HEK293T细胞培养03

293T细胞培养攻略1.培养基准备293T细胞通常使用DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）作为培养基，配以10%胎牛血清（FBS），1%青霉素/链霉素（Penicillin/Streptomycin）。

在培养293T细胞之前，首先将适量的DMEM加热至37°C，并将相应数量的胎牛血清和抗生素加入其中。

2.细胞传代传代细胞是保持293T细胞健康生长和细胞性能的重要步骤。

当细胞达到80-90%的密度时，可以开始细胞传代。

首先，用无菌PBS（磷酸盐缓冲液）将细胞培养瓶中的培养基洗涤一次，然后用0.25%胰酶/EDTA（乙二胺四乙酸）溶液将细胞溶解5-10分钟。

溶解后，加入与胰酶/EDTA液体相等的培养基，轻轻悬浮细胞，并将其移至新的培养瓶中。

将新的培养基加入新瓶中，以使其达到适当的细胞密度。

3.293T细胞的培养条件4.细胞转染293T细胞被广泛用于转染实验。

细胞转染是将外源DNA转运到293T 细胞中的方法，以研究基因功能或进行蛋白表达。

293T细胞的易于转染性质使其适合于多种转染实验，包括常规的钙磷法和化学法（如聚乙烯亚胺）以及电穿孔法。

在进行转染实验之前，应将细胞培养至80-90%的密度，并在转染之后对其进行恢复。

5.结束实验时的保存和冻存细胞在完成实验后，如果有需要保存细胞的需求，可以将293T细胞冻存。

为此，收集细胞，并用DPBS（无菌磷酸盐缓冲液）洗涤细胞。

然后，用0.25%胰酶/EDTA液解细胞5分钟，并加入相等体积的培养基以停止胰酶的作用。

将细胞离心，并以适当的速度冻存保护液（如10%DMSO和90%FBS）重新悬浮细胞。

将细胞悬浮液分装至冻存管中，并使用液氮保存。

总结：293T细胞是一种常用的细胞系，在生物医学研究中发挥着重要作用。

通过遵循上述培养攻略，可以获得高质量和可靠的293T细胞培养结果。

有针对性的细胞传代、定期更换培养基、温度和CO2的适当控制以及正确的细胞转染和细胞冻存步骤可以确保细胞的生长和稳定性，为细胞实验提供最佳条件。

293T细胞的培养[1]293T细胞的培养293T细胞是由293细胞派生, 表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系, 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白, 或是用以包装病毒。

293T为贴壁细胞, 这种细胞对培养基的营养成分要求并不高。

培养条件为: 完全培养基: 高糖DMEM, 10%胎牛血清; 冻存液: 胎牛血清或完全培养基, 10% DMSO。

传代方法为:1．吸掉293T细胞培养瓶内的培养液;2．吸取适量的无Ca 2+和Mg 2+的PBS, 轻轻把贴壁的细胞洗两遍;3．加少量的0.05%胰蛋白酶-EDTA (一般25 cm2的培养瓶加1 ml, 75 cm 2的培养瓶加2~3 ml), 放到培养箱温育20 s;4．细胞消化完毕, 加适量培养液终止消化, 并吹打细胞, 制成均匀的细胞悬液;5．加足量的培养液, 分装到新的培养瓶中。

值得注意的是, 293T细胞的贴壁性不强, 轻微的干扰就可能使它们脱落。

所以, 在更换新鲜培养液或者用PBS冲洗的时候应该小心地添加新的培液进去, 以液体不冲打到贴壁的细胞为好。

传代的时候, 只需要用0.05%胰蛋白酶-EDTA即可轻松把细胞消化下来, 不需要消化很长时间。

有些同学反映293T细胞容易结团不易被吹打开来。

如果遇到这样的情况可以在加了胰蛋白酶温育一段时间后即拿1 ml移液枪反复轻轻吹打, 直至肉眼看不到大的细胞块为止, 然后加适量的培养液混匀, 这时候在显微镜下观察, 可见大多数细胞都是单个的, 只有少量的2~3个细胞聚在一起。

