第三章免疫酶组织化学技术

酶免疫组织化学技术的操作程序一、取样和固定1. 从动物或人体组织中取得所需样本，并尽快进行处理，以避免样本的降解。

2. 将样本放入适当的缓冲液中进行固定。

常用的固定液包括4%的中性缓冲甲醛和70%的乙醇。

固定时间视样本大小和类型而定，通常为24小时。

二、包埋和切片1. 固定后，将样本从固定液中取出，进行脱水。

脱水过程中，需逐渐用浓度递增的乙醇替换固定液，使组织逐渐脱水。

2. 在脱水完成后，将样本置于透明剂（如苯胶）中浸泡，使其透明化。

3. 将透明化后的样本置于熔蜡中，使其浸透于蜡中。

4. 将浸透于蜡中的样本置于组织芯片中，使其与蜡块紧密结合。

5. 利用组织切片机将蜡块切割成薄片，厚度通常为3-5微米。

三、抗原修复和抗体染色1. 将蜡块上的切片放在载玻片上，并进行抗原修复。

抗原修复可以通过热解蜡或酶解蜡来完成。

2. 在抗原修复完成后，使用PBS（磷酸缓冲盐溶液）或TBST（三丁基甲酸盐缓冲盐溶液）进行洗涤，去除残留的蜡块和其他污染物。

3. 在洗涤完成后，将抗体溶液加到载玻片上，与待测蛋白质发生特异性反应。

抗体可以是一种单克隆抗体或多克隆抗体。

4. 将载玻片置于湿润箱中，保持恒定的温度和湿度，进行抗体与待测蛋白质的结合反应。

反应时间视抗体和待测蛋白质的特异性而定，通常为1-2小时。

四、酶标记和显色1. 在抗体与待测蛋白质的结合反应完成后，进行洗涤，去除未结合的抗体。

2. 加入酶标记的二抗或多抗，与第一次结合的抗体发生反应。

常用的酶标记物有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。

3. 经过二次抗体的结合反应后，进行洗涤，去除未结合的二抗。

4. 加入显色底物，使酶标记物发生显色反应。

常用的显色底物有DAB（二氨基联苯胺）和BCIP/NBT（硝基蓝四唑/硝基蓝硝酮）。

五、结果分析和观察1. 经过显色反应后，用清水冲洗载玻片，停止显色反应。

2. 将载玻片进行脱水，并用透明剂进行封片。

3. 使用显微镜观察载玻片下的切片，观察待测蛋白质的表达情况和定位。

免疫酶技术的原理及应用1. 什么是免疫酶技术？免疫酶技术是一种利用抗体-抗原相互作用进行生物分析的方法。

它通过利用抗体与特定抗原结合的高度特异性，将酶标记的抗体用于检测和定量目标分子，广泛应用于医学、生物学和生物化学等领域。

2. 免疫酶技术的原理免疫酶技术的原理是基于抗原与抗体之间的高度特异性结合。

一般来说，免疫酶技术包括以下几个步骤：2.1 抗原的制备首先，需要获得目标分子的抗原。

抗原可以是蛋白质、多肽、病毒、细胞表面蛋白等。

通常，抗原会被纯化并加工成适合免疫动物生产抗体的形式。

2.2 抗体的制备接下来，需要制备与目标分子结合的特异性抗体。

通常，抗原会被免疫动物（如兔子、小鼠等）注射，形成抗体。

2.3 酶标记的抗体制备为了便于检测和定量目标分子，可以将酶标记与抗体结合，形成酶标记的抗体。

常用的酶标记包括辣根过氧化酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等。

2.4 抗原-抗体结合反应将样品中的目标分子与酶标记的抗体一起孵育，使抗原与抗体发生特异性结合。

这样，目标分子就被标记上了酶，成为可检测的复合物。

2.5 酶的作用和检测添加适当的底物和辅助试剂后，酶会催化底物的反应，产生可测量的信号。

