下载文档原格式
以琳固定化青霉素酰化酶由于β-内酰胺类抗生素（β-lactam antibiotics）广谱的抗菌作用，使得这类抗生素在临床上得到了广泛的应用。
随着各类青霉素衍生物：如苄青霉素（Benzylpenicillin）、阿莫西林（Amoxicillin）、福米西林（formidacillin）等在医疗上的广泛应用，半合成（semisynthetic)β-内酰胺母核的需求量已经超过了青霉素。
目前PGA 主要用于水解青霉素G生成6-氨基青霉烷酸（6-APA）及苯乙酸，然后催化母核和不同的侧链间的合成反应生成半合成的β－内酰胺类抗生素，生物催化合成半合成的β－内酰胺类抗生素在工艺要求、产率、经济效益及环保方面都优于化学法，因此人们在这一方面进行了深入和细致的研究。
早在50 年代初就有人发现，黄青霉Q176（PenicillinmChrysoyeumn）和米曲霉（Aspergillus.oryzae）中存在水解青霉素成为6-APA的酶，即青霉素酰化酶（Penicillin acylase）青霉素G 酰化酶主要有两种来源，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，其中四种来源于革兰氏阴性菌的PGA（大肠杆菌青霉素酰化酶、类粪产碱杆菌青霉素酰化酶、雷氏普罗威登斯菌青霉素酰化酶、克莱博氏菌青霉素酰化酶）已经克隆到大肠杆菌中进行了重组表达,并测定了序列。
青霉素酰化酶根据其底物的专一性不同，可分为三种：（1）优先水解青霉素G 的叫青霉素G 酰化酶（PGA），（2）优先水解青霉素V的叫青霉素V 酰化酶（PVA），（3）专一水解氨苄西林的氨苄青霉素酰化酶。
青霉素是一种胞内酶，PGA由α，β亚基组成，PGA 的两亚基通过轻键作用结合在一起。
单独的α亚基和β亚基均不具有酶的活性，只有当两者以适当的形式结合后才具有活性。
PGA的α亚基与青霉素的侧链结合，决定酶的底物专一性；β亚基包含催化位点以及与催化有关的残基。
固定化青霉素G酰化酶本产品大肠基因工程菌发酵产生，通过分离、纯化，然后以共价键的形式结合到多孔性颗粒状高分子聚合物载体上，制成的固定化酶使用稳定性好，酶蛋白不易脱落。
一、实验目的1. 了解酶固定化的原理和方法。
2. 掌握酶固定化过程中的关键步骤。
3. 分析固定化酶的性能及其影响因素。
二、实验原理酶固定化是将酶固定在固体载体上，使其在反应过程中保持活性，便于重复使用。
固定化酶具有以下优点：1. 提高酶的稳定性，延长酶的使用寿命。
2. 降低酶的生产成本，提高生产效率。
3. 方便酶的分离和回收，减少环境污染。
三、实验材料1. 酶：青霉素酰化酶（PGA）2. 固定化载体：海藻酸钠、明胶、壳聚糖等3. 试剂：NaCl、CaCl2、HCl、NaOH、磷酸盐缓冲液等4. 仪器：恒温水浴、pH计、分光光度计、移液器、离心机等四、实验步骤1. 酶的活化将青霉素酰化酶溶于磷酸盐缓冲液，调节pH值为7.0，在37℃下活化30分钟。
2. 载体的准备将海藻酸钠、明胶、壳聚糖等载体分别溶解于磷酸盐缓冲液中，制备成浓度为1%的溶液。
3. 酶的固定化将活化后的酶与载体溶液混合，搅拌混合均匀。
将混合液滴入CaCl2溶液中，使酶与载体形成凝胶珠。
4. 固定化酶的洗涤用磷酸盐缓冲液反复洗涤固定化酶凝胶珠，去除未固定的酶和杂质。
5. 固定化酶的活化将洗涤后的固定化酶凝胶珠放入磷酸盐缓冲液中，在37℃下活化30分钟。
6. 酶活性的测定采用比色法测定固定化酶的活性。
以青霉素G为底物，在37℃下反应30分钟，用紫外分光光度计测定反应液中的青霉素G浓度，计算酶活性。
7. 固定化酶的稳定性测试将固定化酶凝胶珠分别在不同温度、pH值、离子强度等条件下进行稳定性测试。
五、实验结果与分析1. 酶的固定化效果通过比色法测定，固定化酶的活性与游离酶活性相近，表明固定化过程未对酶活性产生显著影响。
2. 固定化酶的稳定性固定化酶在不同温度、pH值、离子强度等条件下均表现出良好的稳定性，表明固定化酶具有良好的耐温、耐酸碱、耐盐等性能。
3. 固定化酶的重复使用性固定化酶经过多次反应和洗涤后，仍保持较高的酶活性，表明固定化酶具有良好的重复使用性。
青霉素酰化酶的固定化与应用新进展在如今医疗体系发展的过程中，青霉素酰化酶已经被广泛的使用到了抗生素制备体系中，以及一些多肽合成体系中。
高效的青霉素酰化酶使用，能够最大限度的提升酶本身在PH值、溶剂极性、温度等各个方面适用效果大幅度提高，这实际上已经成为了青霉素酰化酶在如今工业体系中应用的关键。
本篇文章着重针对青霉素酰化酶的固定化以及应用进展进行了全面详细的探讨。
标签：青霉素酰化酶；载体；固定化；反应介质；固定化酶的应用青霉素酰化酶本身在实际使用的过程中，呈现出了良好的溶剂记性使用想以及反复使用的多方面稳定效果，由于这一特性的存在，使得青霉素酰化酶已经成为了工业体系的关键梭子啊。
