免疫组化原理、步骤及要注意的事项

免疫组化的完整步骤及各步原理免疫组化是一种非常神奇的实验技术，它可以帮助我们更好地了解细胞的结构和功能。

那么，免疫组化的完整步骤及各步原理究竟是什么呢？别着急，让我来给大家一一道来。

我们要了解一下什么是免疫组化。

简单来说，免疫组化就是利用特定的抗体去寻找目标蛋白，然后通过化学染色的方式将这些蛋白标记出来，这样我们就可以更加清晰地看到它们在细胞中的分布情况了。

那么，免疫组化的第一步是什么呢？没错，就是要准备好实验所需的材料和设备。

这包括：抗体、抗原、酶标板、洗涤缓冲液、PBS缓冲液、DAB染色剂等等。

当然啦，这些材料和设备都是非常珍贵的，所以我们在使用的时候一定要小心谨慎哦！接下来，我们就要开始进行免疫组化实验了。

我们需要将抗原加入到酶标板中，然后用洗涤缓冲液将其充分稀释。

接着，我们就可以将待检测的细胞涂布到酶标板上了。

这里需要注意的是，涂布的时候一定要均匀涂抹，否则就可能会影响后续的实验结果哦！涂布好细胞之后，我们就需要让它们休息一会儿了。

这个过程叫做“孵育”。

在孵育的过程中，抗体会自己找到抗原并与之结合。

这个过程通常需要几个小时的时间，具体时间取决于所使用的抗体和抗原的性质。

孵育完毕之后，我们就可以进行下一步操作了——洗涤。

洗涤的目的是去除未结合的抗原和未被抗体识别的细胞残留物。

这个过程通常需要用到PBS缓冲液或洗涤缓冲液，并且要反复洗几次才能彻底清除所有的残留物。

洗完之后，我们就可以进行染色了。

这个过程叫做“DAB染色”。

DAB染色剂可以与抗体结合产生紫色的颜色反应，从而使我们能够清晰地看到被标记出来的目标蛋白。

染色的时间通常也只需要几分钟左右就可以了。

我们还需要进行一个叫做“复染”的操作。

复染的目的是让细胞核也被染上颜色，这样我们就可以看到细胞的整体结构了。

复染通常需要用到碱性染料，比如伊红染料。

不过复染的时间也要控制好哦，过度染色可能会影响到后续的实验结果。

好了，以上就是免疫组化的完整步骤及各步原理了。

免疫组化的完整步骤及各步原理大家好，今天咱们聊聊免疫组化这门技术。

它可是生物医学研究中的一把好手，能让细胞和组织的秘密无所遁形。

咱们先从免疫组化是什么说起。

首先得明白，免疫组化是一种研究方法，它通过给样品加上抗体，让它们跟细胞里的蛋白质或分子“亲密接触”，然后通过染色来观察这些蛋白质或分子的位置和分布。

听起来是不是挺高大上的？不过别急，咱们慢慢来，一步步揭开它的神秘面纱。

1.1 准备工作开始之前，你得确保所有材料都是新鲜的、高质量的，还有那试剂啊，得是实验室里常用的那种。

别忘了准备一个显微镜，这可是观察的关键哦！1.2 固定和包埋接下来就是让细胞和组织固定在一块，这个步骤叫做固定。

把样本放到甲醛溶液或者丙酮里面一泡，就能把它们牢牢地锁住，防止它们移动。

之后呢，把固定好的样本放进树脂里，这样它们就能稳稳当当的了。

这一步是为了保护细胞和组织的结构不被破坏，方便后续的切片和染色工作。

1.3 切片把处理好的样本切成薄片，这就是切片。

切片的时候得小心，别让样本碎掉或者变形。

切片后，还得把那些乱七八糟的东西去掉，比如蜡质啊、气泡啊，这样才能让下面的染色工作顺利进行。

1.4 染色染色可是个技术活。

你得选对染料，颜色要鲜艳，还要能穿透细胞膜，把里面的物质找出来。

染色的方法有很多种，比如直接法、间接法和免疫荧光法等等。

每种方法都有它的特点，就像不同的人有不同的爱好一样。

1.5 观察染色完成后，就可以用显微镜来观察啦！看看细胞和组织里的蛋白质、分子是怎么分布的。

