纸片微载体培养BHK-21(C-13)细胞制备兽用狂犬冻干活疫苗

养殖与饲料2020年第05期悬浮培养技术在猪圆环疫苗生产中的应用李少丽*邵攀峰朱国坡尹忠良杭州佑本动物疫苗有限公司，杭州310018摘要猪圆环病毒病是猪的一种非常重要的免疫抑制性疾病，可直接破坏猪的免疫系统，并引起其他疾病的并发或继发感染。

针对该病的疫苗主要为全病毒灭活疫苗和基因工程亚单位疫苗，基因工程亚单位疫苗一般利用生物反应器生产，而国内猪圆环全病毒灭活疫苗的微载体悬浮培养生产的工艺目前还处于研究阶段。

关键词悬浮培养；猪圆环病毒；疫苗收稿日期：2020-03-05*通讯作者李少丽，女，1983年生，博士，高级兽医师。

1猪圆环病毒概况猪圆环病毒（porcine circovirus ，PCV ）是目前发现的脊椎动物中最小的一种动物病毒，该病毒可分为PCV1和PCV2两种血清型。

PCV1对猪无致病性，广泛存在于猪体内和猪源传代细胞系中，PCV2可在猪群内引发多种传染病，如断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS ）、猪皮炎肾病综合征（PDNS ）等。

PCV2不仅可造成仔猪生长缓慢，而且还会侵害猪的免疫系统，导致猪群免疫抑制，影响其他疫苗的免疫效果，并引发其他病原的继发感染。

PCV2基因组大小为1766~1768bp ，共包括ORF1和ORF2在内的11个ORF 。

ORF2编码病毒衣壳蛋白（Cap 蛋白），Cap 蛋白为病毒的主要结构蛋白，是刺激机体产生免疫应答的主要抗原，也是基因工程亚单位疫苗研究的热点。

目前，针对圆环病的商品化疫苗国内已有30多家，主要为全病毒灭活疫苗和亚单位疫苗。

目前，国内疫苗企业上市的全病毒灭活疫苗均为转瓶工艺。

2悬浮培养技术在猪用疫苗生产中的应用随着细胞培养技术的不断发展成熟，许多细胞已从传统的转瓶培养被驯化为悬浮培养。

悬浮培养技术具有病毒产量高、生产周期短、污染小、批间稳定、操作方便、可自动化控制、劳动成本低等优势，其可分为微载体悬浮培养和全悬浮培养2种方式。

微载体培养是以细小的颗粒作为细胞载体，通过搅拌使细胞悬浮在培养液内，细胞在载体表面生长成单层的一种细胞培养方式。

大规模培育技术应用简介通过大规模体外培育技术培育哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。

20 世界 60-70年月，就已创立了可用于大规模培育动物细胞的微载体培育系统和中空纤维细胞培育技术。

近十数年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，以传统的生物化学技术从动物组织猎取生物制品已远远不能满足这一需求。

随着细胞培育的原理与方法日臻完善，动物细胞大规模培育技术趋于成熟。

所谓动物细胞大规模培育技术〔large-scale culture technology〕是指在人工条件下〔设定ph、温度、溶氧等〕，在细胞生物反响器〔bioreactor〕中高密度大量培育动物细胞用于生产生物制品的技术。

目前可大规模培育的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho〔中华仓鼠卵巢〕细胞、BHK-21(仓鼠肾细胞)、Vero 细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依靠的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。

在过去几十年来，该技术经有了很大进展，从使用转瓶(roller bottle) 、CellCube 等贴壁细胞培育，进展为生物反响器〔Bioreactor〕进展大规模细胞培育。

第一代细胞培育技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产：一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产简洁导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进展生产和质量控制。

随着生物技术的进展，迫切需要大规模的细胞培育，特别是培育表达特异性蛋白的哺乳动物细胞，以便获得大量有用的细胞表达产物。

承受玻璃瓶静置或旋转瓶的培育方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。

因而必需为工业化生产开创一种的技术方法。

自 70 年月以来，细胞培育用生物反响器有很大的进展，种类越来越多，规模越来越大，较常见的细胞培育生物反响器有空气提升反响器，中空纤维管反响器，无泡搅拌反响器及篮式生物反响器等。

