基因工程新技术共65页

2019年左右，随着对λ噬菌体重组系统的深入研究，发现该重 组系统可以在E.coli中实现高效同源重组，且同源区长度要求极 低：约40bp。后来，在Rac噬菌体中发现类似的重组系统。随着 该技术的应用，出现了一个新的术语：
Recombineering (recombination-mediated genetic engineering) is a genetic and molecular biology technique based on homologous recombination systems in E. coli and other bacteria mediated by phage proteins, either RecE/T from Rac prophage or Red alpha/beta/gamma from bacteriophage lambda
如果向细胞中导入 ssDNA (DNA oligo),则不需要Exo蛋白就能 够与同源区退火，实际上， Bet单独作用可以 使70-base ssDNA oligo (SSO)与染色体的同源区退火互补而发生重组， 其频率约 2 × 105 / 108 ,比dsDNA 略高。
如果存在 Gam蛋白，则重组效率可提高 (5-fold）.40–60 bp 单链的重组效率下降 5倍。另外，和滞后链重组的效率高于 前导链。
第11章 基因工程新技术
1.λ Red 和 RecET 重组系统及其应用 2. 位点特异性重组系统及其应用 3. 基因打靶 4. 基因抑制技术
1.λ Red 和 RecET 重组系统及其应用
早在1990s, 研究者发现在酿酒酵母等真菌中具有高效的同源 重组系统，仅需要20~40bp长的同源区即可发生重组。可以 方便的利用 PCR产物进行基因打靶或替换。

形成的黏性末端不同
2、限制酶的发现有什么意义？
基因工程创立的标志
2：基因工程的
“
” 指“DNA连接酶”
作用：
连接“梯子”断口的 “扶手”而非“梯子” 中间的“踏板”。
其作用与限制性内切酶 相反，作用点相同
连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末 端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。
目的基
3、基因工程的 因
基因工程及其应用
基因工程：即 基因拼接技术或DNA重组技术。
通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某 种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种
生物的细胞里，定向 地改造生物的 遗传性状。
原 理： 基因重组
操作水平： DNA分子水平
结 果： 定向地改造生物的遗传性状， 获得人类所需要的品种。
❖
1.汉字的亦文亦图性质，导致它的表 意功能 和美学 功能无 法截然 分开。 汉字一 直保持 着对称 平衡的 形态， 与其最 初扮演 的“饰 ”的角 色有相 当关系 。如果 没有在 青铜器 上度过 自己的 童年， 中国的 书法艺 术很可 能跳不 出美术 字的窠 臼，无 从获得 那种自 由奔放 的生命 感和力 量感。
6.2 基因工程及其应用 课件(共18张PPT)
基因工程技术在培育抗旱植物用于发展沙漠农业 和改造沙漠方面显示了良好的前景,荷兰一家公司 将大肠杆菌中的海藻糖合成酶基因导入植物(如甜 菜、马铃薯等)中并获得有效表达，使“工程植物” 增强了耐旱性、耐寒性的基本操作步骤是：
① 海藻糖合成酶基因的获取 ③ 将目的基因导入受体细胞
…CTTAA
A. ①③；②④ C. ①④；②③
ACGTC…
B. ①②；③④ D.以上都不对
G…

4、定向进化的原理
在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA聚合 酶不具有3’->5’校对功能的性质，配合适当条件， 以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变 库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶 (或蛋白质)，从而排除其他突变体。
定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。 定向进化=随机突变+选择。前者是人为引发的，后者
3、酶的定向进化技术
定义： 从一个或多个已经存在的亲本酶（天然或人为 获得）出发，经过基因突变和重组，构建一个 人工突变基因库，通过筛选最终获得预先期望 具有某些特性的进化酶；
所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋 白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和 催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进 化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶 基因，并定向选择出所需性质的突变酶。
虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选 择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个 进化过程完全是在人为控制下进行的
酶定向进化的过程和应用范围
蛋白质
随机突变 随机杂交
•稳定性 •活性 •有机溶液中的活性 •不同的底物的利用 •酸碱度 •蛋白质的表达 •亲和性 •专一性
性能
筛选
目达标到蛋目的白
三、酶定向进化的基本过程
随机突变 不同的定向进化方法构建突变基因 载体的选择，基因重组，组建基因
突变基因的筛选 平板筛选法，荧光筛选法，表面展示法
1、定向进化的方法
无性进化方法：易错PCR法，盒式诱变 有性进化方法
1）DNA改组法（DNA Shuffling) 2）体外随机重组法（RPR) 3）交错延伸法(StEP) 基因家族的同源重组 外显子的改组 杂合进化

