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小鼠破骨细胞分离培养及鉴定摘要选择小鼠为试验对象，观察体外培养破骨细胞的形态学和生物学特征。
采用小鼠共培养试验，结合倒置相差显微镜、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色和扫描电镜（SEM）对其形态和功能进行观察鉴定。
结果表明：利用小鼠共培养试验方法得到的破骨细胞具有典型的破骨细胞的形态特点：属多核大细胞，TRAP染色阳性，能在骨片表面形成吸收陷窝。
提示小鼠共培养试验能够得到一定数量具有骨吸收活性的破骨细胞。
关键词破骨细胞；TRAP染色；骨吸收陷窝；小鼠骨疾病的发生与骨形成、骨吸收失衡有关，骨吸收大于骨形成导致骨量减少，而骨吸收又与破骨细胞的数量和功能有关[1]。
从破骨细胞着手揭示骨吸收机制，为许多由破骨细胞引起的疾病如绝经后的骨质疏松、风湿性关节炎、牙周病、肿瘤相关性骨溶解以及矫形外科中的植入体的丢失等提供防治依据。
与此相关，分离成熟的破骨细胞对于研究破骨细胞的特征、功能和调节来说显然是一种必不可缺少的工具。
该研究以小鼠为试验对象，建立小鼠共培养试验培养破骨细胞的方法，来获得具有特征性的破骨细胞。
1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 试验动物。
1日龄MF1小鼠，由扬州大学比较医学中心提供。
1.1.2 主要试剂及仪器。
α-MEM，胎牛血清，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色试剂盒、1，25-（OH）2D3，甲苯胺蓝，直径5 mm的象牙片。
YJ2875B型医用净化工作台，PS29000705超纯水装置，24孔培养板，二氧化碳培养箱，超声清洗仪，XSZ-D2倒置显微镜，XL30-ESEM环境扫描电子显微镜[2-3]。
1.2 试验方法1.2.1 成骨细胞分离培养。
将1日龄的小鼠浸入75%酒精浸泡3～5 min。
无菌剪取其头盖骨，去除表面结缔组织和毛细血管，放入50 mL离心管，加入3 mL 0.25%胰蛋白酶，37 ℃气浴摇床消化20 min，80 r/min，弃胰酶。
用PBS冲洗并尽量吹打以除去成纤维细胞。
安淮山羊骨骼肌卫星细胞的分离培养与鉴定
郑琪;睢梦华;朱龙;吴昊;丁建平;张运海;凌英会
【期刊名称】《安徽农业大学学报》
【年(卷),期】2017(44)2
【摘要】为了分离得到安淮山羊骨骼肌卫星细胞,成功构建山羊骨骼肌卫星细胞系,为相关研究提供实验材料。
以安淮山羊背最长肌肌肉组织为材料,采取胶原酶和胰蛋白酶结合的二步消化法,结合差速贴壁法纯化原代骨骼肌卫星细胞。
对骨骼肌卫星细胞中特异性基因Pax7用免疫荧光染色法及PCR扩增加以鉴定。
通过分离、纯化,得到纯度较高的山羊骨骼肌卫星细胞,其形态为圆形,折光性强。
培养一段时间后密度增大,细胞呈梭型。
所得骨骼肌卫星细胞生长状态良好,具有较为一致的生长方式和形态特点。
经免疫荧光染色法以及PCR鉴定发现细胞系中有Pax7基因的表达。
通过上述材料和方法,可获得较纯的山羊骨骼肌卫星细胞,并稳定传代。
【总页数】5页(P198-202)
【作者】郑琪;睢梦华;朱龙;吴昊;丁建平;张运海;凌英会
【作者单位】安徽农业大学动物科技学院;安徽地方畜禽遗传资源保护与生物育种省级实验室;安徽省羊繁育工程技术研究中心
【正文语种】中文
【中图分类】S827.2
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4.绵羊骨骼肌卫星细胞分离培养、鉴定与成肌诱导分化
5.山羊骨骼肌卫星细胞系分离、培养及其成肌诱导分化研究
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多浪绵羊骨骼肌卫星细胞的分离培养、鉴定及成肌诱导分化赵谦;张萍;李向臣;关伟军;浦亚斌;赵倩君;马月辉【摘要】To mimic muscle development of Duolang sheep in vitro,we employed a two-step digestion method to separate satellite cells (SCs) and a differential adhesion method to purify the cells in Duolangsheep.Moreover,observation of microscopic images and immunofluorescence were used for identifying Duolang sheep SCs and its myogenic ing immunofluorescence for Desmin,Pax7 and MyoD1 genes,we demonstrated that these marker genes all expressed in the SCs.The SCs formed significant myotubes when the serum was withdrawal from growth media,confirmed by the immunofluorescence for MHC and microscopic images.Taken together,we ssuccessfully isolated SCs and established the myogenic differentiation of SCs.