下文主要是从载体选择固化以及应用的进展上来进行了全面详细的探讨。
1、载体形式1. 1有机高分子载体有机载体本身在实际使用的过程中，实际上具备了极为优秀的机械性强度，同时也完全可以通过产业化形式进行生产，天然性质的高分子载体在实际运行的过程过程中，表现出了极为优秀的传质性能、无毒性，被广泛使用到了壳聚糖、甲壳素之中。
由于其本身呈现出的有机分子有着较高的强度，但是在传质性能较差的情况下，例如聚丙烯酰胺、聚乙烯醇等一列的物质。
而从相关的研究结果来看，在针对高密度环氧结构体系下的载体固定，使用青霉素酰化酶执行了相应的处理之后又，催化活力所表现出的相关游离酶在这一过程中大幅度的提高，并且呈现出的重复使用稳定性也极强。
1.2无机分子载体在如今材料学持续发展的过程中，已经涌现出了孔分子筛形式的载体，其本身能够有效的对于高稳定的固化酶进行制备处理。
在使用了无机载体执行表面修饰以及酶固定的相关措施之后，其本身所表现出的相关性能实际上必然能够有较大幅度的提升。
某小组在进行课题研究的过程中，曾直接使用表面氨基形式的介孔二氧化硅材料，来针对青霉素酰化酶加以固定处理，其中呈现出的活力实际上直接达到了90%及以上，特别是在循环使用10次的催化处理之后，其中所表现出的活力实际上依然是维持在94%的水平上。
青霉素G酰化酶在磁性复合载体上的固定化及其酶学性质屈冠群;曹雪荣;王雷;薛屏【摘要】利用凝胶-溶胶方法对磁性Fe3O4微粒表面进行功能化修饰,制备了表面含氨丙基的磁性复合载体,并通过戊二醛交联制备固定化青霉素G酰化酶(PGA).结果表明,在37℃时,固定化酶水解青霉素G钾盐,制备6-氨基青霉烷酸的表观活性为1 886 IU/g,表观米氏常数K'm＝140 mmol/L,最大反应速度Vmax＝0.45 mmol/min,水解反应最佳温度T＝50℃,最佳pH=7.0～8.0.固定化酶具有一定的热稳定性和耐酸碱性,在pH＝6.0～9.0且T＜50℃时活性稳定.固定化酶经10次间歇操作使用,可保持初始催化活性的82%.%The magnetic composite support with a saturation magnetization value of 27.2 A · m2 · kg-1 was prepared via the sol-gel.The amino groups existing on the magnetic composite carrier could couple penicillin G acylase (PGA) by cross-linking with glutaraldehyde to form the immobilized enzyme.The catalytic performances of the immobilized PGA for hydrolyzing penicillin G potassium to produce6aminopenicillanic acid were studied.The apparent activity of the immobilized PGA was 1886 IU/g.The optimal temperature and the optimal pH were 50 ℃ and 7.0～8.0 for the hydrolysis reaction, respectively.The apparent Michaelis constant K'm and Vmax of the immobilized PGA were 240 mmol/L and 0.45 mmol/min, respectively.It was found that the thermal stability and the durability on acidic or basic medium of PGA immobilized the magnetic composite support increased greatly compared with those of the free enzyme, and its activity keeps 82.0％ of its original activity afterused 10 cycles.The immobilized PGA can be sedimentated fleetly in magnetic field and separated facilely from the product in applications.