有时候，你还能发现一些有趣的现象，比如某些细胞里藏着很多糖，还有些地方有抗体的“家”。

这些观察结果可是非常宝贵的，能帮助我们更好地理解生物体内的奥秘。

2.1 注意事项做免疫组化实验的时候，可不能马虎哦。

记得要戴好防护眼镜和手套，避免接触到有毒有害物质。

操作时要轻柔，不要破坏样本的结构。

还有啊，处理完样本后得洗手，保持实验室的清洁和卫生。

2.2 常见问题及解决方案有时候会遇到一些问题，比如样本太干或者太湿，这时候可以试试加一点水或者甘油来调整。

免疫组化的原理
免疫组化是一种利用抗体与其特异性抗原结合的反应来检测或定位特定分子的方法。

它主要基于抗体的高度特异性与高亲和力，能够识别并结合到抗原上。

免疫组化的过程一般包括固定组织、抗原还原、孵育抗体、洗涤、孵育二次抗体和检测。

具体步骤如下：
1. 固定组织：将待检测的生物组织固定在载玻片上，通常使用形式固定剂或冷冻剂进行固定。

2. 抗原还原：对固定组织进行抗原还原处理，以破坏抗原与抗体结合时的形态学阻滞并使抗原更易于与抗体结合。

3. 孵育抗体：将含有特异性抗体的抗体溶液加到载玻片上的组织切片上，允许其与目标抗原结合。

此时，如果组织中存在目标抗原，抗体就会与其结合形成免疫复合物。

4. 洗涤：通过洗涤步骤去除未结合的抗体，减少干扰性信号的产生。

洗涤通常使用磷缓冲盐溶液或其他缓冲溶液进行多次冲洗。

5. 孵育二次抗体：加入标记有酶、荧光物质或放射性同位素等的二抗溶液，使其与已结合的抗原-一抗复合物发生反应。

二次抗体通常是对多种一抗的特异性抗体。

6. 检测：使用相应的技术，如酶标记法、荧光标记法或放射性
探测等，检测二次抗体与抗原-一抗复合物的结合情况。

通过信号的产生和可视化，可以确定抗原的存在位置以及其表达程度。

总的来说，免疫组化是一种通过利用抗体与抗原间的特异性反应，实现对目标抗原的检测和定位的方法。

其原理主要是通过抗原-抗体的结合来实现对特定分子的识别和鉴定。

一、免疫组化技术免疫组织化学（Immunohistochemistry; IHC）技术是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。

目前，这种技术在临床病理诊断和形态学研究中已得到广泛应用。

Slide 3:（一）、免疫组化常用染色方法和步骤（石蜡切片）SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）:SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）原理采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。

主要步骤:主要步骤1、石蜡切片脱蜡（与常规HE切片脱蜡相同）：石蜡切片置60 ℃烤箱烤片15小时以上→从烤箱中拿出立即放入二甲苯Ⅰ中5~10 min→二甲苯Ⅱ5~10min →无水乙醇5min →95%乙醇5min →80%乙醇5min →70%乙醇5min →自来水洗Slide 6:2、3%H2O2阻断20min（以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；PBS 洗3次，每次5min。

3、抗原修复；PBS洗3次，每次5min。

4、滴加5~10%正常山羊血清封闭，37℃, 10min (消除背景非特异性着色)Slide 7:5、吸干组织周围多余的血清，不洗，滴加第一抗体，37℃,孵育60min或孵育30min再4℃冰箱过夜；PBS洗3次，每次5min 。