%为了在体外细胞水平模拟多浪绵羊肌肉生长发育过程,本研究以多浪绵羊为试验动物,采用胶原酶和胰酶两步酶消化法分离多浪绵羊骨骼肌卫星细胞(satellite cells,SCs),并利用差速贴壁的方法纯化分离得到的SCs.利用免疫荧光技术检测SCs标记基因Desmin、Pax7和MyoD1的表达情况,鉴定分离得到的SCs.采用血清撤离的方法诱导SCs向成肌方向分化.通过显微镜观察和成肌分化标记基因肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)的免疫荧光,检测肌管的形成情况.通过对SCs标记基因Desmin、Pax7和MyoD1的免疫荧光鉴定,确认本研究成功分离得到多浪绵羊SCs.采用血清撤离的方法诱导SCs成肌分化,显微镜观察和MHC免疫荧光可以明显观察和检测到肌管的形成.本研究对多浪绵羊SCs成功地进行了分离和鉴定,并建立了体外培养条件下多浪绵羊SCs的成肌诱导分化.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2016(043)011【总页数】7页(P2956-2962)【关键词】绵羊;骨骼肌卫星细胞;分离培养;成肌分化【作者】赵谦;张萍;李向臣;关伟军;浦亚斌;赵倩君;马月辉【作者单位】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京 100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京 100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京 100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京 100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京 100193;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京 100193【正文语种】中文【中图分类】Q813骨骼肌卫星细胞(satellite cells，SCs)具有成肌分化的潜在能力，体外培养的SCs 可以模拟骨骼肌的生长发育过程。
小鼠原代成肌细胞分离、纯化及培养熊雷;何衍佶;戴威;赵圆;高彦飞;邓忠良;聂茂【期刊名称】《现代医药卫生》【年(卷),期】2017(33)3【摘要】Objective To establish the methods of isolation,purification and culture of primary mouse myoblast,then to induce its myogenic differentiation and to detect the expression of microRNA-1(miRNA-1) and miRNA-155 during this process. Methods The primary mouse myoblast was isolated and purified from the hind leg of neonatal mouse with collagenase digestion , and difference of cell adherence. Its myogenic differentiation was induced by the differentiation culture medium containing horse serum. The myogenic ability of primary myoblast was identified by myosin heavy chain antibody (MF20) immunofluorescence staining. The expression of miRNA-1 and miRNA-155 during the myogenic differentiation was detected by Taqman real time PCR. Result The primary mouse myoblast was successfully isolated and purified;the myogenic differentiation of primary myoblast was successfully induced and MF20 immunofluorescence staining was positive. The miRNA-1 expression was dramatically up-regulated, while the miRNA-155 expression was down-regulated during the myogenic differentiation of primary mouse myoblast ,the difference was statistically significant(P<0.05). Conculsion The isolation and purification method of primary mouse myoblast issuccessfully constructed by this study ,which provides a model in vitro for investigating the miRNA gene regulation during myo-genic differentiation process.%目的建立小鼠原代成肌细胞分离、纯化及培养方法，并诱导其成肌分化，检测成肌分化过程中微小RNA-1（miRNA-1）和miRNA-155表达情况。