一般293T细胞可以长在塑料的培养瓶底面上直到90%融合, 再以1∶4~1∶8的比率传代。

合适的传代周期为2~3天。

传代过程中,消化的时间越短越好, 显微镜下观察到80%细胞脱落即可加培养液中止。

完成传代后放入培养箱前,应该把培养瓶或培养皿沿X、Y轴方向水平移动几下, 防止细胞都聚在中间或者四周。

冷冻293T细胞的冻存液可以用95%小牛血清加5%二甲基亚砜, 复苏率很高。

Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。

观察时拧紧盖子。

2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。

3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。

不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。

取小离心管一个，置于架子上。

4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。

放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。

5．取待传代的细胞。

打开versene，用酒精灯外焰烧。

烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。

把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。

6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。

（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。

在离心管中间部分将液体加入。

吸液体和加液体时都不要对着细胞。

7．打开胰酶，然后将versene弃掉。

换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。

加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。

8．将细胞放入37度孵箱。

放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。

使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。

别忘了用旧培养基中和。

9．取细胞，镜下观察消化情况。

消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。

用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。

然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。

10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。

11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。

换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。

12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。

不要把枪伸到离心管内。

13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。

qq ：439572370HEK-293是用DMEM 培养基培养吗？
HEK-293细胞是我在锐赛生物实验室做项目时常培养的细胞，DMEM+10%血清+双抗+谷氨酰胺，这类的细胞贴壁性不是太强，所以不要消化过久，容易损伤细胞。

状态较好的293细胞
细胞生长较快，一般1:3~1:5传代，30%~50%融合度2-3
天即可长满。

细胞状态不好后会变瘦、产生大量黑点（细胞碎片）。

网友咨询：我们这里的293转染质粒效率一直不高，
各种方法均试过了，很少能达到50%，老板说他在
国外做293转染很容易达到80%以上。

我想问一下哪里有好的293细胞卖？非常感谢。

答：293系列的细胞都是非常好转染的：注意点：
1.转染前细胞的铺板密度、细胞状态
2.转染的时间
3.转染试剂与质粒的比值
干扰载体转染293T 细胞48h 的图片，供参考。

293T 细胞生长速度更快，形态较293A 细胞小，贴壁性比293
细胞弱很多，消化时间更要注意，没培养过的刚接手细胞要在注意留种的同时多试验消化几次，掌握经验值。

293
细胞常用于腺病毒包装、293T
细胞常用于慢病毒包装。

HEK293细胞培养心得首先，为了成功培养HEK293细胞，一个优良的细胞培养基是必不可少的。

一般来说，培养基应包含必需的营养物质，比如氨基酸、维生素、糖类和无机盐等。

同时，培养基还应该含有足够的抗生素以预防细菌和真菌的污染。

最好使用无血清的培养基，以避免动物源性成分对细胞培养的影响。

其次，准备一个合适的细胞培养环境也是至关重要的。

温度、湿度和二氧化碳浓度等条件应符合HEK293细胞的生长要求。

一般来说，细胞应在37°C的温度下培养，在5%的二氧化碳气氛中保持培养皿内的湿度。

细胞的传代是维持细胞活力和健康状态的重要步骤。

对于HEK293细胞，通常使用胰酶进行消化和洗涤来分离细胞。

对于细胞的新鲜分离，可以将细胞培养皿放入冰箱中进行预冷却，然后使用含有胰酶的PBS缓冲液进行洗涤。

定期检查细胞的密度和健康状况，并及时进行传代是非常重要的。

在培养细胞的过程中，细胞污染是一个常见的问题。

为了避免细菌和真菌的污染，可以在细胞培养过程中添加抗生素。

此外，操作时应注意细胞培养器具的无菌性，使用经过消毒的培养器具并保持培养环境的清洁是必要的。

细胞的冻存是为了保存和传递细胞的重要方法。

在将细胞冻存之前，应通过使用逐渐降低培养基中血清含量的方法适应细胞在无血清条件下生长。

然后使用冷冻保护剂配制适当的冻存液，将细胞分装到冻存管中，并使用液氮罐进行快速冷冻。

最后，定期检查细胞的健康和生长状态是维持细胞培养的重要步骤。

观察细胞的形态和贴壁情况，并使用显微镜检查细胞的活力和细胞数目。

如果细胞出现异常形态或生长减慢，可能是因为细菌或真菌污染，应及时采取相应的措施。

总之，HEK293细胞的培养需要一定的技巧和经验。

通过优化培养基、培养条件和消毒措施，加强细胞观察和细胞传代，可以有效地培养和维持HEK293细胞的活性和生长。

这些心得经验将有助于研究人员在实验室中更好地使用HEK293细胞进行相关研究。

精心整理293T细胞培养1.培养基:DMEM=丙酮酸钠++10%血清++青链霉素2.复苏：37度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15ml离心管，加5ml培养基，500g离心5min，弃上清，加1ml培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml左右，记得晃匀。