6、擦干组织周围PBS，滴加生物素标记的第二抗体，37℃, 孵育20min，PBS洗3次，每次5min。

Slide 8:7、擦干组织周围PBS，滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液37℃, 孵育20min。

8、PBS洗3次，每次5min，D.W洗2次，DAB显色(DAB必须现用现配)，镜下控制显色程度，自来水冲洗，苏木素复染胞核，烤干，中性树胶封片。

染色步骤:染色步骤石蜡切片脱蜡到水；3%H2O2阻断10min（以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；蒸馏水洗2次，PBS洗3次，每次5min。

免疫组化原理及步骤免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学,就是指带显色剂标记得特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应与组织化学得呈色反应,对相应抗原进行定性、定位、定量测定得一项新技术。

它把免疫反应得特异性、组织化学得可见性巧妙地结合起来,借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)得显像与放大作用,在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器与通风橱等、三、试剂配制1、0。

01M PBS(ｐH 7.34 ):9.０g ＮａCl + ５0 mｌ０.2 M PB加双蒸水至１0０0ml;１000 mｌ0。

２M PB(ｐH7、4)＝5。

93 ｇＮaH２ＰＯ4 ·2Ｈ2 O+５8。

０2 g Na ２HPO 4 ·１2Ｈ 2 O in １000 ｍl双蒸水或=190ml A +810 ml B(A、０、2ＭＮaH 2 ＰO 4 ·2H ２O:15。

6 ｇｉn 500ml ddH 2 O;Ｂ。

０、2ＭNa 2 ＨPＯ 4 ·12H 2 O:７1、６32ｇin 1000 ｍl ｄH 2 O)。

2. Ｃｉｔrate Buｆfered Saliｎe(０。

01 M 柠檬酸缓冲液,PＨ6.０):28 ml A + 72 mｌB + ２00 mｌｄdＨ２Ｏ(Ａ。

Cｉtｒate aciｄ(柠檬酸):10.５g 加双蒸水至1０00ml;Ｂ。

C ｉtrate sodｉum(柠檬酸钠):29。

41 g 加双蒸水至1000 ml)、３、细胞通透液:由终浓度分别为0.3％双氧水与0、３%Trｉton X－100 混合而成。

配制方法就是先用微波加热得36ｍｌPBS,再接着加120 ｕｌＴritonＸ－10０,并加热一儿,冷却至临用前加0。

４ｍl 30％H 2 O 2 。

免疫组化实验流程及常见问题1 免疫组化概念原理2 免疫组化染色步骤目录3 结果分析4 常见问题分析※免疫组化原理PART 1免疫组化概念原理※免疫组化样本种类免疫组化概念原理免疫组化学（immunohistochemistry，IHC）应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究样本种类：组织标本和细胞标本两大类，包括石蜡切片（IHC-P）和冰冻切片(IHC-P)，细胞片(ICC)。

※实验步骤流程图※样本取材固定PART 2免疫组化染色步骤※实验步骤讲解实验流程图种器官，优先取消化器官，其次取中枢神经系统器官(脑，脊髓等)，皮肤、肌肉等可放到最后取。

3.组织块大小：未经灌注的标本组织厚度不要超过1cm 。

5.固定液量：固定液体积为组织的10倍，且组织能在容器内自由移动，不贴壁不沉底，并做好清晰标记。

4.固定液：针对不同的标本特点及实验目的一定要选用正确的固定液，4%多聚甲醛，有致密外膜Carnoy 液，活检用Bouin 。

7.固定温度：常温即可，无需冷藏，切勿冷冻结冰，否则固定液结冰形成冰晶严重破坏组织形态结构6.固定时间：6-24h最佳，固定越久所需修复强度越大，容易出现非特异性。