《基因工程说课》ppt课 件
CATALOGUE
目 录
• 基因工程简介 • 基因工程的基本技术 • 基因工程实验操作流程 • 基因工程的安全与伦理问题 • 未来展望
01
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基因工程简介
基因工程的定义
基因工程是指通过人工操作将外源基因导入细胞或生物体内，以改变其遗传物质， 从而达到改良生物性状、生产生物制品或治疗遗传性疾病目的的技术。
基因工程是生物工程的一个重要分支，它利用分子生物学和分子遗传学的原理和技 术，对生物体的遗传物质进行操作和改造。
基因工程的基本操作包括基因克隆、基因转移、基因表达和基因沉默等，这些技术 为人类提供了强大的工具来探索和利用生命系统的奥秘。
基因工程的历史与发展
基因工程的起源可以追溯到20世纪70 年代初期，当时科学家们开始探索限制 性内切酶和DNA连接酶等基本工具，
健康风险
基因工程可能对人类健康产生负面 影响，如基因治疗中的副作用。
安全风险
基因工程可能被用于制造生物武器 或生物恐怖主义。
基因工程的伦理问题
人类基因编辑
基因资源与知识产权
基因工程应用于人类胚胎编辑可能引 发一系列伦理问题，如设计婴儿等。
基因资源属于全人类共享的遗产，涉 及知识产权和利益分配问题。
为基因操作奠定了基础。
1973年，美国科学家斯坦利·柯恩和赫 伯特·博耶利用限制性内切酶和DNA连 接酶，成功地将SV40病毒的DNA切割 并重新连接，从而实现了第一个重组
DNA分子。
自此以后，基因工程技术不断发展，逐 渐形成了完整的理论体系和技术体系， 并在医学、农业、工业和基础研究中得
到了广泛应用。
基因歧视
基因信息可能被用于歧视某些人群， 如保险、就业等方面。

复制、扩增和测序的技术。
1. 目的基因的获取
从生物体中提取出含有目的基因 的DNA片段。

2. 载体的构建
将目的基因插入到载体DNA中， 形成重组DNA分子。
3. 转化与筛选
将重组DNA分子导入受体细胞， 通过筛选获得含有目的基因的克
隆。
基因转化技术
基因转化的概念
基因转化是指将外源基因导入到受体 细胞中，使其在受体细胞中稳定遗传 并表达的过程。
基因检测与诊断
遗传病诊断
通过基因检测，确定遗传病的病 因，为患者提供个性化治疗方案。
个性化医疗
根据患者的基因信息，制定个性化 的药物和治疗方案。
生物标记物检测
通过检测生物标记物，预测疾病风 险，预防疾病发生。
04
基因工程的伦理与安全问题
伦理问题
1 2 3
尊重生命原则
基因工程涉及对生命本质的干预，需要尊重生命、 珍惜生命，不得滥用基因技术改变生命的本质和 结构。
生物反应器
转基因动物可以用于生产 疫苗、抗体等生物制品。
疾病模型
转基因动物可以用于研究 人类疾病，帮助科学家更 好地理解疾病的发病机制。
基因治疗
罕见病治疗
针对罕见病，通过基因治 疗纠正缺陷基因，达到治 愈目的。
癌症治疗
通过基因工程技术，增强 免疫细胞的抗癌能力，或 者直接杀死癌细胞。
遗传病治疗
纠正缺陷基因，预防或治 疗遗传性疾病。
基因工程(课件)
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目 录
• 基因工程简介 • 基因工程的基本技术 • 基因工程的应用实例 • 基因工程的伦理与安全问题 • 未来展望
01
基因工程简介
基因工程的定义
01