也不易打散。

悬浮的293T细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。

293T细胞在传代120次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。

293细胞培养特性：1、细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长,换液293T时动作要轻。

一般用高糖的DMEM培养基。

2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞脱落,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。

12小时-24小时90%以上细胞贴壁。

293细胞传代时机为达80-90%汇合，传代比其它的经验：1、用大瓶培养较小瓶要好，可能是更有利于293均匀的分布，利于营养的摄取2、培养液要新鲜，每次只配1000ml，分为2-4瓶，不用的培养液，冻存在-20度，3、要及时传代，最好是细胞基本铺满培养瓶底部，但是细胞之间还没有完全贴紧，总是多少有空隙的时候最好。

4、如果细胞贴壁不好，可能是消化过久，或是培养瓶不够干净，当然要除外细胞污染。

细胞的复苏：快速取出冻存的低代次293细胞，将其安放在底端1／2浸于37℃水浴中，轻轻晃动以加速融解。

在超净工作台中，以70％乙醇对细胞培养皿表面消毒，将细胞转移至75cm的细胞培养瓶中，加入10mL低代次293细胞培养基置于细胞培养箱内培养。

6～8h后待细胞贴壁更换培养基。

(1)利用低代次293细胞贴壁的特性，在复苏和传代时不离心，而是加入10mL培养基中和细胞消化液，培养6～8h，细胞贴壁后更换新鲜培养基，从而避免了离心剪切力对细胞造成的机械损伤；(2)在消化细胞时，振荡培养瓶，避免直接反复剧烈吹打细胞。

293T细胞培养说明书一、实验简介293T细胞是由肾脏细胞系统转染外源基因而产生的细胞系，具有较好的培养性和转染性。

因此，293T细胞常用于基因表达研究，尤其是蛋白表达和病毒载体的构建。

二、培养条件1. 培养基：293T细胞培养最常用的培养基是Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)，其次是RPMI-1640培养基。

2. 氧气浓度：293T细胞培养一般需要一个较高的氧气浓度，如5%~10%。

3. 温度：293T细胞的培养温度一般为37℃。

4. 水分：293T细胞的培养液中的水分一般为95%~100%。

5. 添加物：293T细胞的培养液中通常会添加10%的牛血清，以促进细胞生长。

三、细胞培养步骤1. 将293T细胞从细胞库中取出，放入清洗后的培养皿中，以DMEM培养基浸泡；2. 将培养皿放入培养箱，调节温度为37℃，氧气浓度为5%~10%；3. 将添加10%牛血清放入培养液中，搅拌均匀；4. 用细胞活性检测试纸测定细胞活性；5. 根据细胞活性的变化情况，调整培养液中的水分，以维持细胞的生长；6. 将培养液更换，每1~2天更换一次；7. 定期观察细胞形态，记录细胞生长情况。

四、注意事项1. 在培养293T细胞时，需要注意细胞的温度、氧气浓度以及水分，以保证细胞的正常生长；2. 培养液的清洗和更换要及时，以保证细胞的正常生长；3. 在操作293T细胞时，一定要注意实验室的清洁卫生，以防止细胞的污染。

五、总结293T细胞培养是一种常用的培养方法，在培养293T细胞时，要注意培养液的温度、氧气浓度以及水分，并及时更换培养液，以保证细胞的正常生长。

在实验操作中，还要注意实验室的清洁卫生，以防止细胞的污染。

293T 细胞培养1.培养基: DMEM =丙酮酸钠++10%血清++青链霉素2.复苏：37 度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15ml 离心管，加5ml 培养基，500g 离心5min，弃上清，加1ml 培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml 左右，记得晃匀。

3. 传代:吸出旧培基，加5mlPBS 洗一遍，用移液管加1ml 胰酶，洗一遍吸出，37 度放1min 左右计时，看到大片大片脱落了即加入新培基吹打，吹洗充分后，吸1ml加到事先加好10ml 新培育基的新瓶里。

293T 细胞是用5 型腺病毒75 株系转化，含有Ad5 E1 区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1 区缺陷互补细胞系。