狂犬疫苗生产工艺狂犬疫苗是一种用于预防狂犬病的疫苗，它是通过制备、培养和灭活狂犬病病毒并进行灭活制剂的制备来实现。

狂犬疫苗的生产工艺如下。

首先，需要准备狂犬病病毒株。

目前常用的狂犬病毒株有血清媒介的毒株和组织培养的毒株。

在生产中，选择某一株病毒，通过传代培养和扩增来获得病毒种子。

接下来，需要将病毒株接种到合适的细胞种子上。

常用的细胞种子包括鸟胚细胞、绵羊肾细胞和Vero细胞等。

将病毒株接种到细胞种子后，保持一定的温度、PH值和营养液条件下进行培养。

当病毒感染细胞后，需要经过一定的时间来扩增病毒的数量。

此时应定期检测细胞内是否存在有效的病毒感染。

当细胞内病毒感染达到一定水平后，需要对细胞进行破碎以释放病毒。

一般的方法有冻融法、超声波法和酶解法等。

破碎后，通过离心和过滤等方法来获得病毒液。

获得病毒液后，需要对病毒进行灭活。

常用的灭活剂有用酸亚硫酸、β-普萘酚和乙醚等。

灭活的时间和灭活剂的浓度等关键因素需要进行严格的控制，以确保病毒完全失活。

完成灭活后，病毒液需要进行精制和纯化。

常用的方法有沉淀法、硝酸盐法、硫酸铵法和超滤法等。

通过这些方法可以去除污染物和无效成分，从而得到纯净的病毒灭活制剂。

最后，将纯化的病毒灭活制剂进行配制和包装。

一般将其加入到适当的稳定剂中来延长疫苗的保质期，并使用适当的容器进行包装和密封。

以上就是狂犬疫苗的生产工艺概述。

狂犬疫苗生产工艺需要在严格的细胞培养和病毒操作条件下进行，以确保病毒的纯净性和有效性。

在生产过程中，需要严格控制各个环节的参数和操作，以确保疫苗的质量和安全性。

BHK21细胞在新型微载体培养系统生长条件优化摘要：目的：使用BelloCell-500AP生物反应器和BioNOC-II 微载体，对BHK21细胞在此新型高密度培养生物反应器中的生长特性进行研究。

方法：首先将1.5×108个BHK21细胞悬液加入含有微载体的生物反应器内，按生物反应器厂家推荐参数进行培养，每天取载体计数观察BHK21的生长特性。

然后调整细胞浓度和微载体培养系统运行参数。

结果：BHK21细胞经过6 d培养载体中细胞总数达到峰值，细胞密度是起始接入数量的31倍为4.41×109个；经过培养过程参数优化，确定适于BHK21细胞高密度培养参数。

试验成功实现了BHK21细胞的高密度培养，为以BHK21细胞为生产基质的病毒疫苗生产提供了一条简便快捷的途径。

关键词：生物反应器微载体BHK21细胞目前我国兽医生物制品生产过程中，细胞培养设备相对比较落后，大多是在转瓶内旋转贴壁培养，不仅劳动强度大、操作复杂、容易造成污染，还经常出现细胞贴壁不均造成不同批次细胞的差异。

为了提高产量，只有通过增加培养转瓶数，而这往往受到生产场地的限制，而生物反应器就弥补了这些不足。

BelloCell-500AP是美国Cesco 公司研发的一种能有效地使细胞内外营养和气体交换的新型固定床式生物反应器。

在国内外该生物反应器已经广泛应用于HEK 293、Vero、CHO、SF-9、ST等多种哺乳动物细胞和昆虫细胞的培养[1-8]。

BHK21细胞广泛用于口蹄疫、狂犬病毒、乙脑病毒等病毒疫苗的生产基质，BHK21细胞在纯悬浮培养系统和搅拌式微载体培养系统的报道比较多。

本研究使用新型潮汐式固定床微载体培养系统BelloCell-500AP和BioNOC -II 片状微载体对BHK21在微载体生长特性进行研究，探索细胞增殖规律，为口蹄疫、狂犬病毒、乙脑病毒在这一新型反应器培养工艺研究作铺垫。

