青霉素酰化酶SOP

以琳固定化青霉素酰化酶由于β-内酰胺类抗生素（β-lactam antibiotics）广谱的抗菌作用，使得这类抗生素在临床上得到了广泛的应用。

随着各类青霉素衍生物：如苄青霉素（Benzylpenicillin）、阿莫西林（Amoxicillin）、福米西林（formidacillin）等在医疗上的广泛应用，半合成（semisynthetic)β-内酰胺母核的需求量已经超过了青霉素。

目前PGA 主要用于水解青霉素G生成6-氨基青霉烷酸（6-APA）及苯乙酸，然后催化母核和不同的侧链间的合成反应生成半合成的β－内酰胺类抗生素，生物催化合成半合成的β－内酰胺类抗生素在工艺要求、产率、经济效益及环保方面都优于化学法，因此人们在这一方面进行了深入和细致的研究。

早在50 年代初就有人发现，黄青霉Q176（PenicillinmChrysoyeumn）和米曲霉（Aspergillus.oryzae）中存在水解青霉素成为6-APA的酶，即青霉素酰化酶（Penicillin acylase）青霉素G 酰化酶主要有两种来源，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，其中四种来源于革兰氏阴性菌的PGA（大肠杆菌青霉素酰化酶、类粪产碱杆菌青霉素酰化酶、雷氏普罗威登斯菌青霉素酰化酶、克莱博氏菌青霉素酰化酶）已经克隆到大肠杆菌中进行了重组表达,并测定了序列。

青霉素酰化酶根据其底物的专一性不同，可分为三种：（1）优先水解青霉素G 的叫青霉素G 酰化酶（PGA），（2）优先水解青霉素V的叫青霉素V 酰化酶（PVA），（3）专一水解氨苄西林的氨苄青霉素酰化酶。

青霉素是一种胞内酶，PGA由α，β亚基组成，PGA 的两亚基通过轻键作用结合在一起。

单独的α亚基和β亚基均不具有酶的活性，只有当两者以适当的形式结合后才具有活性。

PGA的α亚基与青霉素的侧链结合，决定酶的底物专一性；β亚基包含催化位点以及与催化有关的残基。

固定化青霉素G酰化酶本产品大肠基因工程菌发酵产生，通过分离、纯化，然后以共价键的形式结合到多孔性颗粒状高分子聚合物载体上，制成的固定化酶使用稳定性好，酶蛋白不易脱落。

青霉素酰化酶SOP1. 目的1.1为了保证原材料检验的准确性和具有可追溯性，便于抽查、复查，满足监督管理要求、分清质量责任，特制定本检验规程。

2. 职责2.1 公司质管部负责本制度的编制、修订和解释。

3. 范围3.1 本标准规定了本品的技术要求、试验方法、检验规则、贮存。

本标准适应于6-APA用原料。

5. 引用标准HNPZ07-09《原辅材料质量标准附录—滴定液与标准液》HNPZ07-010《原辅材料质量标准附录—指示液指示剂》HNPZ07-05《化验采样、留样管理制度》6. 技术要求7. 检验方法：7.1 外观：取本品1g置透明玻璃容器中，室内自然光下目测。

7.2 粒径：采用微钠粒度仪（winner 99）测定。

7.3 活力：7.3.1 原理：青霉素(Pen G)在IPA作用下转化成6-APA和苯乙酸，用NaOH滴定苯乙酸，根据NaOH消耗量计算出IPA酶活力。

7.3.2 定义：一个IPA酶活单位定义为，每分钟转化1微摩尔Pen G成6-APA的所需酶量。

7.3.3 试剂a) 磷酸盐缓冲液（0.02M PH 7.8），配置见HNPZ07-12《原辅材料质量标准附录—缓冲液》b) 青霉素G钾10%（用7.3.3.1缓冲液配制而成的溶液）。

c) NaOH滴定液（0.1mol/L），配置与标定见HNPZ07-09《原辅材料质量标准附录—滴定液与标准液》7.3.4 仪器自动滴定装置（浆式搅拌，恒温，PH自动滴定仪）7.3.5 检测精确称取固定化酶样品200～300mg 于50mL 的烧杯中，加入预热到28℃的30~40ml 10%的青霉素钾溶液，开启搅拌，控制反应温度28℃，反应中用0.1M NaOH溶液调PH至8.0，控制反应PH8.0，记录约10分钟左右NaOH 的消耗体积。

酶活力计算公式：V NaOH消耗体积（ml）×C NaOH摩尔浓度（μmol/ml）酶活力（28℃）= ─────────────────────（u/g）W酶重量（g）×H反应时间（min）7.4β—内酰胺酶：7.4.1试剂溶液6-APA底物溶液：称取0.627g6APA，用100mL磷酸盐缓冲液（PH7.0）溶解。