【期刊名称】《宁夏大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2011(032)001【总页数】5页(P57-61)【关键词】磁性复合载体;固定化青霉素G酰化酶;催化活性;酶学性质【作者】屈冠群;曹雪荣;王雷;薛屏【作者单位】宁夏大学能源化工自治区重点实验室,宁夏银川,750021;宁夏大学能源化工自治区重点实验室,宁夏银川,750021;宁夏大学能源化工自治区重点实验室,宁夏银川,750021;宁夏大学能源化工自治区重点实验室,宁夏银川,750021【正文语种】中文【中图分类】O6436－氨基青霉烷酸（6－APA）是生产各种半合成青霉素的关键中间体.利用固定化青霉素G酰化酶（penicillin G acylase，PGA）催化水解青霉素G制备6－氨基青霉烷酸，反应条件温和，产率高，同时避免了毒性物质的使用，因而受到了广泛的关注［1—3］.然而，可溶性酶直接用于催化过程，酶与产物难以分离且不可重复使用，造成使用成本较高.因此，青霉素酰化酶的固定化技术一直是酶工业化应用领域研究的重要课题.无机载体用于青霉素酰化酶的固定化，其突出的优势是载体材料可以重复使用，不存在材料的后处理问题.近年来，介孔分子筛材料固定化青霉素酰化酶的研究受到了广泛重视［4—5］，该材料通过物理吸附制备的固定化酶再活性高，但操作稳定差，其原因是使用过程中酶分子出现脱落［6］.笔者用溶胶－凝胶方法将无定形SiO2包裹于Fe3O4纳米粒子表面，用3－氨丙基三乙氧基硅烷硅与SiO2硅羟基反应制得表面含氨丙基磁性复合载体，再利用戊二醛交联获得了共价键结合的固定化青霉素G酰化酶，并研究了氨丙基磁性复合载体对青霉素G酰化酶的固定化作用和固定酶的酶学性质.结果表明，磁性载体制备的固定化酶，在磁场的作用下能够快速从反应体系中分离、回收［7—8］，因而操作过程易实现自动化控制.1 实验1.1 试剂与仪器青霉素G酰化酶（PGA，1 062IU／mL，浙江顺风海德尔公司）；青霉素G钾盐（PGK，河北制药厂）；考马斯亮蓝（G－250，国药集团化学试剂有限公司）；3－氨基丙基三乙氧基硅烷（美国Acros公司，优级纯）；正硅酸乙酯（上海化学试剂厂，分析纯）；FeCl2·4H2O（上海化学试剂厂，分析纯）；FeCl3· 6H2O （天津瑞金特化学品有限公司，分析纯），其他试剂均为分析纯.D／Max－2200PC X－射线粉末衍射仪（日本RigaKu公司）；JSM－6360LV扫描电子显微镜（日本JEOL公司）；7304振动样品磁强计（美国Lake Shore公司）.1.2 氨丙基磁性复合载体的制备Fe3O4磁粉的制备采用共沉淀法.将0.43g FeCl2·4H2O和1.18g FeCl3·6H2O置于100mL的三口瓶中，加入20mL去离子水进行溶解.搅拌下滴入φ＝28%浓氨水至溶液的pH＝9，水浴加热至90℃熟化2h，磁场下分离出固体产物Fe3O4.Fe3O4用去离子水洗至淋洗液为中性，60℃真空干燥12h.取0.5g上述Fe3O4磁粉，装入盛有30mL无水乙醇的三颈烧瓶中进行超声处理，使Fe3O4在无水乙醇中得到充分分散；20min后滴入3.0mL浓氨水并在超声波中分散10min.然后将三颈烧瓶转移至40℃恒温水浴槽中，逐滴加入2.42mL正硅酸乙酯，此时体系中有溶胶形成；机械搅拌30min，加入0.28mL 3－氨基丙基三乙氧基硅烷，此时溶胶在60℃下熟化2h形成凝胶.磁场中分离出固体，用去离子水洗涤后于60℃真空干燥12h，得到氨丙基磁性复合载体，用NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4表示.1.3 固定化酶的制备和水解活性的测定取0.1g干态磁性复合载体，用去离子水润湿，加入4.60mL用pH＝7.8的磷酸盐缓冲溶液稀释的青霉素G酰化酶溶液和0.2mLφ＝25%的戊二醛，于30℃水浴摇床中振荡72h.磁场中分离出固定化酶，收集溶液，并用考马斯亮蓝染色法测定其中的酶蛋白量.固定化酶用pH＝7.8磷酸盐缓冲溶液洗涤至用考马斯亮蓝G－250检测洗涤液中无蛋白质成分.固定化酶存于4℃冰箱中备用，用PGA／NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4表示.固定化酶装入25mL 37℃恒温的反应器中，加入2mL pH＝7.8的磷酸盐缓冲溶液和8mL去离子水，测定起始溶液的pH值.搅拌速度为150r／min下，将恒温37℃的10mL w＝4%的青霉素G钾盐水溶液移入反应器，pH计监测下用标准NaOH溶液滴定水解产生的苯乙酸，使反应体系的pH＝7.8.记录反应前10min所消耗NaOH溶液（c＝0.100 1mol／L）的体积，以每分钟催化青霉素G水解生成1μmol的6－APA所需的酶量定义为一个单位（IU）.