293T 细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5 和其他血清型腺病毒在其上增殖。

哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。

这三种方式均可用于293T 细胞的大规模培养。

293T 细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。

单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM 中能生长很好。

一般来讲，1:10 传代后，一周可以长满。

严禁过度生长，这点很重要。

因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。

悬浮的293T 细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。

293T 细胞在传代120 次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。

293 细胞培养特性：1、细胞明显适应酸性环境,pH 值在6.9～7.1 时,可顺利贴壁生长, 换液293T 时动作要轻。

一般用高糖的DMEM 培养基。

2、传代：倒去废液，PBS 洗一次（轻），用0.02%EDTA 与0.25%Trypsin 消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin 作用30s,镜下观察细胞脱落,就可加DMEM 终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。

人胚肾细胞293T说明书中国科学院干细胞库编号：SCSP-502细胞名称：293T细胞描述：人胚肾细胞（293细胞株插入SV40 T-抗原基因后产生的高转染效率的衍生株称为293T）。

该细胞最初的名字是293tsA1609neo，携带SV40复制序列，被广泛用于逆转录病毒生产、基因表达和蛋白表达。

物种：人细胞来源：2015年新引进ATCC numbe r：CRL-3216™生物安全等级：BSL-2完全培养液配方：见下方备注批次/冻存日期：详见冻存管/培养瓶标识参考传代周期：3-4天参考传代比例：1:3-1:4参考换液频率：2-3天冻存液配方：培养液95%，DMSO 5%细胞状态：上皮样，贴壁生长。

细胞贴壁能力较弱。

支原体检测结果：阴性STR鉴定结果：D5S818: 8,9；D13S317: 12；D7S820: 11；D16S539: 9,13；vWA: 16,19,20；THO1: 7,9.3；Amelogenin: X；TPOX: 11；CSF1PO: 11,12293T细胞照片备注：1. 人胚肾细胞293T完全培养液配方（100 ml）：DMEM (Invitrogen, 12430054) 87 mlFBS (Gibco) 10 ml Glutamax (Invitrogen, 35050061) 1 mlNon-essential Amino Acids, 100⨯ (Invitrogen, 11140050) 1 ml Sodium Pyruvate 100 mM Solution（invitrogen 11360070） 1 ml2. 我库冻存时，每支冻存管约含1⨯106细胞量，体积为500 μl，预期存活率70%，建议复苏至1个T25培养瓶中。

3. 注意事项：该细胞贴壁能力较弱，培养时可酌情使用预铺明胶的培养瓶/培养皿。

详情访问中科院干细胞库/干细胞技术平台/index.asp；电话：************感谢您选择我们的服务！中国科学院干细胞库/干细胞技术平台。

293T细胞的培养关键词：293T细胞慢病毒包装培养 2011-10-28 18:14 来源：丁香园点击次数：5037包装细胞293T细胞的培养一、293T细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。

所以要在细胞购进时就进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。

2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。

3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。

4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。

5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。

6. 细胞计数。

7. 将细胞离心，1000rpm，2min。

8.根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+ 20% FBS + 10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。