作者：周成王安明王华杜志强祝社民杨明张俊沈树宝【摘要】青霉素酰化酶被广泛应用于半合成抗生素及中间体的制备、手性药物的拆分和多肽合成等方面。

高效固定青霉素酰化酶能提高酶对温度、ph值、溶剂极性等方面的适用性和反复使用的稳定性，将成为拓宽青霉素酰化酶在工业中应用的必然选择和关键。

本文主要介绍了青霉素酰化酶固定化技术的进展，讨论了不同固定化技术的特点和固定化酶在非水相体系中的催化作用，并展望了固定化青霉素酰化酶的发展前景。

【关键词】青霉素酰化酶；载体；固定化；反应介质；固定化酶的应用1 固定化的载体有效固定是固定化青霉素酰化酶的核心技术，载体的材料选择与制备是技术的关键。

性能优越的载体能提高固定化酶的催化性能，降低酶法生产成本。

1.1 有机高分子载体有机载体具有较好的机械强度且已产业化。

天然有机高分子载体无毒性、传质性能好，常用甲壳素和壳聚糖［2］。

合成的有机高分子强度大，但传质较差，如聚乙烯醇［3］和聚丙烯酰胺［4］等。

mateo等［5］选用ep sepabeads类高密度环氧结构的载体固定青霉素酰化酶，过程如图1所示。

pasini等［6］研究eupergit c载体固定化酶，催化活力较游离酶明显增加，重复使用稳定性好。

1.2 无机分子载体随着材料学的迅速发展，出现了具有多维孔道结构介孔分子筛的载体，可制备高活性高稳定性的固定化酶。

何静等［7］报道的介孔分子筛mcm 41具有高比表面积、较小扩散阻力的特点，可吸附固定，也可利用载体表面醛基与酶蛋白的氨基相互反应共价连接。

roger等［8］实验表明mcm 41载体的孔径(3～3.5nm)明显小于青霉素酰化酶尺寸(7nm×5nm×5nm)，载体可大部分与酶以吸附形式固定。

roger等研究了硅载体通过交联剂与酶共价固定的过程，如图2所示。

此硅载体孔径较大，固定化酶的干酶活力达110bpug-1，活力回收80%，热稳定性明显优于eupergit c固定化酶。

青霉素酰化酶提取技术研究摘要：青霉素酰化酶的催化效率高，具有很强的底物专一性，但是作为胞内酶，需要破壁后释放后才能发挥作用。

本研究采用超声破壁技术处理青霉素酰化酶粗酶液，通过单因素实验考察酶液比、超声时间、超声功率对细胞破壁率的影响情况。

实验结果显示酶液比对破壁效果影响最大，超声时间次之，超声功率的影响最小；超声最佳的处理参数为：酶液比为1:200，超声时间为10 min，超声功率为500W，得到超声处理的最大破壁率为78.2%。

本研究为青霉素酰化酶的提取提供了新的技术参数和理论指导，具有工业化价值。

关键词：青霉素酰化酶；提取；破壁；超声波1950年，日本的科学家第一次在产黄青霉Q176中发现了青霉素酰化酶（PA）[1]。

随后研究者发现自然界中的放线菌、细菌、真菌都能合成青霉素酰化酶[2]。

青霉素酰化酶具有重要的应用价值，是一种工具酶，广泛地应用于催化D-氨基酸类似物和β-内酰胺母核酶法合成新型的半合成β-内酰胺类抗生素，而且能逆向催化青霉素水解，生产β-内酰胺类抗生素中间体7-氨基-3-脱乙酸酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)和6一氨基头孢烷酸(6-ACA)，同时在手性药物的拆分和多肽合成等方面也有不错的表现[3]。

发酵液中不仅含有游离酶，还有大量的色素、无机盐、杂蛋白等杂质，这就需要对发酵液进行分离纯化，再使细胞内酶释放，从而得到比活好、纯度高的青霉素酞化酶[5]。

青霉素酰化酶的催化效率高，具有很强的底物专一性[4]。

但是，由于青霉素酰化酶属于胞内表达酶，需要将酶从细胞内释放后细胞外发挥作用，这就需要破碎细胞或者改变细胞壁的通透性[6]。

细胞破壁技术包括机械破壁法和非机械破壁法。

其中机械破壁法的主要方式是高压均质器法和超声波破壁法[7]。

而非机械破壁法的典型方式则是冻融破壁法和溶酶菌法。

高压均质法容易操作，但是能源消耗过高，不利于工业化生产[8]。

冻融破壁法条件温和，但是耗时长。

溶酶菌法则是成本过高无法实现大生产[9]。