胰蛋白酶的配制、过滤除菌与分装

查看文章细胞消化胰酶的配制2008-12-10 12:46适用于，无师兄、师姐、非细心、单独开展细胞培养的实验者对一般细胞0.25% 胰酶(胰蛋白酶，Trypsin)配方：100ml PBS,0.25g胰酶步骤：1先配100mlPBS(1000mlPBS:8.0gNaCl,3.4785gPO4HNa2·12H2O/2.9gPO4HNa2 ,0.2gKCl,0.2gPO4H2K溶于1000ml蒸馏水)2 称胰酶0.25g3 加入PBS中，低速搅拌〈4h冰浴中,或者4℃过夜低速搅拌0.5h冰浴中4 调PH7.45 仍在冰浴中6 过滤，分装，-20℃保存，4℃短期内用完tip:低速很重要，机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫，酶就变性了。

低温，防止酶失活对难消化的细胞：在上述配方中，加入0.02g的EDTA(0.02%)tip:因为EDTA可以络合Ca2 ，增加消化效力问：请问哪位仁兄能告知一下EDTA-胰蛋白酶的配制。

急用！多谢！答：1、胰酶是0.25%,这是质量体积比，就是说0.25g胰酶溶于100ml PBS,注意，尽量不要用水来溶，因为要保持渗透压。

2、EDTA的工作液溶度是0.02%－0.1%，根据细胞消化的难易程度自己调整。

EDTA并不是必须的，容易消化的细胞可不加。

EDTA对细胞贴壁性有影响，因此使用时要甚重。

如果影响贴壁，但消化时必须要用，那么在用完全培养基终止消化后，可离心弃上清，再加完全培养基培养，可去除EDTA。

如果对贴壁没影响，那么可不离心。

3、EDTA的浓度也是质量体积比。

和胰酶一起溶于PBS。

4、注意，血清可终止胰酶的作用，但不能终止EDTA的作用，对有些细胞来说，终止消化后的离心是必要的。

5、胰酶和EDTA在pH 为8左右的时候最易溶解，在配制时可先滴几滴NaOH将pH调至8，注意，胰酶可使溶液变酸，所以要边溶边测pH，随时调整。

注意，不可加过量NaOH，否则过碱，细胞会受不了。

20ml0.25%胰蛋白酶的配制、过滤除菌与分装（1ml）
准备样品：Try干粉，PBS缓冲液，离心管两个、冻存管20个、盒子一个、枪头1盒、灭菌器、注射器。

准备工作：将离心管、冻存管装载盒子中高温高压灭菌。

配制：
1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂50mg溶入离心管PBS（PH到7.2左右）液中。

搅拌混匀，置于4℃内过夜。

2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。

3.分装：将除菌之后的胰蛋白酶用移液枪分装到冻存管中，每个冻存管1ml，于-20℃保存以备使用。

细胞培养用试剂的配制1、胰蛋白酶（trypsin）：0.02 g EDTA-2Na、0.25 g胰蛋白酶，用PBS定容于100 mL容量瓶中。

2、PBS：NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4 2.9 g、KH2PO4 0.2 g，用超纯水定容于1000 mL容量瓶中。

3、MTT（5 mg/mL）：噻唑蓝，一般现配现用，过滤后4℃避光保存，MTT变为灰绿色时不可以再用。

MTT不好溶解时，可以多吹打几次，或者磁力搅拌器30min，外包锡箔纸。

MTT 500 mg，用PBS定容于100 mL容量瓶中。

4、双抗：氨苄西林（U）0.5 g、硫酸链霉素（80万单位）1.25 g，用超纯水定容于100 mL容量瓶中。

注：* 有时不需要准确定容；** 细胞用试剂需用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌；*** 链霉素终浓度为100 μg/mL，氨苄西林终浓度为50 μg/mL。

（0.5÷100＝0.005 g/mL，溶于100 mL培养基，0.005 g÷100 mL＝0.05 mg/mL，即50 μg/mL）**** 为了充分溶解，4℃过夜，然后再分装于1.5 mL EP管中，-20℃保存。