常见的底物有TMB（3，3′，5，5′-四甲基苯基二氨基甲烷）、BCIP（溴硝基硼邻萘酚磷酸盐）等。

3. 免疫酶技术的应用免疫酶技术在医学、生物学和生物化学等领域有广泛的应用。

以下是免疫酶技术的一些常见应用：3.1 免疫诊断免疫酶技术在临床诊断中被广泛应用。

例如，ELISA（酶联免疫吸附测定法）通过检测血清中特定抗原或抗体的浓度，可以用于诊断疾病，如各类感染病、自身免疫性疾病等。

3.2 蛋白质检测和定量免疫酶技术可以用于检测和定量蛋白质。

例如，Western blotting可以检测特定蛋白质在混合蛋白中的表达情况，通过与标准曲线比较，可以定量目标蛋白的含量。

3.3 免疫组织化学免疫组织化学是一种在组织切片上检测特定蛋白质表达的方法。

免疫组织化学技术的应用免疫组织化学技术概述免疫组织化学技术是一种利用免疫学原理进行生物分子检测和定位的技术。

它采用抗体与特定抗原结合的顺反应原理，在组织切片中检测和定位某一特定分子。

原理免疫组织化学技术利用抗体与特定抗原结合的顺反应原理，即对一种特定抗原有高度选择性的抗体与组织样品中的该抗原相结合产生可见的信号。

这种信号可以是产生光学、荧光或颜色改变等形式。

应用1.生物医学研究：免疫组织化学技术可以检测组织中特定蛋白质的分布和表达，是研究生物医学领域中蛋白质分子组学的基础技术之一。

2.临床诊断：免疫组织化学技术可以应用于肿瘤诊断、流行病学调查等领域。

通过检测某些肿瘤标志物、细胞表面分子和内分泌指标等，可以帮助医生进行正确诊断。

3.药物制剂：免疫组织化学技术可以帮助研究药物分布和作用机制。

例如，在研究心血管药物时，可以用抗体检测受体的表达和分布，从而了解药物作用机制和药效。

优点1.高度特异性：免疫组织化学技术可以准确地检测特定分子，避免了其他分子的干扰。

2.高灵敏度：可以检测极微量的分子，并精确定位其位置。

3.多样性：可以应用于不同分子种类的检测和定位，有很大的应用前景。

局限性1.抗体交叉反应：某些抗体可能对多种分子有交叉反应，导致误判。

2.样品制备：样品的制备和处理对结果产生影响，需要更加严格的标准化。

3.价格昂贵：用于免疫组织化学技术的抗体相对价格较高，加上试剂盒和设备的购买，成本较高。

结论免疫组织化学技术作为一种重要的实验室技术，具有广泛的应用前景。

这种技术可以在细胞和分子层面上全面解析生物体的结构和功能，是生物医学领域中不可或缺的技术之一。

免疫组织化学技术的操作步骤1.标本制备：首先需要采集组织样本，处理后制成组织切片。

2.抗体处理：挑选合适的抗体，经过处理（如荧光标记、酶标记等），制成特定的抗体试剂。

3.特定抗原检测：在组织切片上滴加特定抗体试剂，进行特定抗原的检测。

4.反应信号检测：根据抗体的标记方式，进行相应信号的检测。

免疫组织化学技术名词解释免疫组织化学技术是一种应用于组织学研究和病理诊断中的实验技术，用于检测和定位特定抗原在组织中的表达和分布。

免疫组织化学技术结合了免疫学和组织学的原理和方法，使得我们能够在组织切片中检测到特定抗原，并通过染色的方式将其可视化。

1. 免疫染色：免疫组织化学技术的核心是免疫染色。

免疫染色是通过将特异性的抗体与待检测物质结合，并标记上染色物质，从而实现对抗原的检测和定位。

常用的染色物质包括标记着色剂如酶、荧光物质和金颗粒等。

2. 抗原：抗原是一类能够诱导机体产生抗体的物质。

在免疫组织化学技术中，抗原可以是蛋白质、多肽或者是其他小分子化合物。

通过特异性的抗体和抗原的结合来实现对抗原的检测和定位。