取材及固定切片选择要保存简单--- 选石蜡片!要速度快---选冰冻片!要结构漂亮---选石蜡片!抗原不稳定---选冰冻片!抗原稳定---石蜡片冰冻片皆可!组织形态结构保存完好顺序：新鲜组织立即投入固定液内固定石蜡切片>组织-80°冷冻后投入固定液内固定石蜡切片>新鲜组织立即投入固定液内固定冰冻切片>组织-80°冷冻后直接冰冻切片。

切多厚?脱蜡步骤石蜡片3-8um ， 一般4-5um;冰冻片5- 15pm,一般8μm水温40-45 ℃, 组织平整后玻片有油漆的一面贴近组织向斜上方提起怎么捞片?烤多久?37 ℃ 过夜或 60 ℃ 1-2h 注意:使用防脱处理的玻片实验步骤切片烤片实验步骤：灭活1内源性过氧化物酶在血管瘤、肝、胎盘、阑尾炎,坏死区域和急性炎症组织含量较高 2显色系统为过氧化物酶 (HRP )系统，该步骤建议一定要做3碱性磷酸酶 (AP )系统以及免疫荧光，该步骤可以不做4在灭活时,如组织片中出现细小且密集的气泡，表示过氧化物酶含量过高，这时用 3%H2O2溶液难以完全阻断，可以用0.5%高碘酸溶液室温条件孵育10min实验步骤柠檬酸盐缓冲液( PH6.0 )和EDTA( PH8.0或9.0)修复液经验证，对于大多数的抗体来说后者使用效果更优固定时间越久，修复强度越强旧标本修复强度强于新鲜标本3修复液的选择1 抗原修复方式4消化酶的选择需格外注意的各种消化酶的最佳工作PH值2消化酶的选择抗体选择1单抗和多抗各有优势，按需选用2 一抗4°C孵育效果最佳，备选37 ℃ 1-2h 3二抗需与一抗的种属、类别或亚类相匹配，推荐驴，山羊,绵羊等种属4二抗/SABC -般37 ℃孵育30 min 封闭1 5%BSA是最常用2血清，效果最全面3封闭血清与抗同源，与一抗不能同源封片1 DAB显色用中性树胶封片2免疫荧光建议用抗荧光衰减封片剂3 AEC显色用水溶性封片剂显色1 DAB显色液现用现配2建议镜下控制反应时间3根据显色时间反向优化实验条件※抗原定位※结果分析方法PART 3结果分析抗原定位胞膜型表达胞核型表达胞质型表达胞膜-质型表达胞核-质型表达抗原定位查数据推荐：01 Option here02Option here 评分法:通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度( 0-3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色)、阳性范围进行评分(1-4分为0-25%、26 -50%、51-75%、76-100%) ，最终可以分数想加，再进行比较阳性着色细胞计数法:在40X光镜下,随机选择不重叠的3-5个视野，人工或机器计数阳性着色细胞和总细胞数，比较阳性细胞比率图片软件分析:通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用图片分析软件进行分析，然后进行统计分析即可H-SCORE分析:设置组织切片上所有的深棕色为强阳性，棕黄色为中度阳性，浅黄色为弱阳性，蓝色细胞核为阴性。

十五、免疫组化流程
1、65℃烤片1-2h
2、从65℃烤箱中拿出切片立即放入二甲苯Ⅰ中脱蜡15min，二甲苯Ⅱ15min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min，95%乙醇5min，85%乙醇5min，75%乙醇5min。

3、自来水冲洗5min。

4、蒸馏水冲洗3遍。

5、高压修复（先将修复液煮沸后，将片子放入煮沸溶液中，将压力锅盖盖好，当气阀冒气时，开始计时2分40秒，此时将温度调至140℃）。

6、将电磁炉电源关闭，用自来水冲洗压力锅锅盖，至气阀自然落下，将锅盖打开，自然降至室温（约40min左右）。

7、PBS浸泡5min*3次。

8、3%的H2O2封闭30min。

9、蒸馏水冲泡2次。

10、PBS浸泡5min*3次。

11、加Ⅰ抗8张片子，每片80μl8*80=640μl
配700μl700μl（释液）+7μl（Ⅰ抗）
12、室温放置30min，放4℃过夜。

13、第二天拿至室温平衡30min（提前准备PBS）
14、PBS洗5min*3次
15、加Ⅱ抗 50-100μl张37℃ 30min，或室温1小时
16、PBS洗5min*3次
17、DAB显色（2min）。