细胞初代培养1、准备：培养用品消毒放入经紫外照射30min的净化台内。

组织块，培养液易受紫外损伤的物品在培养时再放入操作野中。

2、漂洗、剪切、消化组织：PBS洗组织块3次，组织块剪成3-5mm2块状，剪碎的组织放入三角烧瓶中，加入比组织量多30-50倍的0.25%的胰蛋白酶消化液，置于磁力搅拌器上（常用消化温度37℃，pH7.6-8.0），组织蓬松呈絮状可终止。

也可以采用冷消化法，即加入胰酶4℃过夜或更长。

消化时间依据组织块大小和硬度而定。

3、分离：消化过程中消化液变浑浊，可吸取少量在镜下观察，若组织分散成细胞团或者单个细胞，立即终止，低速离心（500-1000 rpm/ min）5min,去上清，Hanks液漂洗3次，离心去上清，共两次，用筛网滤去为充分消化的组织块，低速离心（500-1000 rpm/ min）5min,去上清，加入一定量的培养液。

胰酶的配制过程姓名：李达专业：预防兽医学号：2013022060 导师：汤德元一．胰酶-EDTA的配制1、专用PBS缓冲液配方：1000mlPBS: 7.000g NaCl1.100g Glucose·H2O 或 1.000g Glucose0.3700g KCl0.2g Na2PO4H3.000g Tris0.2400g KH2PO40.4000g EDTA超纯水1000ml所有试剂全部为细胞培养专用sigma试剂。

0.0010g 酚红5ml PS2.5g 胰酶（HyClone 胰蛋白酶1:250 SH30848.018）2、配制步骤：1）所用容器先泡酸12小时，后用自来水洗至无色后用蒸馏水洗净，再用超纯水洗三遍，最后高压灭菌，烘干。

2）将缓冲液配好后高压灭菌，同时洗好的广口瓶灭一瓶超纯水备用。

3）加入5ml双抗（PS）。

4）以灭菌的超纯水补足高压过程中损失的水分定容至1000ml。

5）转移到1L的试剂瓶中，加入酚红（0.0010g）。

6）调PH至7.2-7.4。

7）低温冰浴中溶解Tryspin2.5g.混匀。

此过程避免产生气泡，否则将损失酶活性。

8）在细胞间里用0.22um的滤膜过滤，分装入灭菌的50ml或1.5ml离心管中。

此过程避免产生气泡，否则将损失酶活性。

-20℃保存。

9）不可反复冻存。

每次解冻后4℃保存，并在短期内用完。

3、注意事项：1）整个分装过程在无菌条件下进行。

2）机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫酶就变性了。

低温可防止酶失活。

3）加入的EDTA可以络合细胞外基质中的Ca2+ ，增加消化效力。

4）在调节PH时一定要注意保护探头，防止损伤电极。

5）分装时不要太满，防止冻存后体积增大而溢出。

50ml离心管装45ml左右，1.5ml离心管装1.4ml左右。

6）分装后的胰酶尽快转移到-20℃冰箱中冻存。

二．0.25%胰酶（无EDTA）的配制1、250ml胰酶配制方法Tryspin 0.625gPS 2.5ml苯酚红0.1g所有试剂全部为细胞培养专用sigma试剂。

胰蛋白酶-EDTA溶液(0.25%:0.02%)产品简介：胰蛋白酶（Trypsin）是由胰脏产生没有活性的胰蛋白酶原分泌到小肠后，小肠内的肠肽酶会活化该酶原，形成胰蛋白酶。

胰蛋白酶的特点还在于已经活化的胰蛋白酶，能够继续活化更多胰蛋白酶原，这种过程即自动催化。

胰蛋白酶在小肠工作，它会将蛋白质水解为肽，进而分解为氨基酸，其最适温度约为37℃。

Leagene的 Trypsin-EDTA solution，含0.25%胰酶、0.02%EDTA。

该溶液经过过滤除菌，可以直接用于培养细胞的消化，或者一些组织的消化。

该产品通常室温消化1min 左右就可以消化下大多数贴壁细胞。

主要成分：主要由0.25%胰酶、0.02%EDTA等组成，不含酚红，过滤除菌。

自备材料：1、微量移液器2、PBS、Hanks液或无血清培养液3、显微镜4、离心机操作步骤(仅供参考)：1、贴壁细胞的消化①吸除培养液，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清。