9. 分装进细胞冻存管，放入泡沫盒中，放入-80℃超低温冰箱。

10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。

11. 复苏检测细胞存活率，细胞状态等，并记录。

二. 293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。

2. 消化细胞，方法同上。

3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。

密度为3×105个/ml。

4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。

5. 放回37℃、3%CO和95%相对湿度的培养箱中培养。

2三. 293T细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。

2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。

3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。

4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。

和95%相对湿度的培养箱中培养。

293t细胞培养步骤嘿，咱今儿就来唠唠 293T 细胞培养那些事儿！这可真是个精细活儿呢。

先说说细胞复苏吧，这就好比唤醒一个沉睡的小宝贝。

得小心翼翼地从液氮罐里把冻存管取出来，动作可得轻柔点儿，别把人家给弄醒哭啦！然后快速地在 37 度的温水里晃悠晃悠，让细胞慢慢解冻。

等解冻好了，就把细胞混悬液转移到离心管里，离心一下，去掉那冻存液，就像给小宝贝洗个澡，把身上的脏东西洗掉。

接下来就是细胞接种啦，这就像是给小宝贝找个舒服的小窝。

把处理好的细胞混悬液轻轻滴到培养瓶里，让它们舒舒服服地躺在那。

这里可得注意啦，培养液得选对，就像给小宝贝准备合适的奶粉一样，可不能马虎。

然后就是培养啦，这可真是个需要耐心等待的过程。

要把培养瓶放在合适的温度和环境里，让细胞们开开心心地长大。

这就好像看着小宝贝一点点成长，心里充满了期待。

细胞培养过程中，还得时刻留意着它们的状态。

看看有没有长歪啦，有没有不开心啦。

如果培养液变黄了，那就说明细胞们饿啦，得赶紧给它们加点“食物”。

要是细胞长得太密了，那就像小宝贝们在房间里挤来挤去，得给它们分个家，不然它们可要不高兴咯。

培养一段时间后，还得给细胞传代呢。

这就像是小宝贝长大了，要换个更大的房间。

把细胞混悬液分成几份，分别放到新的培养瓶里，让它们继续快乐成长。

哎呀，培养 293T 细胞可真是不容易啊，但看到它们茁壮成长，那感觉就像看着自己精心培育的花朵绽放一样，别提多有成就感了！所以啊，咱可得认真对待每一个步骤，就像对待宝贝一样细心呵护。

只有这样，才能让这些细胞们健康快乐地成长，为我们的实验和研究提供有力的支持呀！你说是不是这个理儿呢？总之呢，293T 细胞培养虽然有点麻烦，但只要咱有耐心，有细心，就一定能把它们养得好好的。

让我们一起加油，为科学研究贡献自己的力量吧！。

hek293t驯化为悬浮细胞的原理hek293t细胞是一种重要的细胞系，常用于体外重组蛋白表达和病毒繁殖等研究。

而将hek293t细胞驯化为悬浮细胞，则是为了更好地满足特定实验需求。

驯化hek293t细胞为悬浮细胞的原理是通过改变培养条件和细胞的生长环境，使其适应于悬浮生长。

通常，将hek293t细胞从常规的贴壁培养方式转变为悬浮培养方式，需要进行以下几个步骤：1.细胞适应性培养：将hek293t细胞从贴壁培养转移到悬浮培养需要逐渐进行。

首先，在贴壁培养基中添加一定比例的悬浮培养基，并将细胞按照常规方式培养。

随着细胞适应悬浮培养环境，逐渐增加悬浮培养基的比例，直到完全替代贴壁培养基。

2.悬浮培养基的优化：悬浮培养基是驯化成功的关键。

悬浮培养基中含有适合细胞生长和分裂的营养物质和补充物质。

常见的悬浮培养基成分包括无血清培养基、悬浮细胞培养辅助剂和抗生素等。

优化悬浮培养基的配方，可以提高细胞的生长速度和细胞存活率。

3.培养条件的控制：温度、湿度、CO2浓度和培养容器的选择都会对细胞的生长和适应性产生影响。

适当的温度和湿度可以提供一个适宜的生长环境，而CO2浓度的控制则可以调节培养基的pH值。

此外，选择合适的培养容器，如摇瓶或旋转培养器，可以提供细胞生长所需的氧气和营养物质。

通过以上步骤的逐渐调整和优化，hek293t细胞可以适应悬浮生长的条件。

悬浮细胞的优势在于可以实现大规模的细胞培养和高效的蛋白表达，同时也方便操作和维护。

然而，悬浮细胞也存在一些挑战，如细胞聚集和悬浮液的混浊等问题，需要合理的培养和操作手段来解决。

将hek293t细胞驯化为悬浮细胞是为了满足特定实验需求，通过改变培养条件和细胞的生长环境，使其适应于悬浮生长。

这一过程需要逐渐进行，包括细胞适应性培养、悬浮培养基的优化和培养条件的控制等。

悬浮细胞的成功驯化将为相关研究提供更多的可能性和便利性。

293T细胞培养293T 细胞培养1.培养基: DMEM =丙酮酸钠++10%血清++青链霉素2.复苏：37 度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15ml 离心管，加5ml 培养基，500g 离心5min，弃上清，加1ml 培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml 左右，记得晃匀。

3. 传代:吸出旧培基，加5mlPBS 洗一遍，用移液管加1ml 胰酶，洗一遍吸出，37 度放1min 左右计时，看到大片大片脱落了即加入新培基吹打，吹洗充分后，吸1ml加到事先加好10ml 新培育基的新瓶里。

293T 细胞是用5 型腺病毒75 株系转化，含有Ad5 E1 区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1 区缺陷互补细胞系。

293T 细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5 和其他血清型腺病毒在其上增殖。

哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。

这三种方式均可用于293T 细胞的大规模培养。

293T 细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。

单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM 中能生长很好。

一般来讲，1:10 传代后，一周可以长满。

严禁过度生长，这点很重要。

因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。

悬浮的293T 细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。

293T 细胞在传代120 次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。

293 细胞培养特性：1、细胞明显适应酸性环境,pH 值在6.9～7.1 时,可顺利贴壁生长, 换液293T 时动作要轻。

一般用高糖的DMEM 培养基。

2、传代：倒去废液，PBS 洗一次（轻），用0.02%EDTA 与0.25%Trypsin 消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin 作用30s,镜下观察细胞脱落,就可加DMEM 终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。