1材料与方法1.1试验材料BHK21细胞（中国兽医药品监察所），DMEM培养基（Gibco），胎牛血清（PAA），葡萄糖（Sigma），BelloCell-500AP高密度细胞培养系统（CESCO）1.2试验方法1.2.1微载体培养BHK21细胞方法（1）细胞的接种后贴壁阶段将长满单层BHK21细胞转瓶消化后计数，取1.5×108颗细胞于30mL 培养基内备用，将470mL含5% FBS的DMEM倒入BelloCell-500AP 中，然后将准备好的BHK21细胞均匀地加入载体上，然后置于BelloStage机器，启动吸附程序。

生物反应器生产狂犬病疫苗的工艺应用作者：张瑜来源：《兽医导刊》 2016年第3期狂犬病是一种致死率非常高的人畜共患病，我国列为甲类传染病，是重要防控疫病。

由于尚无非常有效的治疗方法，因此暴露于该病原后，接种疫苗是最重要预防措施之一。

2015 年OIE 的狂犬病控制计划指出，95% 的人狂犬病是由病犬咬伤所致，如果实现70% 以上的犬免疫，可将人的狂犬病发病率极大降低。

与人预防该病相比，所消耗的费用成本节约近10 倍。

此外加强狗和野生动物狼等易感动物免疫是逐渐净化本病的根本方法。

自从1885 年，Louis Pasteur首次用兔脑和脊髓制备了狂犬病弱毒疫苗，成功保护了第一位狂犬病野毒暴露者。

此后，在疫苗安全性和免疫效果方面不断改进和提高。

狂犬病疫苗经历了神经组织疫苗，禽胚疫苗，细胞培养疫苗的发展历程。

一、狂犬病疫苗毒株及培养基质1. 狂犬病疫苗的发展。

最早的狂犬病疫苗是用感染疫苗毒株的动物脑和脊髓神经组织制备而成。

由于其效价低，免疫产生抗体水平较差，且含有大量神经髓磷脂，存在引发变态反应等缺点。

此后，开发出禽胚组织培养狂犬病疫苗。

1955年，Peck 制备了鸭胚疫苗（DEV）。

虽然鸭胚疫苗在生产工艺又有进一步改善，引起变态反应的危险性降低，但仍然表现出免疫后抗体效价低的特点。

第三代疫苗走上历史舞台，将狂犬病病毒适应于细胞培养，生产细胞培养狂犬病疫苗，主要包括原代细胞疫苗、二倍体细胞疫苗和传代细胞疫苗。

随着生产工艺改进，第三代疫苗免疫效果好，副反应少，能够实现大批量生产，肩负起了目前免疫防控狂犬病的重任。

虽然，狂犬病基因工程疫苗也进行很多研究，包括重组活载体疫苗、亚单位疫苗和基因疫苗等。

2. 狂犬病疫苗毒株。

由于狂犬病分布广泛，各个国家和地区依据本国疫情流行情况，培养筛选出不同的狂犬疫苗毒株。

应用最为广泛的毒株来源于3 个疫苗株：1882 年从狂犬病病犬脊髓分离并通过兔体传代的固定毒巴斯德株(Paris-Pasteur株) ；1939 年从美国一个患病女孩脊髓悬液经鼠脑传代分离，以鸡胚传代的固定毒Flury 株；1935 年美国一个患病犬体内分离的SAD 株，经鼠脑传代固定毒SAD 株。