②加入少量Trypsin-EDTA solution，略盖过细胞即可，室温放置0.5～2min，不同的细胞消化时间有所不同。

③显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来。

此时吸除胰酶细胞消化液。

加入含血清的完全细胞培养液，吹打下细胞，即可直接用于后续实验。

④如果发现消化不足，则加入Trypsin-EDTA solution重新消化。

⑤如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来。

1000～2000g离心1min，沉淀细胞，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。

2、组织的消化不同的组织需要消化的时间相差很大，通常以消化后可以充分打散组织为宜。

注意事项：1、尽量减少反复冻融的次数，以免失效。

实验一培养用液的配制、除菌与分装【实验目的】1. 掌握常见培养用液的配制方法。

2. 掌握常用的灭菌方法。

3. 了解每种培养用液的作用。

【实验原理】常用细胞培养用液包括磷酸盐平衡盐溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）、液体培养基、胰蛋白酶（Trypsin）和EDTA溶液。

PBS用于清洗细胞、配制胰蛋白酶和EDTA。

培养基含有细胞生长需要的各种营养元素，使用时通常还需填加血清和抗生素。

鱼类细胞培养的培养基常用种类是MEM 和L-15；用于动物的一般是DMEM和RPMI-1640。

胰蛋白酶可将贴壁的细胞从培养瓶壁上消化下来，通常使用浓度为0.25%或0.125%。

EDTA 用于清洗细胞表面，螯合Ca2+等二价离子，使细胞易于为胰蛋白酶消化。

细胞培养用的试剂必需是无菌的，PBS 和EDTA 可以采用高压灭菌，而培养基和胰蛋白酶溶液含生物活性物质，配制好后通过过滤除菌。

【试剂、材料与仪器】试剂：NaCl ；KCl；Na2HPO4；KH2PO4；EDTA；胰蛋白酶；HEPES；碳酸氢钠；MEM或PRMI-1640 培养基干粉；GPS材料：三蒸水，蒸馏水瓶，精密天平，药匙，称量纸，烧杯（250 mL、1000 mL），玻棒，精密pH 试纸（6.8-8.0），容量瓶（250 mL、1000 mL），一次性注射器，一次性过滤器，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，消毒纱布，酒精喷壶，已高压灭菌试剂瓶（500 mL、250 mL、100 mL），记号笔，标签纸，橡胶手套，移液管（5 mL、10 mL），封口膜仪器：超净工作台，加液枪，4℃冰箱【实验分组】实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。

第1组配制PBS并高压灭菌，第2组配制胰蛋白酶溶液并过滤除菌和分装，第3组配制EDTA溶液并分装高压灭菌，第4组配制培养基，第5组过滤除菌培养基并分装。

每个实验小组需准备试剂有：胰酶50 mL；EDTA 50 mL；培养基90 mL（使用前加入10 mL血清）。

胰酶的配制过程姓名：李达 专业：预防兽医学号： 2013022060 导师：汤德元NaCl Glucose H 2O 或 I.OOOg Glucose KCl Na 2PO 4HTrisKH 2PO 4 EDTA1OOOml所有试剂全部为细胞培养专用sigma 试剂 O.OO1Og酚红 5ml PS2.5g 胰酶（ HyClone 胰蛋白酶 1:25O SH3O848.O18） 2、配制步骤：1 ）所用容器先泡酸 12 小时，后用自来水洗至无色后用蒸馏水洗净， 再用超纯水洗三遍，最后高压灭菌，烘干。

2）将缓冲液配好后高压灭菌，同时洗好的广口瓶灭一瓶超纯水备用。

3） 加入 5ml 双抗（ PS ）。

4） 以灭菌的超纯水补足高压过程中损失的水分定容至 1OOOml 。

5） 转移到1L 的试剂瓶中，加入酚红（O.OOIOg ）。

6） 调 PH 至 7.2-7.4。

7） 低温冰浴中溶解Tryspin2.5g.混匀。

此过程避免产生气泡，否则将损失酶活性。

8） 在细胞间里用0.22um 的滤膜过滤，分装入灭菌的 50ml 或1.5ml 离心管中。

此过程避免产生气泡，否则将损失酶活性。

-2O C 保存。

9） 不可反复冻存。

每次解冻后4 C 保存，并在短期内用完。

一．胰酶 -EDTA 的配制1、专用 PBS 缓冲液配方：1000mlPBS: 7.000g1.100g 0.3700g 0.2g3.000g 0.2400g 0.4000g 超纯水3、注意事项：1）整个分装过程在无菌条件下进行。