18、流水中止，流水冲洗5min。

19、苏木素复染（2min），流水中止，流水冲洗5min。

20、梯度酒精脱水各5min（从无水乙醇拿出风干片子，再放入二甲苯中）。

21、二甲苯透明各15min。

22、用中性树胶封片。

盐酸酒精500ml无水乙醇+250ml蒸馏水+6ml盐酸
氨水600ml蒸馏水+2m氨水
氨水作用：返蓝。

免疫组化法免疫组化法是一种利用特异性抗体与细胞内实体形成特异性结合来研究细胞上特定分子的分布方法。

这种技术比其他技术更具灵敏度、准确度和可靠性。

它可用于研究细胞内分子的表达和组织，广泛应用于生物学、医学等多个科学领域。

本文旨在对免疫组化法的基本原理、操作步骤、应用范围以及可能存在的问题进行系统的介绍。

1.疫组化法的基本原理免疫组化法是利用特异性抗体与细胞内实体形成特异性结合来研究细胞上特定分子的分布。

它的基本原理是，抗体首先结合细胞内的抗原，而后这种特异性结合将被放大以便显微镜下观察。

抗体可以是免疫动物免疫产生的单克隆特异性抗体，也可以是合成的多克隆抗体。

一旦抗体与目标抗原结合，它们便可以被以多种方式检测出来，可以在细胞或组织中就地检测，也可以把细胞拆散后重新检测。

2.疫组化法的操作步骤免疫组化法首先要确定目标抗原，然后根据抗原特性选择抗体。

接下来，将抗体和细胞或组织结合起来，通常需要表面活化物，如胶原、硅胶等材料。

接下来可以引入环境因子，如氧化剂、衰老因子等，调控动物细胞的生长和代谢。

随后可以根据需要采用细胞固定、免疫丝切片技术等方法来分析细胞结构和分子的分布。

最后，可以采用活性染色法、免疫荧光技术、共沉淀反应等技术来定量检测抗原的表达和结构分布。

3.疫组化法的应用范围免疫组化法可以用来定量衡量细胞内有毒物质的积累和分布，可检测细胞内蛋白质、脂质、DNA等物质，也可以用来比较不同细胞或不同组织、不同器官之间的分子表达量和组织分布，以及细胞成分的变化情况。

它可以用来研究物质的重组、修饰及转移方向，也可用来研究突变基因在细胞或组织上的表达情况，以及对不同病症的发病机制等。

4.能存在的问题免疫组化法具有良好的特异性和灵敏性，能够检测细胞和组织中的分子表达及结构分布，但不同抗体之间存在特异性差异，可能存在抗体偏聚、抗原取代等问题，需要进行抗体验证才能确保试验结果的可靠性。

此外，固定细胞的方法也是一个可能的问题，一般来说，固定的细胞很难保留原始的细胞结构和分子分布，或者可能存在过度固定的情况，可能会影响结果可靠性。

免疫组化基本原理及操作流程免疫组化技术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的方法，用于检测和定位特定的抗原或抗体在细胞或组织中的存在和分布。

