胞，4℃3000r pm离心3分钟，弃上清，再加入培养液重悬细胞，反复吹打混匀，按1:2比例接种到新的培养瓶，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中继续培养，仍然每天换液，直至细胞贴壁融合成片，接近瓶底80%时，重复以上操作，再次传代。
1.2.3 小鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定收获第4代及第8代生长良好的细胞，胰酶消化后，4℃1000r p m离心5分钟，弃上清，PBS洗涤细胞2次，每代细胞分别设2管，调节每管细胞数为5×105,分别加入C D29和C D44、CD34和CD45单抗，室温孵育30分钟，PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪检测分析，同时用PBS作为一抗设置阴性对照。
2 结果2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及扩增培养4小时后吸出上清，加入新鲜培养液后，大多数悬浮细胞被吸出，瓶中细胞数目明显减少，并且都呈现球转，折光率较强，原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂（图1），随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片（图2）。
传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。
传至10代仍具有良好的增殖活性。
2.2 小鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45（图3、4），但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%（图5、6）。
3 讨论间充质干细胞主要来源于骨髓，可分化为骨髓基质细胞，分泌多种基质分子（如纤维粘连蛋白、胶原蛋白、蛋白聚糖等），还可分泌多种造血生长因子、趋化因子，抑制T淋巴细胞增殖，具有支持造血，促进造血干细胞移植后造血功能恢复、预防和减轻移植后的移植物抗宿主病的潜能[2,4]，实验研究表明，MS Cs在促进植入和免疫抑制效应的强度与剂量有关[5]但MS C s在体内含量极少，因此，对其进行分离、纯化和扩增显得极为重要。
目前，MS Cs的分离技术和方法主要有贴壁法、流式细胞仪分离法、密度梯度离心法、免疫磁珠法。
应用流式细胞仪分离和免疫磁珠法可以得到纯度较高的细胞，但对细胞的活性影响较大，甚至导致细胞完全失去活性，且方法复杂；使用pe r c o ll分离液进行密度梯度离心，能有效将间充质干细胞分离出来，但常导致分离得到的单个核细胞数量较少，不利于接种后细胞的生长。
贴壁法是骨髓间充质干细胞最初的分离培养方法，至今仍是一种得到广泛应用的经典途径[6,7]。
本实验采用贴壁培养法，直到培养第7天开始观察到细胞分裂，与文献报道[7,8]第3-5天即可出现明显分裂增殖相比所需时间长，可能与培养4小时后吸出上清，瓶中细胞数目明显减少有关，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，再次证实接种培养时要注意保持培养瓶内有一定的细胞密度，密度太低，不利于细胞生长。
培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。
传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。
与文献报道所需时间相仿[7,8]，传至10代仍具有良好的增殖活性。
提示本研究采用的培养基、早期换液及此后的每天换液培养方式可以满足体外培养下MS C s快速生长的要求，为进一步实验提供足够数量的MSCs。
研究表明骨髓MSCs不表达Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原、碱性磷酸酶或骨桥蛋白等与分化相关的标志，也不表达CD14、C D34、C D45、H L A-DR等造血干细胞的表面标志，但表达SH2、SH3、CD29、CD44、CD106、CD90等。
因此，BMSCs表面标志物具有非单一性的特性，目前对BMSCs主要是通过其形态学特征和多种表面标志相结合来进行鉴定[9]本实验应用流式细胞仪对培养的第4代、第8代细胞的CD34、CD45、CD29、CD44等4个表面抗原进行了鉴定，均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%，提示随着传代的增加，细胞纯度增加，达90%以上，可以满足进一步实验要求。
综上所述，采用贴壁培养法可获得足够数量、生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。
参考文献[1]Quirici N ,Sologo D, Bossalasco P,et al.Isolation of bone marrow cells by anti-nervegrowth factor receptor antibodies[J].Exp Hematol, 2005,30:783-791.[2]宋一雪，王军，陈虎。
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