293t细胞表达蛋白条件293T细胞是一种常用于生物医学研究的细胞系，其特点是易于培养、转染效率高以及对多种病毒感染的敏感性。

因此，293T细胞被广泛用于表达外源蛋白和研究蛋白功能的实验中。

下面将介绍293T细胞表达蛋白的条件和相关注意事项。

一、细胞培养条件293T细胞的培养基选择常用的DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培养基，其中添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（Penicillin-Streptomycin）。

细胞应在37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。

二、转染条件293T细胞的转染效率高，常用的转染方法有磷酸钙共沉淀法、聚乙二醇共转染法和脂质体介导转染法等。

选择合适的转染方法需要根据实验目的和所需蛋白的性质来确定。

1. 磷酸钙共沉淀法：将目的蛋白的表达质粒与磷酸钙混合后加入293T细胞培养基中，经过一定时间的培养后，蛋白便可表达出来。

2. 聚乙二醇共转染法：将目的蛋白的表达质粒与聚乙二醇混合后加入293T细胞培养基中，经过一定时间的培养后，蛋白便可表达出来。

3. 脂质体介导转染法：将目的蛋白的表达质粒与脂质体混合后加入293T细胞培养基中，经过一定时间的培养后，蛋白便可表达出来。

三、表达蛋白的时间点和条件293T细胞表达外源蛋白的时间点和条件需要根据实验目的和所需蛋白的性质来确定。

一般情况下，培养细胞24-48小时后即可开始检测蛋白表达情况。

蛋白的表达水平可以通过Western blot、免疫荧光染色等方法进行检测。

四、相关注意事项1. 在进行293T细胞的培养和转染实验时，需采取无菌操作，以防止细菌和真菌的污染。

2. 在培养293T细胞时，应注意细胞的密度和培养时间。

细胞密度过高或培养时间过长会导致细胞凋亡或分化，影响蛋白的表达。

3. 选择合适的转染方法和转染试剂，以提高蛋白表达效率。

4. 在进行蛋白表达实验时，可以根据需要添加适当的药物，如蛋白酶抑制剂、翻译抑制剂等，以提高蛋白的稳定性和纯度。

293T细胞培养准则操作规程
百利药业⽣物药研发部
标准操作规程
题⽬：293T细胞传代培养操作规程
编号：SOP-M-e-003-
制定者：（签名）⽇期：年⽉⽇
批准者：（签名）⽇期：年⽉⽇
按照⽣物安全柜的标准操作规程，将⽣物安全柜的紫外开启半⼩时。

3.2将含10%胎⽜⾎清和100U/ml双抗的DMEM及PBS放于37℃⽔浴锅中预热。

3.2.1将已长到80%-90%的293T细胞培养瓶从37℃，5%的CO
培养箱中取出，先⽤75%的酒
2
精喷洒于瓶表⾯，将细胞培养瓶旋转放于⽣物安全柜中，⽤⽆菌的移液管吸净其中的培养基，加5ml的预热的PBS洗涤⼀次，吸净PBS。

3.2.2将含EDTA-0.25%tyption⽤PBS稀释两陪到五倍，向该75cm2的细胞瓶中加⼊3ml稀释好的EDTA-0.25%tyption，让其充分平铺于细胞表⾯。

盖好瓶盖，将细胞瓶放在显微镜下观察，直到细胞变圆，加含10%胎⽜⾎清的DMEM终⽌反应，⽤移液管轻轻将瓶上的细胞吹下，
将细胞液移到15ml⽆菌的离⼼管中，1000rpm离⼼3分钟。

3.2.3将离⼼上清吸弃掉，⽤⼿指轻轻拍打离⼼管底将底部细胞分散开，再加3mlDMEM培养基将分散的细胞重悬稀释开，取⼀定量的细胞液进⾏n倍稀释后计数，按照细胞计数标准操作规程进⾏。

3.2.4计数好之后细胞传代密度按照2~5×104个细胞/cm2进⾏传代培养，每个75cm2的培养瓶中加10mlDMEM培养基，放于37℃，5%的CO
培养箱中培养。

2
3.2.5 24⼩时后观察细胞状态，待细胞长到80%-90%时进⾏下⼀次传代培养。