3. 抗体：抗体是机体特异性免疫应答产生的一类蛋白质分子。

抗体能够与特定抗原结合，并通过诱导免疫反应来清除抗原。

在免疫组织化学技术中，通过标记抗体对待检测抗原进行检测和定位。

4. 免疫组织化学染色法：免疫组织化学染色法是一种检测并定位抗原的方法。

根据标记抗体的不同，可以分为酶标法、免疫荧光染色法和免疫金染色法等。

其中，酶标法是最常用的方法之一，通过将酶标记的抗体与待检测抗原结合，然后通过酶的催化作用使染色物质可视化。

5. 免疫组织化学实验步骤：免疫组织化学技术包括多个实验步骤，一般包括组织固定、切片、抗原恢复、阻断、一抗和二抗结合、洗涤、染色和显微镜观察等。

每个步骤都需要严格的操作和控制条件，以保证实验的可靠性和准确性。

6. 免疫组织化学应用：免疫组织化学技术广泛应用于医学研究和病理诊断中。

在医学研究领域，免疫组织化学技术可以用于研究疾病的发生和发展机制、寻找新的生物标志物以及评估药物的疗效等。

在病理诊断中，免疫组织化学技术可以用于帮助确定肿瘤类型、检测特定蛋白的异常表达以及判断预后等。

7. 免疫组织化学技术的优点和局限性：免疫组织化学技术具有高度的特异性和灵敏度，可以实现对细胞和组织水平上抗原的定量和定位。

第二章酶组织化学技术酶（enzyme）是生物体内具有催化作用的特殊蛋白质，在细胞的各个部位都有酶的存在。

人和动物体内的各种化学反应（包括新陈代谢反应）都必须由酶来催化，没有酶的存在，体内生物化学反应就无法进行。

组织及细胞中含有多种酶类，主要包括碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、ATP酶、非特异性酯酶、胆碱酯酶、琥珀酸脱氢酶、γ-谷氨酰转肽酶等。

组织细胞内的各种酶均不具有使其本身直接可见性的特性，常需用某些方法在一定条件下将组织细胞中的酶作用于特定的底物，以底物分解产物作为反应物质，在原作用部位进行捕捉反应，从而使其具有可见性。

这种通过酶的作用形成反应产物，经捕捉反应来显示细胞和组织结构中的各种酶，并对其进行定性、定位、定量的方法称为酶组织化学反应。

酶组织化学技术在人类认识疾病的科学实践中曾非常活跃，50~60年代在病理学上的应用达到高峰。

它所涉及的内容相当广泛，如利用酶组织化学方法研究生物体内细胞形态与其代谢、功能的关系；在病理学领域中，研究疾病发生、发展的代谢基础；肿瘤的诊断及鉴别诊断；肿瘤的代谢功能及形态与酶组织化学的变化规律；以多种酶组织化学指标显示细胞损害程度，从而检测新药物及其临床毒性等。

但由于酶组织化学技术操作较复杂，需用新鲜组材料，且多数反应特异性不高，故其应用受到限制。

同时因酶为蛋白质，它在福尔马林固定及石蜡包埋的组织中虽然失去了酶活性，但仍具有免疫原性，这使得应用较为特异的免疫组织化学方法显示酶成为可能，因而不少酶组织化学染色现已被免疫组织化学技术所代替。

但应指出的是，有一些酶组织化学方法仍以其良好的特异性在病理诊断及研究领域被广泛应用。

目前最常应用于诊断的酶组织化学方法有骨骼肌相关酶（用于诊断肌病）、乙酰胆碱酯酶（用于诊断先天性巨结肠）、氯乙酸酯酶（用于辨认骨髓髓细胞系统的细胞和肥大细胞）以及酸性磷酸酶等染色方法。

第一节酶组织化学反应的方法和基本原理一、酶组织化学反应的主要方法和基本原理1．金属沉淀反应法酶的分解产物可与大多数金属结合，金、银、铜、铁、铅、钴及其化合物均具有颜色，因此，在酶反应时使其与金属结合，利用其呈色反应，显示出酶反应的部位，间接地证明某种酶的存在。