（2）将目的基因连接到载体上，得杂化载体；（3）将杂化载体 （环状的DNA）引入宿主细胞（受体细胞），使目的基因及载体上 其它基因得以转录和翻译。
例题解析
1、 农业上大量使用化肥存在许多负面影响，“生物固氮”已 成为一项重要研究课题，实验证明，生物固氮是某些微生物（如 根瘤菌、蓝藻等）将空气中的N2固定为NH3的过程。
一个是有些甚至相当多疾病无法治疗 ，这就 是中西 医学结 合的缘 由。然 而，由 于二者 是两套 理论、 两股道 上跑的 车，（ 高血压 心脏病 糖尿病 ）风马 牛不相 及，从 理论上 讲就没 有结合 的可能 ，只是 形式上 的融合 罢了。 故出现 西医对 治疗不 了的疾 病只好 求助中 医，而 中医则 往往采 用西医 诊断中 医治疗 ，以及 中西治 疗法一 块用的 局面。 （肺血液血小板红血球白血球） 至于循证医学、比较医学、后现代医学 、行为 医学等 所谓“ 医学” ，都称 不上一 门独立 的医学 科学， 关于这 一点在 灵魂医 学有关 章节中 将有相 关点评 。（肿 瘤癌症 胃癌肠 癌肺癌 ）
弄不明白，治疗受到制约，在小小SARS、 禽流感 面前竟 束手无 策，在 糖尿病 、癌症 、心脑 血管疾 病、尿 毒症等 相当多 疾病面 前更是 不得不 求助或 借助中 医治疗 。一个 是疗效 不确实 ，一个 是有些 甚至相 当多疾 病无法 治疗， 这就是 中西医 学结合 的缘由 。然而 ，由于 二者是 两套理 论、两 股道上 跑的车 （肺血 液血小 板红血 球白血 球）， 风马牛 不相及 ，从理 论上讲 就没有 结合的 可能， 只是形 式上的 融合罢 了。（ 肺炎青 霉素肝 炎）
西医学是最近三四百年来建立在解剖 学、生 物学及 现代科 学技术 基础上 、（高 血压心 脏病糖 尿病） 发展起 来的一 门以“ 解剖人 、肉体 人”为 概念的 、新兴 的现代 医学科 学理论 体系。 主要采 用科学 实验方 法，（ 传染病 丙肝乙 肝甲肝 ）从宏 观到微 观，直 至目前 的分子 基因层 次水平 ，发展 极为迅 速，超 过其它 任何一 门医学 科学， 成为世 界医学 史上的 主流。 （肿瘤癌症胃癌肠癌肺癌）

是指目的基因在受体细胞内表达，研究功能。
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病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
应用：
• 克隆感兴趣基因进行序列分析，研究其组织结构。 • 转入原核表达载体，进行大规模蛋白质合成,生产多肽
产品。 • 转入真核表达载体，导入细胞，研究其功能，表达调
载体：
• 载体(Vector)是目的基因的运载工具，其作用是将目 的基因带入受体细胞中，并使目的基因扩增和表达。
• 种类： 按来源分： 质粒载体(plasmid vector)、噬菌体载体(phage vector)、 柯氏质粒载体(cosmid vector)、病毒载体(virus vector ). 按作用分： 克隆载体(cloning vector )、表达载体(expression vector)、 穿梭载体(shuttle vector)
四环素选择标记上，4种位于Amp抗性基因上。外源基因的插入将破坏 抗性基因的完整性，导致抗性基因插入失活，这种特性可用于区分重组 和非重组分子。 • 松弛性质粒，在大肠杆菌细胞内有较高的拷贝数，当细菌蛋白质合成停 止时，它仍能继续复制。
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病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
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病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程
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病原体侵入机体，消弱机体防御机能 ，破坏 机体内 环境的 相对稳 定性， 且在一 定部位 生长繁 殖，引 起不同 程度的 病理生 理过程TA 源自隆AA19

1）、引物（寡聚核苷酸）
➢ 一般成对出现，长度为15-30个核苷酸；
➢ 使用浓度： 0.1-0.5uM，高达1uM；
➢ 引物设计原则：
①G+C含量45-55%； ②Tm值高于55； ③引物特异性； ④引物扩增跨度； ⑤是否形成引物二聚体 ⑥引物的3’端严防错配。
2）、模板DNA：
➢ 基因组DNA、质粒DNA、其它DNA片段； ➢ 质量要求：不高
log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log N
Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 ——
基因工程的基本技 术幻灯片
优选第六章基因工程的基本技术
主要内容
一．核酸提取技术 二．凝胶电泳技术 三．PCR技术 四．核酸杂交技术 五．DNA测序技术
第一节、第二节 前章节已介绍
第三节 PCR 技术
第三节 PCR技术
一． PCR 基本原理 二． 基本过程与反应体系 三． PCR引物设计的原则 四． PCR产物质量的影响因素 五． PCR的种类
（4）定量PCR
➢广义概念的定量PCR技术是指 以外参或内参为标准，通过对 PCR终产物的分析或PCR过程的 监测，进行PCR起始模板量的定 量。 ➢狭义的定量PCR技术是指用外 标法（荧光杂交探针保证特异性） 通过监测PCR过程（监测扩增效 率）达到精确定量起始模板数的 目的，同时以内对照有效排除假 阴性结果（扩增效率为零）。
Tm值由引物ATGC数决定每A、T计为2℃， G、C 计为4℃，时间一般为40秒到60秒 3）引物延伸温度与时间：
72℃最佳，30-100nt/s，也有用68 ℃如La Taq 4）循环数：25-35 cycles 之间，过多则非特异扩增 增加；平台效应。