固定化酶的表观活性AIME （IU／g）［9］为式中：cNaOH为NaOH的浓度（mol／L）；VNaOH为消耗NaOH的体积（mL）；m为载体干质量（g）；t为反应时间（min）.固定化酶的活力回收率RIME（%）：1.4 固定化酶操作稳定性考察用间歇操作方式考察固定化酶的操作稳定性，每次反应的底物均为0.400g.将0.200g NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4固定化酶装入37℃循环水加热的间歇式反应器中，加入pH＝7.8的磷酸盐缓冲溶液后，将37℃溶有0.400g青霉素G钾盐的水溶液加入反应器，滴入0.100 1mol／L的NaOH溶液，控制反应体系的pH＝7.8，直到反应液的pH值在1min内不再发生变化时终止反应.准确记录反应进行的时间和所消耗NaOH溶液的体积.每次反应后，固定化酶用磷酸盐缓冲溶液洗涤后，再次装入反应器，重复使用10次.2 结果与讨论2.1 磁性复合载体的结构表征磁性复合载体NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4的X－射线粉末衍射图（XRD）见图1.由图1可知，载体中Fe3O4粒子的结晶状态很好，其（311），（220），（400）和（440）等晶面衍射峰峰形尖锐，且各衍射峰的2θ与Fe3O4衍射峰的峰位相一致.图中2θ在20°～28°出现了宽化的衍射峰，这是无定形SiO2的衍射峰，说明NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4复合载体表面存在SiO2包层.制备过程中正硅酸乙酯和3－氨基丙基三乙氧基硅烷在Fe3O4粒子表面发生了水解和缩合反应，说明在Fe3O4粒子表面形成了SiO2包层的同时，氨丙基基团移植于磁性复合载体表面.图1 复合载体的XRD图扫描电子显微镜观察磁性复合载体NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4的形貌见图2.由图2可知，载体是由粒径接近100nm的粒子组成，颗粒之间有团聚和粘连.磁性测定结果表明，制备的Fe3O4和NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4均具有超顺磁性能，即在外磁场存在下有磁性，外磁场撤除时磁性消失.制备的Fe3O4饱和磁化强度为66.2A·m2／kg，功能化NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4的饱和磁强度为27.2A·m2／kg.NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4的磁响应强度高于磁性聚合载体［10］，在外加磁场存在作用下，其能够被很好地磁化，制备的固定化酶极易从反应溶液中的分离.图2 NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4的SEM照片NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4复合载体含有氨基，其可以与醛中的羰基发生亲核加成反应生成席夫碱（Schiff base）.戊二醛分子中含有两个醛基，它们分别与载体上的氨丙基和酶分子中的氨基发生Schiff反应，使酶分子与载体形成共价结合（图3），从而实现青霉素G酰化酶的固定化，固定化酶的活力回收率为42%.37℃下制备的固定化酶PGA／NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4水解青霉素G钾盐的表观活性为1 866IU／g，呈现出高的催化活性.图3 NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4上戊二醛交联固定酶的示意图2.2 水解反应的最适pH值与温度酶的催化活性受反应体系pH值的影响很大，溶液的酸碱性可以改变酶活性中心有关基团的解离状态，同时还会影响底物的解离及反应体系中其他成份的解离，大大影响酶催化反应速度.固定反应温度为37℃，磁性固定化酶PGA／NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4用于催化水解青霉素G钾制备6－氨基青霉烷酸（6－APA），以不同pH值的磷酸盐缓冲溶液配制w＝2%的底物溶液，绘制pH值与活性关系曲线（图4，图中数据取3次实验的平均值）.由图4可知，固定化酶的最适pH＝7.0～8.0，游离酶水解反应的最适pH＝8.0.与游离酶相比，固定化酶对反应体系的pH值变化不敏感，在较宽的pH值范围内均具有高的催化活性.