中国动物保健2024.03科研动态摘要：动物疫苗规模化生产中受到多种因素影响，通过调控细胞培养技术、病毒扩增和发酵工艺等优化动物疫苗工业化生产工艺。

本文章拟综述分析动物疫苗生产工艺研究现状。

关键词：动物；疫苗；生产工艺；现状动物疫苗生产工艺研究的现状分析邵三敏，吕宁宁，马冬，王宗升*，牛营，许荣强，贾鑫玉（青岛易邦生物工程有限公司山东青岛266113）收稿日期：2023-03-02作者简介：邵三敏（1987.08—），女，山东青岛人，本科，中级兽医师，主要从事兽用生物制品生产相关工作。

*通信作者：王宗升（1984.06—），山东潍坊人，硕士，中级兽医师，主要从事猪用疫苗研究与猪重大疫病综合防控。

doi:10.3969/j.issn.1008-4754.2024.03.052近年来，随着动物疫苗生产工艺的发展，主要通过细胞培养技术和生物发酵工程技术获得动物疫苗产品。

在细胞培养技术中，细胞密度和病毒扩增效率是动物细胞大规模培养生产工艺中决定动物疫苗产量的两个重要因素，而细胞密度又受到细胞培养方式、培养基成分、血清含量、培养环境等的影响，病毒扩增效率主要是由稳定高效表达目的产物的细胞系、病毒感染复数、感染时间、收获时间等决定的，因此可通过调控动物细胞培养环境的营养供给和生物反应器操作参数，建立满足大规模工业化生产动物疫苗的高效生产工艺[1-3]。

而生物发酵工程技术中以酵母菌表达系统和大肠杆菌表达系统作为主要的表达产物系统，通过调控菌体生长条件以便收获高水平的蛋白产物，用于制备动物疫苗[4-6]。

现从以下几方面阐述影响动物疫苗生产工艺的决定性因素。

1细胞培养技术1.1细胞培养方式动物疫苗规模化生产的发展初期，主要以转瓶培养的生产工艺收获病毒，该工艺因存在不同批次产品病毒产量差异大、效率低和成本高、培养工艺难以逐级放大等问题，在2012年农业部发布的第1708号公告中显示转瓶培养生产方式的兽用细胞苗生产线自公告起停止受理生产线项目兽药GMP 验收申请[7]。

无血清培养基培养 Vero细胞制备狂犬病病毒工艺的建立摘要：文章主要是分析了Vero 细胞无血清培养基的组成，在此基础上讲解了Vero细胞无血清细胞培养基的发展，望可以为有关人员提供到一定的参考和帮助。

关键字：Vero细胞；无血清培养基；研究进展1、前言当前现代细胞工程的不断发展，无血清培养基培养Vero细胞作为其中的基质生产疫苗已被广泛的应用，市场上的商品化Vero细胞无血清培养基主要是使用到无血清培养基以及无血清无动物源成分的培养基，其可以有效维持到细胞在体外的生长以及增值，但其中还是存在了一定的污染可能，这会在一定程度上使得疫苗存在一定风险。

2、组成2.1、基础培养基葡萄糖是血液生长、增殖和产物表达过程中的重要能量来源。

通过对血清培养Vero细胞中枢代谢的研究，发现葡萄糖主要参与葡萄糖代谢，而谷氨酰胺是三羧酸循环中最重要的碳源。

用天门冬酰胺和丙酮酸钠代替谷氨酰胺作为碳源，才可以有效的减少到了次级代谢的产物（如乳酸和氨）对细胞的伤害，且谷氨酰胺易被降解，在新形成的培养基中加入等量的谷氨酰胺。

2.2、主要添加因子在Vero无细胞培养的早期研究中，主要是加入到了一些牛（人）血清白蛋白和转铁蛋白，然后有效的促进到了细胞的生长。

然而，血清白蛋白不仅能调节渗透压，能够有效的保护到了细胞免受受到机械的损伤，而且能与维生素、脂类激素、金属离子和生长因子结合，使这些物质在血清培养中的活性转移到血清培养中，具有结合毒素和还原蛋白酶的作用。