2）机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫酶就变性了。

低温可防止酶失活。

3）加入的 EDTA 可以络合细胞外基质中的 Ca 2+，增加消化效力。

4）在调节 PH 时一定要注意保护探头，防止损伤电极。

5）分装时不要太满，防止冻存后体积增大而溢出。

50ml 离心管装 45ml 左右， 1.5ml 离心管装 1.4ml 左右。

6）分装后的胰酶尽快转移到-20C 冰箱中冻存。

细胞培养相关常用液体配制标准SOP操作规程样本（一）胰酶的配制：（浓度为1‰，1L）1、认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。

2、称取牛胰蛋白酶1.0g；EDTA 2 g；3、用超纯水溶解；4、磁力搅拌器搅拌至胰酶完全溶解，溶液变得澄清；5、超纯水定容至1L；6、不锈钢滤器加0.22um滤纸两张高温灭菌后，在超净工作台过滤；7、在血清瓶中加入少量滤好的胰酶，置于细胞培养箱中检测是否染菌，其余置于4℃待用；8、过滤后洗净滤器再次灭菌，避免残留的胰酶降解蛋白。

（二）DMEM配制：1、所需试剂及材料：试剂：DMEM干粉（GIBCO 10L）、超纯水（Milli-Q）、Na2CO3 （Sigma）材料：10L玻璃瓶、500ml盐水瓶（灭菌）、0.22um滤膜、滤器（事先放好两层滤膜并高压灭菌）、磁力搅拌器大号搅拌子蠕动泵胶塞2、操作步骤：(1)10L玻璃瓶洗涤，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。

(2)在10L玻璃瓶中加入超纯水9.5L，将DMEM干粉倒入，在磁力搅拌器上搅拌溶解。

(3)按照3.7g/L 加入Na2CO3 。

(4)调节pH值至7.2~7.4。

(5)过滤分装，并注明名称及配制日期。

此过程注意无菌操作！(6)最后用血清瓶取10ml左右置于细胞培养箱中检测是否染菌。

(7)清洗滤器，10L玻璃瓶，软管，将所有实验器具归位。

（三）1640、MEM培养基的配制同上，Na2CO3的用量见包装说明（四）细胞间100×双抗（青霉素、链霉素）的配制青霉素及链霉素配制的终浓度为1万单位/毫升。

配制的步骤以400ml为例：1.认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。

2.准备5瓶青霉素（80万单位/瓶）、4瓶链霉素（100万单位/瓶）。

3.加入1-2ml细胞间专用PBS进入青霉素、链霉素的瓶子内，浸泡后吹吸数次至全部溶解，溶解后的液体吸入配制容器内。

胰酶配制一、器材与试剂：干粉型培养基、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。

具体步骤：(1)水的制备：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。

需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水。

(2)PBS的制备与消毒（也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制）：1、溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2 HPO4 ?H2 O 1.56g，KH2 PO4 0.2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS 溶液。

2、移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。

注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。

(3) 胰蛋白酶溶液的配制与消毒：胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。

不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。

胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。

使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。

因Ca2+ 、Mg2+ 和血清、蛋白质可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+ 、Mg2+ 的BSS，如：D-Hanks液。

终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。

1、称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。

搅拌混匀，置于4℃内过夜。

2、用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。

然后分装成小瓶于20℃保存以备使用。

(4)青、链霉素溶液的配制与消毒1、所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。

2、具体操作均在超净台内完成。

•页•博客•相册•个人档案•好友细胞消化胰酶的配制对一般细胞 0.25% 胰酶(胰蛋白酶，Trypsin)配方：100ml PBS,0.25g胰酶步骤：1先配100mlPBS(1000mlPBS:8.0gNaCl,3.4785gPO4HNa2·12H2O/2.9gPO4HNa2 ,0.2gKCl,0.2gPO4H2K溶于1000ml蒸馏水)2 称胰酶0.25g3 加入PBS中，低速搅拌〈4h冰浴中,或者4℃过夜低速搅拌0.5h冰浴中4 调PH7.45 仍在冰浴中6 过滤，分装，-20℃保存，4℃短期内用完tip:低速很重要，机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫，酶就变性了。