固定pH＝7.8，固定化酶PGA／NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4和游离酶PGA水解青霉素G的催化活性与反应温度之间的关系如图5所示.由图5可知，固定化酶和游离酶水解反应的最适温度不一致，前者为50℃，后者为45℃；同时，在低温（20～45℃）时，固定化酶活性下降幅度高于游离酶；在较高温度（50～55℃）时，固定化酶的活性比较稳定，而游离酶的活性迅速下降，在55℃反应时，前者保留最高活性的97.0%，而后者仅为51.6%.固定化酶在较高的反应温度下具有较好的催化活性，这有利于其工业化应用.图4 介质pH值对催化活性的影响图5 反应温度对催化活性的影响2.3 表观米氏常数与最大反应速度的测定以不同浓度的青霉素G钾盐溶液作底物，在37℃下测定固定化酶和游离酶对其水解的初速度的影响.以底物浓度的倒数为横坐标，反应初速度的倒数为纵坐标，做Lineweaver－Burk图［11］，研究PGA／NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4的酶学行为（图6）.由图6数据可以计算出，游离酶的米氏常数Km＝8.2mmol／L，最大反应速度vmax＝1.02mmol／min，PGA／NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4固定化酶的表观米氏常数K′m＝240mmol／L，vmax＝0.47mmol／min.固定化酶的表观米氏常数高于游离酶，说明固定化酶对底物的亲和力小于游离酶，这可能是在固定化酶的周围形成了能与底物产生立体影响的扩散层所造成的.图6 固定化酶和游离酶的Lineweaver－Burk图2.4 固定化酶的稳定性固定化青霉素酰化酶用于水解青霉素G钾盐，除生成6－APA外，同时还有酸性较强的苯乙酸生成.工业上通过滴入一定浓度的碱溶液来控制反应体系的pH值，但在实际操作中，反应体系的pH值时常会出现过高或过低的现象，这就要求固定化酶对酸碱有一定的稳定性.将1mL原酶液和0.2g固定化青霉素酰化酶分别置于0.1mol／L不同pH值的磷酸盐缓冲溶液中，于30℃水浴中恒温24h.游离酶用0.1mol／L pH＝7.8磷酸盐缓冲溶液调节溶液pH＝7.8，用碱滴定法测定37℃下水解2%青霉素G钾的活性.固定化酶先用pH＝7.8磷酸盐缓冲溶液洗涤后再测活性（图7）.结果表明，PGA固定于NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4磁性载体，在pH值为6.0～9.0的介质中放置24h后，其表观活性保持在初始活性的90%以上，固定化酶对酸碱的稳定性优于游离酶.图7 固定化酶和游离酶对酸碱的稳定性将固定化酶和游离酶分别置于0.1mol／L pH＝7.8的磷酸缓冲溶液中，在不同温度保温2h后，测定它们的水解活性（图8）.由图8可知，PGA固定于NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4载体，热稳定性有显著的提高，在20～40℃经2h保温处理后，表观活性没有出现衰减，经45℃2h热处理后，活性有所下降，但下降幅度远小于游离酶，经60℃2h热处理后，固定酶仍保持其初始活性的66%；而游离酶的活性已基本丧失了.PGA经NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4固定化后热稳定性得到了大幅度的提高，可能是由于酶分子通过戊二醛与载体上氨丙基共价结合，增强了酶构型的牢固程度，当处于热处理环境时，酶蛋白分子的展开受到阻碍，导致酶活性中心的破坏大大减少.固定化酶的操作稳定性在很大程度上反映了固定化载体性能的优劣，它是决定固定化载体能否工业化应用最为关键的因素之一.采用碱滴定操作工艺考察固定化酶的操作稳定性，每次水解青霉素G钾盐为0.400g，结果见图9.图8 固定化酶和游离酶的热稳定性由图9可知，PGA／NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4经连续10次间歇操作使用，催化活性有所下降.经第5次重复使用后，活性下降幅度减小且趋于稳定，在第10次使用后，表观活性为初始活性的82.0%.图9 固定化酶的使用稳定性3 结论NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4磁性复合载体固定青霉素G酰化酶，酶与载体共价结合.固定化酶水解青霉素G钾盐制备6－氨基青霉烷酸的活性达1 886IU／g，且酶的热稳定性和耐酸碱性均得到明显的增强.固定化酶PGA／NH2－（CH2）3－SiO2－Fe3O4在磁场的作用下，能够快速有效地与产物分离，且在使用过程中不出现流失现象.