·实验研究·大鼠骨骼肌卫星细胞体外培养的实验研究夏家红 谢艾妮 徐磊 张凯伦 基金项目:国家自然科学基金资助项目(03970720);武汉市晨光计划青年基金资助项目(20035002016-17)作者单位:430022武汉,华中科技大学同济医学院附属协和医院心脏外科 【摘要】 目的 改进鼠肌卫星细胞体外培养方法,得到更高纯度的肌卫星细胞。
方法 采用成年Wistar 大鼠,将两步消化法加以改进,采用Ficoll 分离和差速贴壁法两步纯化得到更高纯度的肌卫星细胞。
所得细胞采用免疫组织化学方法加以鉴定。
结果 此方法肌卫星细胞纯化率可达到98%。
细胞增殖快,生长良好。
结论 本实验成功建立了卫星细胞纯化方法,适用于心外科及相关科室开展细胞移植和基因治疗方面的研究。
【关键词】 肌细胞; 细胞培养; 纯化C ulture of rat musclesatellite cell in vitro XI A Jia -hong ,X IE Ai -ni ,XU Lei ,et al .Depart ment ofCardiovascular Surgery ,Uion Hospital ,Tongji Medical College ,Huazhong University of Science and T echnology ,Wuhan 430022,China【Abstract 】 Objective To improve the culture method of rat muscle setellite cell in vitro and ob -tain more purified muscle setellite cells .Methods T he mo re purified satellite cells w ere obtained from adult Wistar rats isolated by improved two -steps digestion metho d ,and purified by the tw o -step method of F icoll seperation and velocity sedimentation .T he cells w ere identified by immunochemical stain .Results T he purification rate of satellite cells was 98%by using this method and they showed stro ng proliferative ablity and g rew well .Conclusion T he purification technique for satellite cell was developed successfully .It w as useful for cardial surg ery department or other departments to study cell transplantion and gene therapy .【Key words 】 M uscle cell ; Cell culture ; Purificatio n 1961年Mauro [1]发现了骨骼肌卫星细胞,并证实其是骨骼肌干细胞。
壁虎骨骼肌卫星细胞的原代培养与鉴定徐青;徐敏;张加吉;李冬辉;刘炎【摘要】目的:建立一种有效的壁虎骨骼肌卫星细胞分离、培养及鉴定体系.方法:取壁虎后肢肌,采用Ⅰ型胶原酶消化法获得细胞悬液,经差速贴壁法纯化骨骼肌卫星细胞,通过Pax7免疫细胞化学方法鉴定骨骼肌卫星细胞.用此法也分离到小鼠骨骼肌卫星细胞.结果:(1)分离到的细胞呈小圆形,培养2天后可见纺锤形细胞.(2)免疫细胞化学染色显示,分离得到的壁虎骨骼肌卫星细胞表达Pax7.Pax7阳性的小鼠骨骼肌卫星细胞达99%以上.培养3天后卫星细胞开始增殖.结论:成功建立壁虎骨骼肌卫星细胞的纯化和鉴定方法,为进一步研究卫星细胞在高等哺乳动物损伤修复中的可塑性奠定基础.【期刊名称】《交通医学》【年(卷),期】2011(025)002【总页数】4页(P110-112,117)【关键词】骨骼肌卫星细胞;原代培养;差速贴壁法;壁虎【作者】徐青;徐敏;张加吉;李冬辉;刘炎【作者单位】南通大学神经再生重点实验室;南通大学医学院形态学实验室,江苏,226001;南通大学神经再生重点实验室;南通大学神经再生重点实验室;南通大学神经再生重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R34干细胞研究是当今医学的热点问题，肌肉干细胞因直接参与促进骨骼肌的分化形成而备受世人关注。
胚胎和成人体内都存在肌肉干细胞，在成人体内存在两类具有干细胞样特性的细胞：一类称为卫星细胞 (Satellite cells,SC)；另一类称为群旁细胞(Side populations,SP)。