通过新的研究发现Vero细胞无血清培养物现在用于用植物蛋白质水解酸盐可以替换成了血清白蛋白。

该蛋白质是复杂的，其中主要是包括了氨基酸，寡肽，橄榄果多酚和纤维。

目前，最常用的植物水解产物是大豆植物水解产物，小麦植物水解产物和水稻水解产物。

这些植物蛋白质使疫苗更加安全。

转铁素是无细胞培养物中最重要的额外组分，这可能导致细胞生长抑制。

在没有动物来源成分的Vero细胞培养基研究中，认为铁柠檬酸铁和维生素C的混合物可以取代转铁蛋白。

狂犬病病毒培养技术的研究进展狂犬病作为一种几乎100%致死的人兽共患传染病，对人类的危害已经存在了4000多年，至今仍无有效的治疗药物，可行的控制策略只有暴露前免疫和暴露后预防。

其中暴露前免疫主要是针对动物而言，因为人的狂犬病来源于动物，只要动物的狂犬病免疫预防有效，可完全控制人狂犬病的发生；而暴露后预防主要用于人，因为人一旦被带毒动物咬伤，必须及时进行全程的暴露后预防才能防止感染狂犬病病毒。

不论是暴露前免疫，还是暴露后预防，都离不开安全、有效、廉价的疫苗。

人和兽用狂犬病疫苗的发展，都依赖于病毒培养技术的不断进步，尤其是微载体、发酵技术和无血清培养基的广泛应用，把狂犬病病毒的增殖滴度提高到了一个新的水平，同时降低了生产成本，从而使高质量的细胞纯化疫苗逐渐占领市场。

无论是传统的体内培养技术，还是现在的细胞培养技术，以及新型的细胞发酵和生物反应器，目前都广泛应用于狂犬病病毒的实验室研究或疫苗生产。

本文主要就狂犬病病毒培养技术的发展和新技术的应用现状综述如下。

1 体内培养技术体内培养技术利用了狂犬病病毒的嗜神经特性，具有敏感性好的优点，可以提高病毒检测的阳性率，而且易于操作，适用于不具备组织培养条件的实验室。

其中，小鼠脑内接种是实验室最常用的狂犬病诊断和病毒培养技术之一，其他动物如大鼠、羊、兔等，过去主要用于狂犬病神经组织疫苗的生产。

禽胚胎培养技术主要是利用鸭胚和鸡胚进行狂犬病病毒培养，如鸡胚传代致弱的Flury-HEP、Flury-LEP和Kelev毒株。

1.1 脑内培养技术小鼠脑内接种是最常用的狂犬病病毒脑内培养技术，最早用于狂犬病野毒株的分离培养是在1925年[5]。

1955年，该技术开始用于疫苗生产，Fuenjalida和Palacios用新生鼠脑制备出人用组织疫苗（SMBV），该疫苗曾在南美洲使用了40多年，最终因使用后会引起严重的神经综合症而被迫停产[1]，但是小鼠脑内接种技术却一直延用至今。

用微载体培养Vero细胞制备狂犬疫苗李平忠;沈伟;余芬;温嘉纳;黄成;孙明波【期刊名称】《第三军医大学学报》【年(卷),期】2006(28)23【摘要】目的研究微载体培养Vero细胞生产狂犬疫苗。