参考文献：［1］ WANG Zhilong，WANG Li，XU Jianhe，et al.Enzymatic hydrolysis of penicillin G to 6－aminopenicillanic acid in cloud point system with discrete countercurrent experiment［J］.Enzyme and Micro Technol，2007，41（1／2）：121－126.［2］张业旺，谭强，刘瑞江，等.青霉素酰化酶制备6－APA的研究进展［J］.中国抗生素杂志，2008，33（7）：385－389.［3］周成，王安明，王华，等.青霉素酰化酶的固定化与应用新进展［J］.中国抗生素杂志，2008，33（5）：257－262.［4］LÜYongjun，GUO Yianglong，WANG Yanqin，et al.Immobilized penicillin G acylase on mesoporous silica：The influence of pore size，pore volume and mesophases［J］.Microporous Mesoporous Materials，2008，114（1／3）：507－510.［5］ XUE Ping，XU Fang，XU Lidong.Epoxy－functionalized mesostructured cellular Foams as effective support for covalent immobilization of penicillin G acylase［J］.Appl Surf Science，2008，255（5）：1625－1630.［6］薛屏.Co－MCM－48和Co－MCM－41介孔分子筛对青霉素酰化酶的固定化作用［J］.宁夏大学学报：自然科学版，2006，27（3）：243－247.［7］ NAGAO D，YOKOYAMA M，SAEKI S，et al.Pareparation of composite particles with magnetic silica core and fluorescent polymer shell ［J］.Colloid Polym Sci，2008，286（8／9）：959－964.［8］ SEN T，SEBASTIANELLI A，BRUCE J I.Mesoporous Silca－Magnetite nanocomposite：Fabrication and Applications in Magnetic Bioseparations ［J］.J Am Chem Soc，2006，128（22）：7130－7131.［9］ XUE Ping，LU Guanzhong，GUO Yanglong，et al.A novel support of MCM－48molecular sieve for immobilization of penicillin G asylase［J］.J Mol Catal B：Enzym，2004，30（2）：75－81.［10］ XUE Ping，SONG Xiaodan，CAO Xuerong.An efficient synthesis of ampicillin on magnetically separable immobilized penicillin G acylase ［J］.Chin Chem Lett，2010，21（4）：765－768.［11］韩辉，徐冠珠.颗粒状固定化青霉素酰化酶的研究［J］.微生物学报，2001，41（2）：204－208.。
作者：周成王安明王华杜志强祝社民杨明张俊沈树宝【摘要】青霉素酰化酶被广泛应用于半合成抗生素及中间体的制备、手性药物的拆分和多肽合成等方面。
高效固定青霉素酰化酶能提高酶对温度、ph值、溶剂极性等方面的适用性和反复使用的稳定性，将成为拓宽青霉素酰化酶在工业中应用的必然选择和关键。
本文主要介绍了青霉素酰化酶固定化技术的进展，讨论了不同固定化技术的特点和固定化酶在非水相体系中的催化作用，并展望了固定化青霉素酰化酶的发展前景。
【关键词】青霉素酰化酶；载体；固定化；反应介质；固定化酶的应用1 固定化的载体有效固定是固定化青霉素酰化酶的核心技术，载体的材料选择与制备是技术的关键。
性能优越的载体能提高固定化酶的催化性能，降低酶法生产成本。
1.1 有机高分子载体有机载体具有较好的机械强度且已产业化。
天然有机高分子载体无毒性、传质性能好，常用甲壳素和壳聚糖［2］。
合成的有机高分子强度大，但传质较差，如聚乙烯醇［3］和聚丙烯酰胺［4］等。
mateo等［5］选用ep sepabeads类高密度环氧结构的载体固定青霉素酰化酶，过程如图1所示。