低温，防止酶失活对难消化的细胞：在上述配方中，加入0.02g的EDTA(0.02%)tip:因为EDTA可以络合Ca2 ，增加消化效力问：请问哪位仁兄能告知一下EDTA-胰蛋白酶的配制。

急用！多谢！答：1、胰酶是0.25%,这是质量体积比，就是说0.25g胰酶溶于100ml PBS,注意，尽量不要用水来溶，因为要保持渗透压。

2、EDTA的工作液溶度是0.02%－0.1%，根据细胞消化的难易程度自己调整。

EDTA并不是必须的，容易消化的细胞可不加。

EDTA对细胞贴壁性有影响，因此使用时要甚重。

如果影响贴壁，但消化时必须要用，那么在用完全培养基终止消化后，可离心弃上清，再加完全培养基培养，可去除EDTA。

如果对贴壁没影响，那么可不离心。

3、EDTA的浓度也是质量体积比。

和胰酶一起溶于PBS。

4、注意，血清可终止胰酶的作用，但不能终止EDTA的作用，对有些细胞来说，终止消化后的离心是必要的。

5、胰酶和EDTA在pH 为8左右的时候最易溶解，在配制时可先滴几滴NaOH将pH调至8，注意，胰酶可使溶液变酸，所以要边溶边测pH，随时调整。

注意，不可加过量NaOH，否则过碱，细胞会受不了。

6、胰酶EDTA相对比较难溶，可用磁力搅拌器，或放入4度冰箱过夜，待溶解后过滤除菌。

适用于，无师兄、师姐、非细心、单独开展细胞培养的实验者对一般细胞0.25% 胰酶(胰蛋白酶，Trypsin)配方：100ml PBS,0.25g胰酶步骤：1先配100mlPBS(1000mlPBS:8.0gNaCl,3.4785gPO4HNa2·12H2O/2.9gPO4HNa2 ,0.2gKCl,0.2gPO4H2K溶于1000ml蒸馏水)2 称胰酶0.25g3 加入PBS中，低速搅拌〈4h冰浴中,或者4℃过夜低速搅拌0.5h冰浴中4 调PH7.45 仍在冰浴中6 过滤，分装，-20℃保存，4℃短期内用完tip:低速很重要，机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫，酶就变性了。

低温，防止酶失活对难消化的细胞：在上述配方中，加入0.02g的EDTA(0.02%)tip:因为EDTA可以络合Ca2+，增加消化效力好帖，顶一个！！！不过我们用hanks配制胰酶好呀，对我帮组好大呵呵,亲人呀呵呵,亲人呀Thank you!谢谢分享！谢谢。

呵呵应该是Ｄ-Ｈａｎｋｓ吧．excellent好是好，不过你的分子式写错了，PO4HNa2应为Na2HPO4，PO4H2K应为KH2PO4。

这种错误好像不该出吧。

我用的是EBss配的.呵呵，经典提醒。

我的一位大学老师，有机化学，我称之为董，呵呵。

前几天，和前辈聊，他说：你学了那么多学科，还接触过很多实验，应该在科研上很有前途。

我说：等我自己积累到一定程度，就能把昨天的东西也发挥上。

董，你的提醒，促使我加强这个意识！！！好！提醒一点，一定要分装成小瓶！2~3次即用完！不然胰酶失活，你会很麻烦！胰酶是不能用hanks的,应用D-hanks,不能有钙镁离子我们都用PBS配置，然后加EDTA。