由于肌肉卫星细胞在肌肉的发育和再生中发挥主要作用，目前公认的肌肉干细胞主要指肌肉卫星细胞。
骨骼肌卫星细胞(Satellite cell,SC)由Mauro A.于1961年利用电镜从青蛙胫前肌中首次发现[2]。
它是一种位于肌纤维肌膜与基底膜间的多潜能干细胞，具有一定的自我更新能力[3]。
通常情况下骨骼肌卫星细胞处于相对静止状态，表达早期肌系特异性因子Pax3、Pax7[4]和c-met。
第21卷 第1期 天 津 农 学 院 学 报 Vol. 21，No. 1 2014年3月 Journal of Tianjin Agricultural University March，2014
收稿日期：2013-12-19 基金项目：国家自然科学基金项目“牛骨骼肌卫星细胞成肌分化相关miRNAs的鉴定和功能研究”（31201021）；天津市自然科学基金项目“microRNA-1对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控作用研究”（13JCQNJC14600） 作者简介：代阳（1988-），女，内蒙古通辽人，硕士在读，研究方向为动物胚胎与转基因工程。E-mail: aq19881209@163.com。 通信作者：丁向彬（1978-），男，河南南阳人，副教授，博士，研究方向为动物胚胎工程与繁殖生物技术。E-mail: xiangbinding@163.com。
文章编号：1008-5394（2014）01-0001-04 小鼠骨骼肌卫星细胞的分离培养和鉴定 代阳1，王轶敏1，2，刘新峰1，樊晗璐1，李吉霞1，郭宏1，丁向彬1，通信作者 （1. 天津农学院 动物科学与动物医学学院，天津 300384；2. 西北农林科技大学 生物工程研究所，陕西 杨凌 712100） 摘 要：采用胶原酶和胰酶联用的酶消化法分离小鼠骨骼肌卫星细胞，应用差速贴壁法进行纯化，并利用RT-PCR和免疫荧光染色方法对分化前后细胞的标志基因进行鉴定。结果显示：分离出的肌卫星细胞生长状态良好，RT-PCR和免疫荧光染色显示肌卫星细胞Pax7和MyoD呈阳性表达，诱导分化形成肌管后，分化标志基因MyoG和MHC呈阳性表达。本研究成功从小鼠肌肉组织中分离出了肌卫星细胞，并具有很好的体外分化能力，可以为肌肉的发育分化和损伤修复研究提供良好的细胞模型。 关键词：小鼠；骨骼肌卫星细胞；细胞培养；鉴定 中图分类号：Q813.1 文献标识码：A
Isolated Culture and Identification of Mouse Skeletal Muscle Satellite Cells DAI Yang1, WANG Yi-min1,2, LIU Xin-feng1, FAN Han-lu1, LI Ji-xia1,
GUO Hong1, DING Xiang-bin1,Corresponding Author
(1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Institute of Bioengineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi Province, China)
Abstract: In this study, mouse skeletal muscle satellite cells were isolated by collagenase and trypsinase digestion method. Then the satellite cells were purified and induced to differentiate into myotubes, and the marker genes of the cells before or after the differentiation were detected by RT-PCR and immunocytochemistry technology. The results show that the isolated muscle satellite cells were healthy, and expressed the marker genes of paired protein box (Pax7) and myogenic differentiation antigen (MyoD). After inducing to the myotubes, myogenin (MyoG) and myosin heavy chain (MHC)showed positive expression. The results indicate that mouse skeletal muscle satellite cells of high purity, which can provide cell sources for muscle development and damage repair study, are successfully isolated. Key words: mouse; skeletal muscle satellite cell; cell culture; identification
骨骼肌卫星细胞（skeletal muscle satellite cell）是骨骼肌中具有分化增殖潜能的肌源性干细胞，通常以静息状态存在于肌纤维肌膜与基底膜之间[1]，