临床免疫学检验技术定的一项免疫检测方法。

目录CONTENTS第一节第二节第三节第四节酶免疫组织化学技术第五节第六节影响免疫组织化学技术的主要因素免疫组织化学技术的临床应用免疫标记电镜技术亲和组织化学技术荧光免疫组织化学技术免疫组织化学过程1抗原的提取与纯化2制备特异性抗体3标记物与抗体结合形成标记抗体4标本的处理与制备基本过程5抗原抗体免疫学反应以及标记物呈色反应6观察结果免疫组织化学技术分类酶免疫组织化学技术免疫标记电镜组织化学技术标记物不同荧光免疫组织化学技术亲和组织化学技术免疫金（银）组织化学技术酶免疫组织化学技术0104定义：在一定条件下，应用酶标抗体（抗原）与组织或细胞标本中的抗原（抗体）发生反应，催化底物产生显色反应，通过显微镜观察标本中抗原（抗体)的分布位置和性质，也可通过图像分析技术达到定量的目的。

标本类型：组织切片、组织印片和细胞涂片等。

分类酶桥法过氧化物酶抗过氧化物酶（PAP ）法双桥PAP 法碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶（APAAP ）法非标记抗体酶免疫组化技术酶标记抗体免疫组化技术直接法间接法直接法间接法优点操作简便特异性强检测敏感性高制备一种酶标二抗可用于检测多种抗原或抗体缺点敏感性低制备的抗体种类有限特异性不如直接法操作较为繁琐非标记抗体酶免疫组织化学染色酶桥法：抗酶抗体作为第三抗体，通过桥抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原的第一抗体与第三抗体连接起来，形成酶联的抗原-抗体复合物，加底物显色（图12-1）。

过氧化物酶抗过氧化物酶（PAP）法：是在酶桥法基础上加以改良。

PAP法首先将酶桥法的第三抗体（抗酶抗体）与酶组成可溶性复合物（PAP复合物，图12-2）。

该复合物由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组成，呈五角形结构，非常稳定。

通过桥抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原的第一抗体与PAP复合物的抗酶抗体连接起来，此时要求特异性第一抗体与第三抗体的动物种属相同（图12-3）。

免疫组织化学技术
免疫组织化学(immunohistochemistry)，也称免疫细胞化学(immunocytochemistry)，是由免疫学和传统的组织化学方法相结合发展形成的研究方法，能定位、定性或定量检测组织切片上的特殊蛋白质、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受体、病原体等。

利用抗原与抗体能特异性结合的原理，用标记的抗体(或抗原)与组织或细胞中的特定抗原(或抗体)结合，形成带有标记物的抗原抗体复合物。

通过普通显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察标记物，从而证明这些抗体或抗原物质在组织细胞内的分布。

根据标记物的不同，免疫组织化学染色可分为免疫荧光组织化学技术、免疫酶组织化学技术、亲和免疫组织化学技术、免疫金银及铁蛋白标记技术等。

免疫组织化学方法将形态学改变与功能和代谢结合起来，既保持了传统形态学对组织和细胞的客观、细致形态观察的优点，又克服了生物化学、免疫学反应只能定性和定量不能定位的缺点，已成为生物医学各学科领域的重要研究手段。

在生物学、医学等领域的研究和诊断中日以显出巨大的实用价值，尤其在肿瘤病理学中已成为常规的诊断方法。

标记在抗体上的荧光素
荧光素标记的羊抗兔IgG (间接荧光抗体)
兔抗人角蛋白的IgG(特异性抗体)
人组织细胞中的抗原(如角蛋白)
直接法间接法
免疫荧光组织化学方法示意图
组织切片的免疫酶组织化学染色培养细胞的亲和免疫组织化学染色
免疫荧光染色免疫荧光染色
(兰色为细胞核，红色为角蛋白) (兰色为细胞核，绿色为上皮膜抗原)。

酶免疫组织化学染色技术一、酶免疫染色原理酶免疫组织化学染色技术是一种利用酶催化反应原理，将抗体与酶结合，形成酶标抗体，并将其固定在组织上，通过显色反应，检测抗原-Ab的结合，从而对组织中的抗原进行定位、定量及定性的一种免疫组织化学技术。