方法如下：PBS100ml+250mg胰酶+0.02EDTA消化作用很快，加EDTA对细胞毒性较小。

胰蛋白酶溶液的配制方法如下：
将D-Hanks液高压消毒灭菌，用NaHCO3液调节pH至7.2左右。

取胰蛋白酶粉末置烧杯中，先用少许D-Hanks液调成糊状，然后再补足，搅拌混匀，置室温4小时或冰箱内过夜，并不时搅拌振荡。

次日先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，低温冰箱保存备用。

常用的浓度为0.25%或0.125%。

由于胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可调pH至7.2左右。

请注意，配制过程中需要注意安全和卫生，严格按照实验室规范进行操作。

同时，胰蛋白酶是一种强效的酶，需要妥善保存，避免高温和潮湿，以免影响其活性和稳定性。

一、实验目的1. 学习并掌握胰蛋白酶的提取、纯化方法。

2. 了解胰蛋白酶的活性测定方法。

3. 掌握实验室操作技能，提高实验动手能力。

二、实验原理胰蛋白酶是一种广泛存在于哺乳动物胰脏中的蛋白水解酶，具有高效、专一的特点。

本实验通过从胰脏中提取胰蛋白酶，利用其活性对蛋白质进行水解，从而实现对胰蛋白酶的制备。

三、实验材料与仪器1. 材料：新鲜猪胰脏、生理盐水、盐酸、氢氧化钠、硫酸铵、硫酸铜、Folin试剂、酪蛋白、三氯醋酸等。

2. 仪器：研钵、天平、烧杯、试管、移液管、滴定管、恒温水浴锅、紫外可见分光光度计等。

四、实验步骤1. 胰蛋白酶提取（1）将新鲜猪胰脏去脂肪、去筋膜，剪成小块，用生理盐水清洗，去除杂质。

（2）将胰脏放入研钵中，加入适量的生理盐水，研磨成浆状。

（3）将研磨好的胰浆用纱布过滤，收集滤液。

2. 胰蛋白酶纯化（1）将滤液加入适量的盐酸，调节pH值为4.5，静置过夜。

（2）次日，将沉淀物用蒸馏水洗涤，去除杂质。

（3）将洗涤后的沉淀物加入适量的硫酸铵溶液，调节硫酸铵浓度为40%，搅拌，静置2小时。

（4）取沉淀物，用蒸馏水洗涤，去除杂质。

（5）将洗涤后的沉淀物用硫酸铜溶液处理，去除杂质。

3. 胰蛋白酶活性测定（1）取一定量的酶液，加入酪蛋白溶液，在40℃、pH值为7.5的条件下反应30分钟。

（2）加入三氯醋酸终止反应，离心分离。

（3）取上清液，用Folin试剂测定吸光度，计算酶活性。

五、实验结果与分析1. 胰蛋白酶提取通过研磨和过滤，从新鲜猪胰脏中成功提取出胰蛋白酶。

2. 胰蛋白酶纯化通过盐析、洗涤、硫酸铵沉淀和硫酸铜处理，成功纯化出胰蛋白酶。

3. 胰蛋白酶活性测定在最佳条件下，胰蛋白酶对酪蛋白的水解活性较高，说明成功制备出具有活性的胰蛋白酶。

六、实验结论本实验成功从猪胰脏中提取、纯化出具有活性的胰蛋白酶，为后续的实验研究提供了条件。

七、实验注意事项1. 提取过程中，需保持操作环境清洁，避免污染。

胰蛋白酶溶液(0.25%)简介：胰蛋白酶(Trypsin)是由胰脏产生没有活性的胰蛋白酶原分泌到小肠后，小肠内的肠肽酶会活化该酶原，形成胰蛋白酶。

Leagene Trypsin solution(0.25%)主要由0.25%胰酶组成，不含EDTA ，经过滤除菌。

本试剂可以直接用于培养细胞的消化，或者一些组织的消化，通常室温下1min 左右就可以消化下大多数贴壁细胞。

组成：操作步骤(仅供参考)：1、贴壁细胞的消化①吸除培养液，以去除残余的血清。

②加入少量Leagene Trypsin solution ，室温放置0.5～2min 。

③显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来，吸除胰酶细胞消化液。

④如果发现消化不足，则加入Trypsin solution 重新消化。

⑤如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来。

量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。

2、组织的消化不同的组织需要消化的时间相差很大，通常以消化后可以充分打散组织为宜。

注意事项：1、 尽量减少反复冻融的次数，以免失效。

2、 在Trypsin solution 过程中，要特别注意避免消化液被细菌污染。

3、 Trypsin solution 消化细胞时间不宜过长，否则细胞铺板后生长状况会较差。

4、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期： 12个月有效。

编号 名称 CC0133 Storage Trypsin solution(0.25%) 100ml -20℃ 使用说明书 1份相关：编号名称CC0007 磷酸缓冲盐溶液(10×PBS,无钙镁)CA0075 青霉素-链霉素混合溶液(100×双抗)DC0032 Masson三色染色液DH0006 苏木素伊红(HE)染色液NH0043 SSC缓冲液(20×,pH7.0)TC0713 葡萄糖检测试剂盒(GOD-POD比色法)。