在一定条件下可以被激活，发生增殖和分化，形成骨骼肌细胞。1961年，Mauro[2]首次在蛙的肌肉
中发现了肌卫星细胞，其后，有多种动物的肌卫星细胞被成功分离，并进行了体外培养。肌卫星细胞在肌肉的发育和再生中发挥了重要作用，而肌卫星细胞的增殖和分化受众多因素的影响[3]，目
前，其分离效率仍然很低，建立高效的体外培养、鉴定与诱导分化方法仍然是卫星细胞研究和利用的关键。本研究采用胶原酶和胰蛋白酶联用的酶消化法从小鼠肌肉组织中分离肌卫星细胞，并对其进行了诱导分化和鉴定，以期为肌肉的发育分化和损伤修复研究提供参考。
1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验动物 10日龄昆明小鼠，体重约3.2 g。 1.1.2 主要试剂 胎牛血清（Gibco）；马血清（Gibco）；DMEM高糖培养基（Hyclone）；胶原酶Ⅱ（Sigma）；0.25%胰蛋白酶溶液（索来宝）；青链霉素混合液（10 000 mg /L青霉素、10 000 mg/L链霉素，索莱宝）；PBS（自配）；4%多聚甲醛、山羊封闭血清、羊抗兔Cy3标记二抗、羊抗兔FITC标记二抗、羊抗小鼠FITC标记二抗（武汉博士德）；DAPI、兔抗Pax7抗体、兔抗MyoD抗体、兔抗MyoG抗体（北京博奥森）；鼠抗Myosin抗体（中杉金桥）；TRIzol试剂（Invitrogen）；天 津 农 学 院 学 报 第21卷 ・2・ 反转录试剂（Takara）；PCR试剂（康为世纪）；细胞培养板、离心管、培养皿等（Corning）。 1.2 实验方法 1.2.1 小鼠肌卫星细胞分离培养 将小鼠颈椎脱臼处死后，浸泡于75%酒精中消毒5 min，然后在无菌条件下剥开后肢皮肤。将后肢切下后于平皿内小心去掉脂肪和骨骼，留肌肉组织。将肌肉组织用PBS冲洗后，于无菌平皿中用眼科剪反复剪碎至1 mm3大小。组织块置PBS中
静置，弃上清液。将PBS清洗后的组织块置于适量0.2%胶原酶Ⅱ中，于37 ℃消化1 h，每10 min振荡一次。1 000 r/min离心10 min后弃上清液，再加入0.25%胰酶，于37 ℃消化30 min，每10 min振荡一次。之后，加入含血清的生长培养基（含20%胎牛血清的DMEM培养基）终止消化，细胞悬液分别过100、200和400目细胞筛，过滤后的细胞悬液于1 000 r/min离心10 min，弃上清液，细胞沉淀用生长培养基重悬后接种于60 mm直径培养皿内，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。
1.2.2 肌卫星细胞纯化及传代培养 采用差速贴壁方法进行纯化，分离出的细胞在培养箱中培养2 h，此时贴壁细胞主要为成纤维细胞。然后，将未贴壁细胞转入新的培养皿中培养，第4天换液，去除血细胞及未贴壁的死细胞，并观察细胞生长情况。 细胞生长至70%汇合时传代，弃去培养皿中培养基，PBS洗涤1～2次后加入适量0.25%胰酶消化液，显微镜下观察，细胞胞质回缩、开始变圆时用手轻拍培养皿。当绝大部分细胞脱落后，立即加入含血清培养基终止消化，细胞悬液用枪头反复吹吸后，于1 000 r/min离心10 min，弃上清液，细胞沉淀重悬后按1∶2或1∶3接种于新培养皿内，3～5 d传代一次，每次传代均差速贴壁30 min，以去除成纤维细胞。 1.2.3 肌卫星细胞诱导分化 肌卫星细胞传代培养贴壁后，将培养基更换为分化培养基（含2%马血清的DMEM）进行成肌诱导分化培养，观察肌卫星细胞分化情况及肌管形成状态。 1.2.4 免疫染色鉴定 对纯化后的肌卫星细胞和诱导分化后的肌管进行免疫荧光染色鉴定。细胞经PBS清洗1～2次后，加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤3次，每次5 min；然后，用含0.1% Triton X−100的PBS透化处理20 min，PBS洗涤3次，每次5 min；之后，
正常山羊血清封闭30 min，弃去血清，不洗，分别加入Pax7、MyoD、MyoG和MHC一抗（1∶100）， 4 ℃过夜，PBS洗涤3次，每次5 min；再加入相应的FITC或Cy3标记二抗（1∶100），37 ℃孵育1 h，PBS洗涤3次，每次5 min；最后，加入DAPI染核，荧光显微镜观察。 1.2.5 RT-PCR鉴定 采用TRIzol法提取未分化肌卫星细胞和分化后肌管总RNA，按照RT-PCR试剂盒说明，以Oligo （dT）15和随机引物为引物，在20 μL体系中合成cDNA，以cDNA为模板，加入Pax7、MyoD、MyoG和MHC基因上、下游引物进行PCR，GAPDH作为内参照，引物序列见表1。25 μL体系反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循环35次；72 ℃延伸2 min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统采集图像。
表1 小鼠Pax7、MyoD、MyoG、MHC和GAPDH 基因引物序列表
名称 序列（5’−3’） 扩增产物/bp上游引物CCCTCTGGAGACGGAAAACCPax7下游引物GCTCTGTGACTGAGGACACC310
上游引物TTTCGACTCACCAGACCTGCMyoD下游引物GAGATGCGCTCCACTATGCT675
上游引物GAGGAAGTCTGTGTCGGTGGMyoG下游引物CCACGATGGACGTAAGGGAG395