免疫组化的基本原理是利用抗原与抗体之间的高度特异性结合来实现抗原的检测和定位。

免疫组化的基本操作流程如下：第一步：标本处理标本可以是细胞培养物、组织切片、血液等。

在进行免疫组化前，首先需要对标本进行适当的处理，以使得抗原能够得到良好的保存和定位。

处理方法包括固定、脱水、包埋等。

固定是将标本用适当的化学物质处理，使其固定在载玻片上，并保持其原有的形态和结构。

第二步：抗原检测与定位在标本处理完成后，可以开始进行抗原的检测和定位。

这一步需要使用特异性的抗体来与目标抗原结合。

抗体通常通过动物免疫技术获得，即将纯化的抗原注射到动物体内，激发其产生特异性的抗体。

抗体经过收集和纯化后，将其与抗原所在的标本接触，通过抗原与抗体的特异性结合来检测和定位抗原的存在和分布。

第三步：抗体检测抗体检测是免疫组化中至关重要的一步。

通常使用标记抗体来检测抗原的存在和定位。

标记抗体是一种与特定抗体共价结合的物质，它可以通过荧光染料、辣根过氧化物酶、生物素等标记物来实现抗原的检测和定位。

标记抗体通过特异性结合抗原，使得抗原能够在显微镜下观察到，并确定其存在的位置。

第四步：显色与观察在完成抗体检测后，需要进行显色以使抗原能够在显微镜下观察到。

显色方法包括使用荧光显色、暗场显色、免疫酶染色等。

其中，免疫酶染色是最常用的方法，它通过在抗体中添加酶标记物，如辣根过氧化物酶（HRP），再加入适当的显色底物，使其生成可见的色素沉淀。

经过显色后，使用显微镜观察标本，可见到抗原的存在和定位。

第五步：结果分析与解读在观察到显色结果后，需要对结果进行分析和解读。

根据显色的程度和分布情况，可以判断抗原的阳性与阴性。

阳性表示抗原在样品中存在，而阴性则表示抗原在样品中不存在。

结果的解读需要结合临床和实验的背景知识进行综合分析。

免疫组化步骤及原理免疫组化是一种用于检测和定位特定细胞组织中特定分子的技术。

它可以帮助我们研究细胞的结构和功能，并在疾病诊断和治疗中发挥重要作用。

以下是免疫组化的步骤及其原理。

步骤一：标本固定免疫组化的第一步是将待检测组织样本固定在载玻片或其他固定载物上。

常用的固定剂包括福尔马林（formalin）和牛血清白蛋白（BSA）。

固定的目的是保持组织的形态结构并防止其腐解。

步骤二：脱水和去蜡接下来，固定的组织样本通常需要通过一系列酒精浓度逐渐脱水，然后使用组织蜡进行浸泡固化。

蜡浸泡的目的是保护组织细胞结构，并便于切片及后续的免疫标记。

步骤三：抗原暴露在进行免疫组化之前，需要通过抗原暴露步骤使组织样本中的目标分子或抗原暴露出来，便于其和抗体的结合。

这可以通过热处理（如加热松弛），酶解（如胰蛋白酶消化）或抗原修复剂（如热带缓冲液或消化酶）进行。

步骤四：非特异性结合位点的阻断为了阻断非特异性结合位点，需要在进行免疫反应之前进行非特异性抗体预处理。

这可以通过与蛋白质或动物血清结合的非免疫球蛋白（如Bovine Serum Albumin，BSA）或鱼胶（Fish Gelatin）来实现。

这样，可以降低背景信号并提高特异性。

步骤五：抗体结合在免疫组化过程中，使用特异性抗体与待检测的目标分子结合形成免疫复合物。

这些抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。

单克隆抗体是由同一B细胞产生的一类抗体，具有高度特异性，并且可以与特定的抗原结合。

多克隆抗体则由多个B细胞产生，可以结合目标分子的多个表位。

步骤六：荧光或酶标记的二抗结合为了检测抗体和目标分子的结合，可以使用荧光染料或酶标记的二抗。

荧光染料（如FITC，Cy3，Cy5等）可以在荧光显微镜下观察到相应的光信号。

酶标记的二抗通常使用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）来标记，这些酶可以催化或参与染色反应，并在光镜下呈现颜色。

步骤七：显色和观察显色的方法根据使用的标记物不同而有所不同。

免疫组化实验具体步骤及说明免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种用于检测组织部分或特定分子的表达、定位和定量的技术。