00000001、胰酶是0.25%,这是质量体积比，就是说0.25g胰酶溶于100ml PBS,注意，尽量不要用水来溶，因为要保持渗透压。

2、EDTA的工作液溶度是0.02%－0.1%，根据细胞消化的难易程度自己调整。

EDTA 并不是必须的，容易消化的细胞可不加。

EDTA对细胞贴壁性有影响，因此使用时要甚重。

如果影响贴壁，但消化时必须要用，那么在用完全培养基终止消化后，可离心弃上清，再加完全培养基培养，可去除EDTA。

如果对贴壁没影响，那么可不离心。

3、EDTA的浓度也是质量体积比。

和胰酶一起溶于PBS。

4、注意，血清可终止胰酶的作用，但不能终止EDTA的作用，对有些细胞来说，终止消化后的离心是必要的。

5、胰酶和EDTA在pH 为8左右的时候最易溶解，在配制时可先滴几滴NaOH将p H调至8，注意，胰酶可使溶液变酸，所以要边溶边测pH，随时调整。

注意，不可加过量NaOH，否则过碱，细胞会受不了。

6、胰酶EDTA相对比较难溶，可用磁力搅拌器，或放入4度冰箱过夜，待溶解后过滤除菌。

7、可配2－3乘的胰酶，这样比较节约时间和滤器，用的时候对上灭菌PBS即可。

8、储存液放在－20度冰箱冻存，使用液放在4度，用的时候不要放在27度水浴锅温浴，因为这样会让胰酶很快失效，使用前放在室温下一会，因为加的量很少，所以一般不会冻坏细胞。

9、消化时，向培养瓶中加入适量胰酶，个人经验，一般10cm培养皿加入0.5ml足已，加入后，立刻摇晃培养皿，使胰酶铺满，一旦铺满，立刻用负压吸引器吸去多余的胰酶，再放入37度培养箱消化。

10、注意，过量的胰酶对细胞是有害的，而EDTA过多也会影响贴壁，所以没必要把细胞泡在胰酶里面消化。

11、胰酶37消化效果最好，低于37度也有消化能力，有些容易消化的细胞在消化时甚至不需要放入培养箱。

注意，不可消化过久。

细胞培养标准操作程序(SOP）1．目的:为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养操作流程。

2．适用范围：适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。

3．操作规程：3。

1 培养液、PBS、胰蛋白酶的配制3.1.1 1000ml培养液的配制1、准备用品：培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2～3天内的新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶（100ml×10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2～3个过滤器、注射器。

紫外线照台30min.2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）溶解，并冲洗袋内残留粉末.3、充分搅拌，按说明添加成分(如Invitrogen公司的RPMI—1640配制1000ml需加NaHCO3粉2。

0g,Invitrogen 公司的DMEM需加NaHCO3粉3.7g等），再充分搅拌.无需加谷氨酰胺，因该培养基里已含有。

4、用1M(1mol/L）HCl 调PH至7。

0左右（细胞适宜在PH7。

2~7。

4生长，配制好后PH值会升高0。

2～0。

3，故配时调PH至7。

0左右）。

5、用新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）定容到1000ml.6、配青霉素 80万/瓶 + 4ml 蒸馏水溶解配链霉素100万/瓶 + 4ml 蒸馏水溶解取0。

5ml青霉素和0.4ml链霉素加入到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml，充分搅拌混匀。

7、在无菌操作台里用0.22um的除菌滤膜过滤配制好的培养液,并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口,盖上橡皮塞,放—20℃保存备用.注意：(1）配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新鲜三蒸水(或新鲜反渗水）配制。

一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。

（2）准备的100ml×10个玻璃瓶必须事先高压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器均不需高压灭菌,干净即可.3。