方法搅拌式生物反应器培养Vero细胞,待细胞在微载体上长成单层后,用狂犬病毒aG株感染细胞。

培养5d后,开始灌流收获病毒液,每天取样测定病毒滴度。

经灭活后制备成试验疫苗,进行效力试验。

结果3次培养,细胞密度均达到1×106/ml以上,病毒滴度都在106LD50以上,3批试验疫苗的效价分别达到5.88、6.49和5.98IU/ml。

结论在生物反应罐中用微载体培养Vero细胞制备狂犬疫苗工艺合理,所获免疫原性良好,适用于工业化生产,有较好的应用前景。

【总页数】3页(P2374-2376)【关键词】生物反应器;细胞培养;病毒培养;狂犬疫苗【作者】李平忠;沈伟;余芬;温嘉纳;黄成;孙明波【作者单位】中国医学科学院中国协和医科大学医学生物学研究所生物制品四室【正文语种】中文【中图分类】R512.990.3【相关文献】1.无血清微载体培养Vero细胞增殖传染性法氏囊病毒 [J], 吴培培;冯磊;唐应华;褚轩;王伟峰;侯继波2.GF明胶微载体培养Vero细胞试验条件的优化 [J], 马素娟;王鸣刚;张伟杰;马桂兰;崔梦楠;李倬3.人二倍体细胞狂犬疫苗与Vero细胞纯化狂犬疫苗的安全性对比分析 [J], 范斌; 乔发涛; 张小华; 雷向凯; 王娜; 唐梅松; 苗亚莉; 郭金花4.学龄前儿童接种人二倍体细胞狂犬疫苗与Vero细胞纯化狂犬疫苗的安全性对比分析 [J], 曾文宇;庄炯宇;张映坤;李海忠5.应用地高辛标记探针检测以Vero传代细胞制备人用狂犬疫苗中残余细胞DNA 含量 [J], 窦志勇;鲁宏;钱浩因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

第25章病毒及其疫苗的生产制备技术第一节病毒的生产制备病毒需在活的敏感细胞中才能增殖，在细胞培养技术不成熟之前，人们为研究病毒，往往采用鸡胚接种或动物接种的方法来分离、鉴定病毒或制备一定量的病毒液，但这种方法因个体和种属差异，不仅许多病毒难以找到合适的敏感动物，而且即使在敏感动物中繁殖，往往个体差异大而影响结果的判定，随着细胞培养技术的发展，首先在病毒学研究方面获得了广泛的应用，为病毒的繁殖、鉴定提供了来自不同动物（包括人）、不同组织的细胞来源，通过敏感性筛选，目前绝大多数病毒均可有相应的敏感细胞，为病毒的分离、鉴定和增殖创造了条件。

同时也为病毒的大量生产提供了细胞来源，随着细胞大量生产技术的发展，因此对病毒来说只要有敏感的细胞，就可以进行大规模生产。

一、病毒生产的目的和用途1、为了制备大量的病毒抗原，以制备病毒的亚单位疫苗或表面抗原疫苗，或用病毒抗原制备免疫血清（抗体）。

2、为了制备病毒的减毒活疫苗或灭活的死疫苗，以用于预防接种。

3、为了生产基因改造后或重组有其它多肽因子的病毒，以用于基因治疗或杀肿瘤治疗及基因疫苗的预防接种。

4、为了制备干扰素的病毒诱生剂（NDV、仙台病毒等），用于干扰素的生产。

5、生物战用的病毒生物战剂。

常选用毒力强、抵抗力强、对不同国家人群最敏感的病毒，又能通过气溶胶或昆虫和污染的水土进行传播的病毒。

这是战争狂们正在开展的研究，应警惕。

二、病毒生产制备的方法1、动物接种，如狂犬病毒、脑炎虫媒病毒采用鼠、兔脑内接种后收取脑组织制成悬液。

2、鸡胚、鸭胚接种：如流感病毒、副流感病毒（NDV-F）、仙台病毒等，目前尚无敏感细胞，常采用9～10日胚龄的尿囊腔接种，37℃孵育72小时收获尿液，用鸡红血球测定血凝效价。

Q热用7日龄鸭胚进行卵黄囊接种收获卵黄囊，马脑炎病毒常采用10日龄鸡胚体接种，收获全胚体液等。

3、细胞培养法（详见第二篇第18章）不同的病毒选用相应的敏感细胞，采用转瓶培养、多层培养、微载体培养或悬浮搅拌培养等方法,先大量增殖细胞，然后接种一定量的病毒,继续培养适当时间时，冻融细胞后，离心收获上清。