酶免疫染色原理主要包括酶促反应和免疫反应两个阶段，其中酶促反应阶段主要是抗体与酶的结合，而免疫反应阶段则是抗原-Ab的结合。

二、酶免疫组织化学染色步骤1. 组织处理：将组织样本进行固定、脱水、透明化等处理。

2. 抗原修复：采用加热或化学方法使抗原从组织中释放出来，暴露出抗原表位。

3. 阻断：加入内源性过氧化物酶阻断剂，以消除组织中存在的过氧化物酶活性。

4. 孵育：加入酶标抗体，在组织中与抗原特异性结合。

5. 显色：加入底物溶液，在组织中形成有色产物，以可视化抗原-Ab 的结合。

6. 观察：观察并记录染色结果。

三、酶免疫组织化学染色的应用酶免疫组织化学染色技术广泛应用于医学和生物学领域，包括肿瘤诊断、病原微生物检测、细胞凋亡和坏死检测等方面。

通过对组织中特定抗原的检测，可以揭示疾病的发生、发展过程以及药物治疗的效果。

四、酶免疫组织化学染色技术的发展随着生物技术的不断发展，酶免疫组织化学染色技术也在不断改进和完善。

近年来，该技术已逐渐向自动化、定量化和标准化方向发展。

自动化技术可以减少人为操作误差，提高实验的重复性和准确性；定量技术可以实现对组织中抗原的定量检测，揭示抗原表达水平与疾病发生、发展的关系；标准化技术可以保证不同实验室之间的实验结果具有可比性，提高实验结果的可靠性。

五、未来趋势随着生物技术的不断发展，酶免疫组织化学染色技术的未来发展趋势将主要体现在以下几个方面：1. 多指标联合检测：将多种指标联合检测，可以更全面地揭示疾病的发生、发展过程以及药物治疗的效果。

例如，可以将肿瘤标志物、细胞因子等指标联合检测，以更准确地诊断肿瘤并评估治疗效果。

2. 免疫荧光与免疫组织化学联合应用：免疫荧光技术可以实现对组织中抗原的准确定位和定性分析，而免疫组织化学技术则可以对组织中抗原进行定量分析。

免疫组织化学的概念：免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。

免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。

免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。

其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。

石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。

所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。

常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01mol/L的柠檬酸盐缓冲液。

免疫组化常用的染色方法有哪些？根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。

这种方法敏感性更高，有利于微量抗原（抗体）在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素——抗生物素染色法最常用。

抗体的保存：抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。

如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100mg/L）,就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。

绝大多数已稀释的抗体应存在4℃-8℃条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。

病理学中的免疫组织化学技术免疫组织化学技术是病理学中常用的一种技术，它利用特异性抗体来检测并鉴定组织中的特定细胞或分子。

这种技术在肿瘤学、免疫学、神经科学等领域得到广泛应用，并且对于疾病的早期诊断、治疗有着重要的作用。

免疫组织化学技术是在组织学的基础上发展起来的一种技术，它利用特异性抗体识别组织中的不同成分，并将它们染色或标记。

目前常使用的免疫组织化学技术主要有免疫荧光、免疫酶标记、免疫金标记等。

免疫荧光是一种利用荧光染料标记抗体或标记物并将其显色的技术。

它可以快速、准确地鉴定出组织中的不同分子或细胞，并可以通过多重荧光染色技术同时检测出多种分子，从而实现复杂的研究目的。

免疫荧光技术在病理学中的应用十分广泛，包括免疫球蛋白的分布、肿瘤细胞的识别和定位、免疫细胞的分布和功能等。

免疫酶标记是一种将酶标记物（如过氧化物酶、碱性磷酸酶等）标记在抗体或其他分子上，然后通过酶促反应将其染色或显色的技术。

这种技术可以用于特定细胞或分子的定量分析，可以通过数字化显微镜来定量计算染色强度等参数。

在肿瘤学中，免疫酶标记技术常被用来鉴定肿瘤细胞的种类和分化程度，以及进行肿瘤的分子分型。

免疫金标记技术是一种将金标记物标记在抗体或标记物上，然后通过放大或显色等方式来进行检测的分析技术。

这种技术的优点在于其对细胞结构和分子的高分辨率显微镜观察，同时可通过计算机数字化技术实现图像分析和处理。

在神经科学领域中，免疫金标记技术常被用于观察神经元的形态和分布，以及神经递质的定位和释放。

总之，免疫组织化学技术在病理学中得到了广泛应用。

这种技术的出现和发展，为疾病的诊断、治疗和研究提供了有力的工具，同时也为未来疾病防治的研究和治疗提供了新的思路和可能性。