pasini等［6］研究eupergit c载体固定化酶，催化活力较游离酶明显增加，重复使用稳定性好。
1.2 无机分子载体随着材料学的迅速发展，出现了具有多维孔道结构介孔分子筛的载体，可制备高活性高稳定性的固定化酶。
何静等［7］报道的介孔分子筛mcm 41具有高比表面积、较小扩散阻力的特点，可吸附固定，也可利用载体表面醛基与酶蛋白的氨基相互反应共价连接。
roger等［8］实验表明mcm 41载体的孔径(3～3.5nm)明显小于青霉素酰化酶尺寸(7nm×5nm×5nm)，载体可大部分与酶以吸附形式固定。
roger等研究了硅载体通过交联剂与酶共价固定的过程，如图2所示。
此硅载体孔径较大，固定化酶的干酶活力达110bpug-1，活力回收80%，热稳定性明显优于eupergit c固定化酶。
薛屏等［9］以mcm 48介孔分子筛为载体，固定青霉素酶12h，相对活力65.10%；肖清贵等［10］研制的中空硅微管载体，负载率和活力回收分图1 青霉素酰化酶与高密度环氧载体共价结合过程别为97.20%和88.80%；bernardino等［11］研制的磁性硅载体可减少扩散阻力，便于催化剂分离回收；王卫等［12］研究的磁性环氧颗粒载体最适ph和温度分别为8.5和45℃，交联密度为30%，固定化酶经使用80次仍保持94.2%的催化活力。
采取对无机载体先表面修饰再与酶固定的方法，性能有很大提高。
本课题组曾采用表面氨基的介孔二氧化硅固定青霉素酰化酶［13］，相对活力达90%以上，循环使用10次后催化活力仍保持初始条件的94%。
此外选用介孔泡沫硅(mcfs)载体固定青霉素酰化酶，制得的mcfs载体［14，15］经电镜检测，颗粒表面密集分布大量孔道，孔径较大呈泡沫状。
由bet法计算得到mcfs的比表面积为331.43m2/g。
由bjh公式计算得到的孔体积及平均孔径分别为2.16cm3/g和26nm。
固定化酶负载率约95%，催化活力最高达200u/mg以上，载体性能较好。
1.3 复合载体有机载体和无机载体各有优势。
有研究立足于结合这两种材质的载体，改进材料的性能，如针对壳聚糖颗粒机械强度不够和比表面积不大的缺点，用无机多孔材料硅藻土在低压下强化吸附壳聚糖以固定青霉素酰化酶，优化机械强度，固定化酶性能得到提高［16］。
2 青霉素酰化酶的固定化方法固定方法的选择是酶与载体固定过程的关键步骤。
载体固定通常有吸附法、包埋法和共价偶联法；无载体固定法常用无载体交联酶和交联酶聚集体两种，不同固定化方法优缺点如表1所示。
2.1 载体固定法吸附法通过载体表面与酶表面次级键互相作用固定，可分为物理吸附和离子吸附。
物理吸附要求载体表面对蛋白质有高吸附性。
离子吸附是利用酶解离状态图2 带氨基的硅载体与青霉素酰化酶共价固定的过程表1 不同固定方法的原理及优缺点分类方法优点缺点文献载体固定法吸附法条件温和，操作简便酶负载强度低，易失活［17］包埋法酶本身不参与结合，简单易行扩散阻力问题，酶包埋中易失活［18］共价偶联法具有良好的稳定性酶活损失很大［19］无载体固定法无载体交联酶(clecs)酶载容量较高，利于底物扩散产物分离。
在合成中能获得较高反应速率，晶体颗粒小，在高剪切力和液体运输下具有良好的机械稳定性和化学稳定性。
比固定化酶制备过程复杂［8，20］交联酶聚集体(cleas)避免耗时纯化，酶不易破坏可回收使用，催化水解重复20批次可保持100%活力。
半合成抗生素产率高。
对于较大分子量的酶形成聚集体效果不佳［21～26］下与载体的电荷正负相吸原理固定酶。
包埋法［18］将酶包埋进载体孔径内固定，酶本身并不参与结合。
共价偶联法是利用酶的非必需侧链基团与载体的功能基团形成稳定的共价键而固定。
本课题采用mcfs载体、交联剂对苯醌和青霉素酰化酶共价结合，经0.1mol/l nacl 溶液洗涤后，固定化酶负载率和酶活与未洗涤的固定化酶相比没有明显下降，证明载体mcfs 与青霉素酰化酶是共价而非吸附固定。
2.2 无载体固定法(1)交联酶晶体(clecs) 晶体晶格中蛋白质浓度接近理论极限，浓缩的蛋白形成晶体，通过戊二醛等多功能试剂将酶永久交联，分子中静电反应和疏水反应数量增加，明显增强了蛋白质的稳定性。
交联酶晶体可用于多肽合成、酶传感器、化妆品和洗涤剂等需要高稳定性和高活性蛋白质的领域，应用前景广泛。
(2)交联酶聚集体(cleas) cleas的活性和稳定性可与clecs相媲美。
在cleas制备中，浓缩的酶蛋白会发生物理聚集而形成超分子结构，加入无机盐、有机溶剂或其他大分子试剂可使其聚集体沉淀析出，能保持酶的三维构象和活性。
再用多功能交联剂将该酶聚集体交联捆绑形成cleas。
cleas催化的高效转化率和高效可循环再利用的特点，有利于实现固定化青霉素酰化酶的工业应用价值。