它基于抗原抗体相互作用的原理，通过特异性的抗体与目标分子结合形成复合物，再通过染色反应显示出目标分子的位置和数量。

IHC广泛应用于癌症诊断、疾病研究和药物开发等领域。

以下是免疫组化实验的具体步骤及说明：1.标本制备：首先，取得切片的组织标本，通常是经过固定和包埋的组织。

然后，将组织切片取下玻片，用去离子水处理。

最后，将切片分别置于乙醇溶液中进行脱水，再用苯酚或其他抗氧化剂处理，以保护切片的蛋白质结构。

2.去蜡：将切片置于细胞清洗液中，用搅拌器在室温下搅拌，去除蜡层。

然后，分别使用乙醇降级脱水和再次用去离子水处理，以去除残留的蜡。

3.抗原检出：使用特定的抗体来检测目标分子。

首先，在切片中添加抗原修复溶液，进行退火和抗原修复，以恢复抗原的免疫原性。

然后，用PBS洗涤切片，去除剩余的抗原修复液，并将切片与蛋白质阻断剂孵育，以防止非特异性结合。

最后，将切片与特异性的初级抗体孵育，以形成抗原-抗体复合物。

4.特异性结合检测：添加特异性的二级抗体，如辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗鼠IgG，与初级抗体特异性结合。

此外，还可以使用荧光标记的二级抗体，以便通过显微镜直接检测目标蛋白质的荧光信号。

完成二级抗体与抗原复合物的结合后，用PBS洗涤切片。

5.信号放大与检测：对于HRP标记的二级抗体，使用辣根过氧化物酶底物，如DAB（二氨基苯类胺）或TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）。

这些底物在酶作用下会形成可见的棕色沉积物。

对于荧光标记的二级抗体，在显微镜下直接检测荧光信号。

6.染色和显微镜观察：将切片用PBS洗涤，然后用余晖蓝染色溶液浸泡，以增强显微镜下观察的对比度。

最后，用水轻轻冲洗切片，除去多余的染色剂。

用显微镜观察切片，评估目标蛋白质的表达和定位。

免疫组化原理及步骤免疫组化操作规程一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学,是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应,对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。

它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来,借助显微镜 (包括荧光显微镜、电子显微镜的显像和放大作用,在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质 (如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等。

二、实验器材微波炉、吹风机、组化笔、湿盒、烤箱、振荡器、染缸、光学显微镜、纯木浆卫生纸、计时器和通风橱等。

三、试剂配制1. 0.01 M PBS(pH 7.34 :9.0 g NaCl + 50 ml 0.2 M PB 加双蒸水至 1000 ml;1000 ml 0.2M PB (pH 7.4=5.93 g NaH 2 PO 4 ·2H 2 O+58.02 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O in 1000 ml 双蒸水或=190 ml A + 810 ml B(A. 0.2 M NaH 2 PO 4 ·2H 2 O:15.6 g in 500 ml ddH 2 O; B. 0.2M Na 2 HPO 4 ·12H 2 O:71.632 g in1000 ml dH 2 O。

2. Citrate Buffered Saline(0.01 M 柠檬酸缓冲液, PH6.0:28 ml A + 72 ml B + 200 ml ddH 2 O(A.Citrate acid (柠檬酸 :10.5 g 加双蒸水至 1000 ml ; B.Citrate sodium(柠檬酸钠:29.41 g 加双蒸水至 1000 ml。