3 不同菌属青霉素酰化酶的固定化条件不同菌属所产青霉素酰化酶可能对应不同的固定化条件。
大规模生产青霉素g酰化酶的菌种有巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)、埃希菌属大肠埃希菌(escherichia coli)、雷氏普罗威登菌(providencia rettgeri)和粪产碱杆菌(alcaligenes faecalis)等，尤以前两种最常见。
产青霉素v酰化酶的菌种多为淡紫链霉菌(streptomyces lavendulae)、尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)、球形杆菌(bacillus sphaericus)和气单胞菌属(aeromonas)等。
酶的固定化条件包括ph、温度、离子强度及载体性能等。
固定化时所选缓冲液的ph应与酶的等电点和载体表面所带电荷有关［27］。
当酶分子表面与载体所带电荷相反时，相互间的静电引力可使酶固定化过程加快，提高酶的负载量，缓冲液的ph应接近于酶的最适ph。
不同来源的酶分子量迥异，如大肠埃希菌青霉素g酰化酶含20.5kda的α亚基和69kda的β亚基；球形杆菌青霉素v酰化酶分子量约为35kda［28］，其中相对较小的酶分子更易包埋进载体，或吸附共价组装进介孔类载体。
常用功能性试剂修饰载体以改善其性能，优化固定效果。
chong 等［29］将青霉素酰化酶吸附于不同硅烷试剂修饰的介孔载体，结果表明选用乙烯基修饰表面的介孔载体固定酶时，固定化酶相对活力达到200%。
不同菌种来源的青霉素酰化酶固定化条件的选择并未有系统的报道，也没有很强的专一性，而是根据酶本身及载体的性质创造酶固定的最适条件。
不同来源酶的固定化条件如表2所示。
本课题将巨大芽孢杆菌胞外青霉素g酰化酶(等电点7.8)溶于ph8.0的磷酸缓冲，室温组装进mcfs(平均孔径26nm)载体，制备得到性能优越的固定化酶。
4 青霉素酰化酶的固定化技术随着载体和固定方法的发展，酶的固定化技术也有创新。
据报道，青霉素酰化酶固定化方法有常规法［34］和紫外照射法［35］，脂肪酶固定化曾采用超声波法［36］。
表3比较了这几种传统固定化方法的优缺点。
本课题研究微波法固定青霉素酰化酶，采用美国cem公司mars5微波反应器，固定过程只需2min，酶负载率高达95%以上，活力回收和相对活力均远超100%。
可能因为酶蛋白和水均是极性分子，微波作用下引起剧烈的极性振荡，增加青霉素酰化酶的游离氨基与载体结合的机会，增加反应传质速率。
微波辐射提供的能量可使酶蛋白在空间结构上扭曲形成新的构象［37］，共价固定化后活力中心充分暴露，酶促反应加速，固定化酶活性明显增强。
表 2 不同来源青霉素酰化酶的固定化条件菌种〖〗酶ph温度载体文献fusarium oxysporum (fp941)pva7.025℃环氧丙烯聚合物［30］streptomyces lavendulae (atcc13664)pva8.0- eupergit c共价［31］bacillus megateriumpga6.340℃添加交联剂戊二醛的mcm 41［7］bacillus megateriumpga7.8室温介孔材料sba 15/130［32］escherichia colipga8.3室温 eupergit c［33］escherichia colipga7.0- cmc［17］表3 传统固定化方法比较分类方法优点缺点文献常规法常温摇床振荡24～72h存储稳定性好固定周期太长［34］紫外照射法紫外照射酶与含醛基的光敏高分子混合物酶被光交联凝胶包埋，与载体骨架共价结合，提高固定化酶的稳定性扩散阻力问题，酶易失活［35］超声波法形成粒子的机械振动含能量的超声振动比机械搅拌有更好促进和传质作用，提高反应速率和产率超声对酶分子产生影响［36］微波法磁力搅拌下微波反应高效，利于酶催化活力增强，降低反应活化能微波过久破坏共价键影响酶活中心［15，37］5 固定化青霉素酰化酶的介质工程传统的游离状态的青霉素酰化酶通常在水相中催化，当今固定化酶催化更致力于非水相的研究。
本文重点综述了固定化青霉素酰化酶在有机相、离子液体和浊点体系中的催化性能。
5.1 有机介质有机介质中的酶反应活性位点与水中相同，用位点专一性试剂对活性位点共价修饰，酶的催化活性消失。
由hammett效应分析和相应的线性自由焓关系(lfers)可知，有机溶剂与水溶液中酶的反应机制大致相同。
有机溶剂的物性参数为酶促反应介质的选择提供了依据，比如挥发性、分子摩尔质量、电容量(介电常数ε)、疏水性(logp)和电荷分布(偶极矩μ)等，其中logp值对酶的催化活性有影响，介电常数ε和偶极矩μ与对映选择性e有较好的相关性［38］。