3. 细胞通透液:由终浓度分别为 0.3%双氧水和 0.3%Triton X-100 混合而成。

配制方法是先用微波加热的 36 ml PBS, 再接着加 120 ul TritonX-100,并加热一儿,冷却至临用前加 0.4 ml30%H 2 O 2 。

免疫组化实验原理及其步骤免疫组化实验是一种在细胞或组织样本中检测特定抗原的科学方法，它通过使用抗体来标记和识别特定的蛋白质。

这项技术在医学诊断、生物研究以及法医学等领域都有广泛的应用。

今天，我们就来聊聊这个既神奇又有趣的免疫组化实验原理及其步骤。

我们要明白什么是免疫组化。

简单来说，免疫组化就是用抗体去“染色”，就像给画上的线条上色一样。

这些抗体就像画家的调色板，它们能够识别和结合到那些特定的蛋白质上。

我们再用一种叫做荧光染料的特殊物质去“点亮”那些被抗体找到的蛋白质，这样我们就可以看到那些隐藏在细胞深处的秘密了。

免疫组化的步骤是什么呢？让我们一步步来揭秘。

我们需要准备样本。

这就像是我们去参加一个派对之前需要准备的衣服和鞋子一样，准备工作做好了才能顺利进行。

我们会将样本进行固定，就像把照片贴在墙上一样，让那些蛋白质们暂时安定下来。

我们会把抗体涂上去，就像给衣服上色一样，让它们能够找到那些蛋白质。

我们会用一种特殊的化学物质去“点亮”那些被抗体找到的蛋白质，就像用灯光照亮黑暗一样，让那些隐藏的秘密变得清晰可见。

这个过程听起来是不是有点像侦探破案呢？没错，这就是我们的“侦探过程”。

在这个过程中，每一个步骤都至关重要，就像是每个细节都隐藏着线索一样。

如果有一个环节出了问题，比如抗体没有找到目标，或者染色不够鲜艳，那么我们就无法得到清晰的结果。

所以，我们在做实验的时候一定要细心，就像侦探在调查案件时一样，不放过任何一个可能的细节。

免疫组化实验就像是一场寻找隐藏在细胞深处的秘密的游戏。

我们需要耐心地准备样本，小心翼翼地进行每一步操作，才能最终揭开那些被隐藏的真相。

这个过程虽然有些复杂，但是当我们看到那些明亮的荧光斑点时，所有的努力都会变得值得。

所以，下次当你看到那些发光的斑点时，不要忘了感谢那些为我们揭示秘密的“侦探们”。

免疫组化实验步骤、常见问题及解决方案免疫组化实验虽然看上去非常简单，然而做起来却容易“花样百出”，让实验人员的精神备受摧残。

因此，今天小编在这里跟大家详细介绍一下免疫组化实验的步骤以及常见问题和解决方案，让大家的免疫组化实验更加顺畅。

免疫组化实验主要包括石蜡切片的免疫组化技术(IHC-P)和冰冻切片的免疫组化技术(IHC-F)，今天主要讲的是IHC-P。

实验步骤详解：1，取材颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取所需的组织，切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透。

注意取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化，切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。

2，切片制备(1)固定将切好的组织(<5mm3)用生理盐水组织洗一下，立即投入4%多聚甲醛(PFA)或10%中性福尔马林(NBF)中固定，根据组织大小和松密程度室温4-48h。

若取材是小鼠大脑或神经组织，可以采用灌流的方式进行固定。

(2)洗涤材料经固定后,水或酒精(若采用含有苦味酸的固定剂bouin，就用酒精洗涤)冲洗，数小时或过夜，目的是去除组织内固定液及结晶沉淀。

(3)脱水目的是因为透明剂多是苯类，苯和水不互溶，用到的材料是酒精，将组织依次经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95%、100%各2次，每次20min。

(4)透明由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。

当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。

一般是用纯酒精、二甲苯等量混合液浸润材料1-2h，再换纯透明剂(二甲苯、苯、氯仿、正丁醇)。

(5)浸蜡和包埋透蜡的目的是除去组织中的透明剂(如二甲苯等)，使石蜡渗浸到组织内部达到饱和程度以便包埋。

先放入二甲苯和石蜡各半的混合液，再放入熔化的石蜡中浸润，透蜡时间根据组织大小而定。

浸蜡之后放入包埋盒用石蜡进行包埋。